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문제 정의
- 여러 연구에서 신경세포 외부에 고농도의 포타슘 이온을 처리하였을 때 전압 의존적 포타슘 이온통로의 포타슘이온 전도도가 떨어지고 신경세포내의 포타슘이온 농도 증가가 유발되어 신경세포의 탈분극을 유발하게 되고, 결국 내인성 글루탐산의 분비가 유도됨을 확인하였다7,8). 따라서 본 연구에서는 신경세포의 흥분독성을 유발한 후 신경세포의 생존율과 신경세포의 형태에 어떠한 영향을 미치는지를 확인하였다.
- 여러 연구에서 신경세포의 세포사멸과 생존에 NMDA 수용체가 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 따라서 이러한 내인성 글루탐산에 의해 활성화되는 NMDA 수용체를 차단하여 신경세포의 생존율에 어떠한 영향을 주는지 확인하였다. Figure 1에서 NMDA 수용체(APV)를 차단하였을 때 내인성 글루탐산에 의한 생존율 증가 효과를 막지 못했다 (Fig.
제안 방법
- 마지막으로 외인성 글루탐산 (5 μM, 24 hrs) 및 BAPTA-AM (5 μM, 24 hrs)을 처리하여 흥분독성을 유발하였다. 각각의 처리 후 이미지 촬영을 위해 hoechst 33342를 1 : 250의 농도로 세포 배양액에 3분간 처리하여 형광현미경 (IX-71, Olympus, Japan)을 사용하여 촬영하였다.
- 또한 최근의 연구에서 수상돌기의 구조와 신경세포의 연접구조의 형성과정에 미토콘드리아의 역할이 중요하다고 보고되었고, 이러한 미토콘드리아의 변화는 연접내 신호전달과정의 증가와 밀접한 관련이 있음이 보고되었다. 따라서 실제 신경세포의 수를 계상하여 약물 처리조건에 대한 생존율을 직접적으로 확인하였다.
- 마지막으로 외인성 글루탐산 (5 μM, 24 hrs) 및 BAPTA-AM (5 μM, 24 hrs)을 처리하여 흥분독성을 유발하였다.
- 본 실험에서는 흰쥐의 해마신경세포를 primary culture하여 실험하였다. 실험에 사용한 흰쥐는 12시간 간격으로 빛이 조절되고 온도 25±3℃, 습도 50±10%가 유지되는 실험 환경에서 사육하였으며, 임신 후 21일 된 배아를 사용하였다.
- 분리된 해마는 유리피펫을 사용하여 분쇄하였고, 해마가 눈에 보이지 않을 만큼 분쇄되면 hemocytometer를 이용하여 카운트 후 poly-L-lysine으로 코팅이 된 24 well tissue culture testplate에 well 당 4.5×104 개의 세포를 시딩하여 인큐베이터에 배양하였다.
- 실험에 사용하는 해마 신경세포는 배양 후 6~8일이 지난 후에 실험에 사용되었고, 실험 하루 전에 약물 처리를 하여 24시간 배양 후 실험하였다. 실험의 진행은 우선 흥분독성 유도 상황을 만들고, 신경세포의 생존율 (viability)을 MTT assay를통하여 확인하였다.
- 이후 외인성 글루탐산을 고농도로 처리하여 더욱 강력한 흥분독성 상황을 유도하고 신경세포의 생존율의 감소가 고농도로 처리한 KCl에 의해 차단되는지를 확인하였다. Figure 3과 같이 고농도 (50 μM, 100 μM)의 글루탐산을 처리한 결과 대조군에 비하여 신경세포의 생존율이 감소하였고 (Fig.
- 5×104 개의 세포를 시딩하여 인큐베이터에 배양하였다. 인큐베이터는 온도 37℃, CO2 5%로유지시켰고, culture cell은 하루 후 neurobasal medium으로 교체를 하고, 3~4일을 주기로 plate 내의 원래의 medium과새로운 neurobasal medium을 1 : 1 비율로 혼합하여 medium 을 갈아주었다. 실험에 사용된 동물은 제주대학교 동물윤리위회의 윤리규정을 준수하여 실험에 사용되었다.
- 흥분독성을 유발하기 위해 총 세 가지의 실험군을 설정하였다. 첫 번째는 고농도의 KCl (20 mM, 24 hrs)을 신경세포 외부에 처리하여 탈분극에 의한 내인성 글루탐산 분비를 유도하였고, 두 번째로 고농도의 칼슘이온(3.8 mM, 24 hrs)을 신경세포 외부에 처리하여 신경세포내로 유입되는 칼슘이온의 양을 증가시켜 신경세포내 칼슘이온의 농도를 증가시겼다. 마지막으로 외인성 글루탐산 (5 μM, 24 hrs) 및 BAPTA-AM (5 μM, 24 hrs)을 처리하여 흥분독성을 유발하였다.
- 흥분독성을 유발하는 처리를 한 다음날 tissue culture testplate에 well 당 200 μL의 neurobasal medium을 빼고 동량의 MTT assay solution을 2시간 동안 인큐베이터에서 처리한 후 모든 medium과 solution을 제거한 후 1 mL의 DMSO를 20분간 처리였다.
대상 데이터
- 인큐베이터는 온도 37℃, CO2 5%로유지시켰고, culture cell은 하루 후 neurobasal medium으로 교체를 하고, 3~4일을 주기로 plate 내의 원래의 medium과새로운 neurobasal medium을 1 : 1 비율로 혼합하여 medium 을 갈아주었다. 실험에 사용된 동물은 제주대학교 동물윤리위회의 윤리규정을 준수하여 실험에 사용되었다.
- 실험에 사용하는 해마 신경세포는 배양 후 6~8일이 지난 후에 실험에 사용되었고, 실험 하루 전에 약물 처리를 하여 24시간 배양 후 실험하였다. 실험의 진행은 우선 흥분독성 유도 상황을 만들고, 신경세포의 생존율 (viability)을 MTT assay를통하여 확인하였다.
- 실험에 사용한 흰쥐는 12시간 간격으로 빛이 조절되고 온도 25±3℃, 습도 50±10%가 유지되는 실험 환경에서 사육하였으며, 임신 후 21일 된 배아를 사용하였다.
데이터처리
- 실험을 통하여 얻어낸 결과는 student’s t-test를 이용하여 p<0.05 또는 p<0.01의 범위에서 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- The survival rate of hippocampal neurons was increased by high KCl application. Cell viability was measured by MTT assay. *p<0.
성능/효과
- Figure 3과 같이 고농도 (50 μM, 100 μM)의 글루탐산을 처리한 결과 대조군에 비하여 신경세포의 생존율이 감소하였고 (Fig. 3, 50μM Glutamate=88.60±9.33%, 100 μM Glutamate=83.78± 6.73%), KCl과 같이 처리한 결과 생존율감소가 억제되는 것을 확인하였다 (Fig. 3, 50 μM glutamate + KCl = 98.12± 1.58%, 100 μM glutamate + KCl= 99.70±6.47%).
- Microscopic view of fluorescence in hippocampal neurons stained by hoechest 33342. In this experiment, neuronal survival rates were not significantly affected by drugs such as glutamate or KCl, indicating that neuronal death is critically dependent on mitochondrial processings. Scale bar 50 μm.
- 이번 연구에서 고농도의 KCl을 처리하여 내인성 글루탐산 분비를 유도한 결과 신경세포의 생존율에는 영향을 주지 못하고, 미토콘드리아의 양적 증가를 일으킨다는 것을 확인하였다. MTT assay 결과에서 예상과는 달리 흥분독성을 유발하는 조건을 만들었을 때 신경세포의 생존율이 크게 변하지 않는 것을 확인하였다. 또한 내인성 글루탐산 분비를 유도하여 흥분독성을 유발한 경우 신경세포의 생존율이 늘어났다.
- 따라서 내인성 글루탐산의 분비 유도가 신경세포내의 GTPase의 활성화를 통하여 미토콘드리아의 증가와 기능향상을 유도했다고 볼 수 있으며, 이러한 변화가 수상 돌기의 구조 형성과 기능에 중요한 역할을 하게 될 것이다. 결론적으로 신경세포에서의 신경전달과정 증가는 세포 외부에 존재하는 글루탐산 수용체를 통하여 신경세포의 GTPase를 활성화시키고 미토콘드리아를 증가시키며, 이는 신경세포의 기능에 중요한 역할을 하게 된다.
- 또한 최근의 연구에서 흥분독성 유발을 위하여 글루탐산을 신경세포에 과하게 처리하였을 때 신경세포 내 칼슘이온의 농도가 급격하게 증가하고 이러한 이온의 증가가 세포사멸을 유발함을 확인하였다. 또한 NMDA 수용체를 선택적으로 차단하였을 때 신경세포사멸이 사라짐을 확인하였고, 세포 외부에 칼슘이온을 제거하거나 세포 내부에 칼슘이온을 차단하는 칼슘이온 제거제를 처리하였을 때도 신경세포사멸이 차단됨을 확인하였다. 이는 흥분독성을 유발하는 상황에서 이온투과성 글루탐산 수용체 중 NMDA 수용체의 활성화가 신경세포 내 칼슘이온의 비정상적인 증가를 유발하고 결국 신경세포사멸이 일어남을 의미한다.
- 또한 내인성 글루탐산 분비를 유도하여 흥분독성을 유발한 경우 신경세포의 생존율이 늘어났다. 또한 신경세포의 사멸을 유발한다고 알려진 NMDA 수용체를 차단하였을 때와 세포 내 칼슘이온 농도 증가를 막아주는 칼슘이온 킬레이터를 사용하였을 때 모두 이러한 변화가 사라지지 않음을 확인하였다. 이는 흥분독성을 유발하는 조건을 만들었을 때 나타나는 MTT assay 결과가 실제 신경세포의 생존율을 나타내지 못한다고 볼 수 있다.
- 이번 연구에서 고농도의 KCl을 처리하여 내인성 글루탐산 분비를 유도한 결과 신경세포의 생존율에는 영향을 주지 못하고, 미토콘드리아의 양적 증가를 일으킨다는 것을 확인하였다. MTT assay 결과에서 예상과는 달리 흥분독성을 유발하는 조건을 만들었을 때 신경세포의 생존율이 크게 변하지 않는 것을 확인하였다.
- 흥분독성유도 상황에서 신경세포의 생존율을 확인한 결과 Figure 1과 같이 대조군에 비해 KCl을 통한 내인성 글루탐산 분비 유도군에서 생존율이 증가 (Fig. 1, normal, KCl = 121.86±6.44%, p<0.05)함을 확인하였다.
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