[논문]제주 연안의 괭생이모자반(Sargassum horneri)에서 분리된 세균의 계통학적 다양성 및 군집 구조 분석

문경미; 박소현; 허문수

doi:10.5352/jls.2018.28.10.1179

제주 연안의 괭생이모자반(Sargassum horneri)에서 분리된 세균의 계통학적 다양성 및 군집 구조 분석
Phylogenetic Diversity and Community Structure of Microbiome Isolated from Sargassum Horneri off the Jeju Island Coast 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.28 no.10 = no.222, 2018년, pp.1179 - 1185

문경미 (제주대학교 해양생명과학과) , 박소현 (제주대학교 해양생명과학과) , 허문수 (제주대학교 해양생명과학과)

초록
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최근 괭생이모자반(Sargassum horneri)은 제주의 해안가와 해변, 연근해 양식장 등 매년 대량으로 속출되어 인근 양식업자 및 주민에게 막대한 피해를 주고 있는 추세이다. 본 연구에서는 제주 인근 연안으로 흘러 들어온 괭생이 모자반에 서식하고 있는 미생물의 다양성을 탐색하고 동정을 통한 미생물의 기능을 파악함으로써 생태학적 문제에 관한 기초자료를 제공하고자 하였다. Proteobacteria는 분리 된 균주 중 88%를 차지한 우점문으로 ${\alpha}-proteobacteria$강은 6속 10종으로 Pseudorhodobacter속이 40%를 차지하고 Paracoccus속 20%, Rhizobium, Albirhodobacter, Skermanella 및 Novosphingobium 속은 각각 10%를 차지했다. ${\beta}-proteobactera$강은 5속 10종으로 Hydrogenophaga속이 50%, Azoarcus 20%, 나머지 Oxalicibacterium, Duganella, Xenophilus속은 각각 10%를 차지했다. ${\gamma}-proteobacteria$강은 13속 57종으로 Proteobacteria문에서 74%로 우점강을 차지했고, Shewanella는 23%, Pseudomonas속 12%, Cobetia 19%, Rahnella, Vibrio 및 Serratia속은 4%, 나머지 Rheinheimera, Raoultella, Pantoea, Acinetobacter, Moraxella 및 Psychrobacter속은 2%를 차지했다. Actinobacteria는 1속 2종으로 Gordonia와 Nocardioides속이 각각 50%를 나타냈다. Bacteroidetes문은 3속 5종으로 Lacihabitans, Mariniflexile속은 33%, 나머지 Dyadobacter, Cellulophaga와 Ferruginibacter속은 11%를 차지했다.

Abstract ▼ AI-Helper

Recently, Sargassum horneri, the marine weed inhabiting the shoreline, beach, and littoral sea area, has caused serious damage to intensive aquaculture farms particularly those around Jeju Island, South Korea. The purpose of this study was to investigate the diversity of microorganisms in Sargassum horneri and to provide basic data on ecological problems by identifying microbial functions. A total of 88 isolates were identified by 16S rRNA sequencing. Proteobacteria was the dominant phylum accounting for 88%, including class ${\alpha}-proteobacteria$, six genera, and ten species. The dominating genus, Pseudobacter, accounted for 40% in Pseudorhodobacter, 20% in Paracoccus, and the remaining at 10% each were Rhizobium, Albirhodobacter, Skermanella, and Novosphingobium. Class ${\beta}-proteobactera$ included five genera and ten species. Genus Hydrogenophaga accounted for 50%, while genus Azoarcus accounted for 20%, and the remaining Oxalicibacterium, Duganella, and Xenophilus were 10% each. Class ${\gamma}-proteobacteria$ with 13 genera and 57 species, accounted for 74% in phylum Proteobacteria, 23% in Shewanella, 19% in Cobetia, 12% in Pseudomonas, 4% each in Vibrio and Serratia, and 2% each in Rheinheimera, Raoultella, Pantoea, Acinetobacter, Moraxella, and Psychrobacter genera. In addition, Actinobacteria with two species of Nocardioides genera accounted for 50%, and Bacteroidetes accounted for 33%, with three genera and five species that included Lacihabitans and Mariniflexile. The remaining Dyadobacter, Cellulophaga, and Ferruginibacter genera each accounted for 11%.

주제어

표/그림 (4)

표 Table 1. List of isolated strains used for antibacterial assay
표 Table 2. Classification of microbial isolates originated from Sargassum horneri
그림 Fig. 1. Neighbour-joining phylogenetic tree determined from the 16S rDNA sequences of bacteria from the Sargassum horneri. GenBank accession numbers given in parentheses. Boostrap values (>50%) based on 1,000 replications are shown.
그림 Fig. 2. Pie-diagram showing various genus of bacterial isolated from Sargassum horneri.

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 제주 연안에 대량 출현된 괭생이모자반에 서식하고 있는 미생물을 분리하고 동정하였다. 그리고 어류질 병세균과 인체유해세균에 대한 항균 활성을 탐색하고자 하였다. 이러한 연구는 제주 연안에 재발생 우려가 큰 괭생이모자반의 유입에 따른 생태학적 기초자료로 활용되는데 도움될 것이라 사료된다.
본 연구에서는 제주 연안에 대량 출현된 괭생이모자반에 서식하고 있는 미생물을 분리하고 동정하였다. 그리고 어류질 병세균과 인체유해세균에 대한 항균 활성을 탐색하고자 하였다.

제안 방법

그리고 PCR product의 염기서열을 분석하기 위해 (주)솔젠트(Daejeon, Korea)에 의뢰하여 결과를 얻었다. 염기서열은 EzTaxone (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)과 NCBI를 이용하여 표준균주와의 상동성을 조사하였다. ClustalX로 multiple alignment를 수행한 뒤, MEGA 6.
여과 된 상등액과 현탁 된 균체는 멸균 된 8 mm paper disc (ADVANTEC, Japan)에 50, 100 μl씩 각각 분주하여 25℃에서 24시간 동안 건조시켰다. 유해균들은 MacFarland turbidity 0.4로 조절한 뒤 Muller Hinton Agar (MHA, Difco, USA)에 도말 하여 배양 온도에 따라 각각 48시간 동안 형성된 억제환을 측정하였다.

대상 데이터

본 실험에 사용 된 괭생이모자반은 2017년 5월 9일 제주도 제주시 인근 연안(GPS정보; 33.497293, 126.450918)에서 채집하여 아이스박스에 담아 -4℃를 유지 시키며 운송 시킨 후 실험에 사용하기 전까지 -80℃에서 보관하였다.
항균 활성 탐색을 위해 사용된 어류 및 인체 유해 세균은 미생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC) 와 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에서 분양 받은 것을 사용하였고(Table 1), -80℃에서 보관 되었던 균주를 재활성화시켜 사용하였다. 각각의 유해세균은 적절한 배지에서 배양되었고(Table 2), 항균 탐색을 위해 괭생이모자반에서 분리 된 균주는 R2A와 1% R2A, MA에 접종 시켜 25℃에서 48시간 동안 배양하였다.

데이터처리

net/)과 NCBI를 이용하여 표준균주와의 상동성을 조사하였다. ClustalX로 multiple alignment를 수행한 뒤, MEGA 6.0로 계통도 (phylogenetic tree)를 작성하였다.

성능/효과

16S ribosomal RNA PCR로 증폭 된 88종은 EZBiocloud의 Identify을 통해 3문(Phylum) 8강(Class) 16목(Order) 22과 (Family) 31속(Genus)으로 분석되었으며(Table 2), 계통수는 Fig. 1에서 보는 바와 같다.
Proteobacteria문 alpha-proteobacteria강은 97-99%의 상동성을 나타냈고 6속 10종으로 Pseudorhodobacter속이 40%를 차지했다. 이 속은 그람 음성균으로 세균 엽록소(Bacteriochlorophyll)가 존재하지 않고 non-photosynthetic으로 알려져 있다[30].
beta-proteobacteria강은 97-98%의 상동성을 나타냈고 5속 10종으로 Hydrogenophaga속이 50%, Azoarcus속 20%, 나머지 Oxalicibacterium, Duganella, Xenophilus속은 각각 10%를 차지했다. Hydrogenophaga속은 폐수[4, 34]나 섬유 하수 처리장[8], 쓰레기[42] 등과 같은 오염된 곳에서 쉽게 분리되고 질산염을 질소로 탈질화 시켜준다고 알려져 있다[19].
gamma-proteobacteria강의 상동성은 98-100%였고 13속 57 종으로 Proteobacteria문에서 74%로 우점강에 속한다. Shewanella는 23%를 차지한 속으로 저온에서 보관 된 해산물에서 쉽게 찾아볼 수 있고 H₂S를 생성하는 균주로 알려져 있다[32].
괭생이모자반의 균주 다양성 확인을 위해 평판배지에서 colony를 순수 분리하여 배양한 결과, R2A는 5.8×10^-3 CFU/ g, 1% R2A에서는 4.1×10^-4, 3.0×10^-3 CFU/g, MA는 5.6×10^-4 CFU/g로 계수 됐다. 각각의 배지에 따른 세균 수는 큰 차이를 나타내지 않았으나, 1% R2A와 MA에 비해 R2A에서 여러 속 (Genus)을 관찰할 수 있었다.
Proteobacteria는 괭생이모자반에서 분리 된 균주 중 88%를 차지한 우점문으로 16S와 23S ribosomal RNA의 특이적 부위에 따라 alpha-, gamma-, beta-subclasses로 나뉘는데[22], 본 연구에서 alpha-proteobacteria강과 beta-proteobacteria강은 각각 10%, gamma-proteobacteria강은 65%로 우세하게 나타났다. 다음 Bacteroidetes문은 10%를 차지했고, 그 중 Cytophagia강, Flavobacteria강이 각각 4%, Actinobacteria강 2%, Sphingobacteriia강이 1%로 나타났다.
이처럼 괭생이모자반에 서식하고 있는 미생물은 주로 식물이나 해수 또는 담수 심지어 오염된 지역에서도 분리되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 이 중 분리된 몇몇 균주는 환경적으로 문젯거리가 되고 있는 부분에 관한 연구가 진행되고 있었다.

후속연구

Hydrogenophaga속은 폐수[4, 34]나 섬유 하수 처리장[8], 쓰레기[42] 등과 같은 오염된 곳에서 쉽게 분리되고 질산염을 질소로 탈질화 시켜준다고 알려져 있다[19]. 그리고 식물 근권 세균으로 알려진 Azoarcus속은 생태계의 식물 성장을 억제할 수 있는 질소를 감소시키고 알코올 탈수소 효소를 조절한다고 알려져 있으며[11, 17], 괭생이모자반에서 분리된 Azoarcus속은 Azoarcus communis (AF011343) 종과 97%의 상동성을 지녀 추가 신종 실험이 필요한다 여겨진다.
본 연구에서 분리된 균주는 질병 제어나 예방을 위한 이용가치가 없었지만 추후 추가 연구를 통한 유용미생물로서의 이용가치는 무궁무진하다 사료된다.
그리고 어류질 병세균과 인체유해세균에 대한 항균 활성을 탐색하고자 하였다. 이러한 연구는 제주 연안에 재발생 우려가 큰 괭생이모자반의 유입에 따른 생태학적 기초자료로 활용되는데 도움될 것이라 사료된다.
Rhizobium속은 식물 뿌리에 부착 되는 세균으로 식물 성장 및 molecular mechanism에 관여하며 농업에선 중요 세균으로 인식되고 있다[6]. Albirhodobacter속은 해안가에서 주로 분리 되며[24], 전세계적으로 문제되고 있는 해조류 증식을 억제되는 것을 방지할 수 있다고 알려져 있어 [18] 추가 연구를 통해 현재 대량으로 발생되고 있는 유조 현상을 막는데 도움이 될 것이라 사료된다.

저자의 다른 논문 :

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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