[논문]건칠(乾漆)을 이용한 K562 만성 골수성 백혈병 세포주에서의 MicroRNA 발현 규명

최현숙

doi:10.6116/kjh.2019.34.6.71.

건칠(乾漆)을 이용한 K562 만성 골수성 백혈병 세포주에서의 MicroRNA 발현 규명
MicroRNA Expression in Leukemia Cell Line(K562 cell) Using Rhus Verniciflua Stokes 원문보기

大韓本草學會誌 = The Korea journal of herbology, v.34 no.6, 2019년, pp.71 - 78

최현숙 (경동대학교 간호학과)

Abstract ▼ AI-Helper

Objective : The purpose of the study was to identify expression profiling of miRNAs associated with cancers after treating allergen-removed Rhus Verniciflua Stokes and allergen-removed Rhus Verniciflua Stokes fumigaed Angelica gigas on leukemia cell lines. Methods : miRNA expression has been analyzed using miRNA array method through denaturation and hybridization after isolating the total RNA from leukemic cell line treated with 100 ㎍/㎖ of aRVS and aRVS-A each. Microarray expressions were interpreted as 'significant' on miRNAs when decreased less than 0.5 fold or increased more than 1.5 fold compared with the control group. Results : Among 158 miRNAs in total, 32 miRNAs were significantly presented in miRNAs expression. miRNA has been activated with a variety of genes for predicted targets, and the overexpressed miRNAs were categorized according to proliferation and metastasis of cancer in this study. The findings were reported that seven miRNAs (let-7b, miR-193a-5p, 296-3p, 26a, 22, 124a, 92b) showed significant expressions on proliferation and growth, seven miRNAs (miR-193a-5p, 26a, 200c, 183, 124a, 198, 210) presented meaningful expressions on invasion and metastasis, two miRNAs (let-7b, miR-210) were highly expressed on angiogenesis, five miRNAs (let-7b, miR-26a, 181d, 181c, 296-5p) related with apoptosis, and six miRNAs (let-7b, miR-200c, 183, 370, 124a, 191) were associated with prognosis of cancer and early diagnostic factors for cancer. Conclusion : The mechanism of miRNA takes a role in diagnosis, treatment, and prognotic factors for cancer as well. This study suggested that further detailed research on overexpression of specific miRNA should be carried out continuously in the future.

주제어

표/그림 (4)

표 Table 1. The expression of miRNA and normlized ratio.
표 Table 2. The function of miRNAs and their predicted targets.
그림 Fig 1. Expression ratio of miRNA on K562 leukemia cells.
표 Table 3. Classification according to the mechanism associated with cancer

AI 본문요약
AI-Helper

* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.

문제 정의

그러므로 본 연구에서는 K562 백혈병 세포주에 한방에서 백혈병 치료에 사용되고 있는 알러젠(Urushiol)이 제거된 옻나무 추출물(allergen-removed Rhus Verniciflua Stokes, aRVS)과 알러젠이 제거된 옻나무 추출물로 훈증 처리한 당귀(allergen-removed Rhus Verniciflua Stokes fumigated Angelica gigas, aRVS-A)를 처리한 후 암과 관련된 miRNAs 유전자 발현 레벨을 규명하고자 하였다.

제안 방법

본 연구는 K562 백혈병 세포주에 임상에서 사용되는 aRVS 와 aRVS-A를 처리한 후 miRNA array법을 이용하여 miRNA 의 발현 양상과 변화를 분석한 연구를 통해 다음과 같은 결과를 얻었다.
칩의 형광 분석을 위하여 GenePix4000B(Axon, USA)를 사용하였으며, 레이저 파워 100%, PMT gain 700으로 설정하여 Cy3형광 파장인 532 ㎚ 파장에서 스캔하였다. 스캔 후 생성된 GenePix Results(GPR) 파일을 사용하여 miRNA 발현 패턴을 분석하였다. 각 시료의 신호값을 Internal control RNU6B의 신호값으로 샘플간 신호를 표준화하였으며, 대조군 (‘C’)의 샘플값을 기준으로 각각의 실험군 샘플에 대해서 발현 패턴 비율을 산출하여 분석하였다.

대상 데이터

만성 골수성 백혈병 세포주(K562 cell)는 American Type Culture Collection(ATCC Rockvelle, MD)에서 구입하여 10 % fetal bovine serum(FBS, Gibco, BRL, Island, NY, USA)과 1 % 항생제(100 units/ml의 penicillin, 100 ㎎/㎖의 streptomycin)가 포함된 RPMI-1640 배양액에 37℃, 5% CO₂항온배양기에서 계대 배양하였다. 배양된 세포주에 각각의 약물을 100 ㎍/㎖씩, 24시간 처리하였고 약제를 처리하지 않고 같은 시간 방치한 군을 대조군으로 사용하였다.
본 실험에서 사용한 옻은 경기도 가평산 참옻나무를 원료로 건조 후 사용하였고, 대한민국 특허 제0394089호 / 제0504160호를 이용한 방법에 의하여 열수를 이용하여 aRVS를 만들었으며 압력 1 atm 이하, 온도 90-95℃, 용매의 부피 10배수, 시간 6시간 이상, 원료의 성상은 톱밥, 사용 용매는 물을 이용하여 알러젠(Urushiol)이 제거된 옻나무 약제를 추출하였다¹⁶⁾.

데이터처리

스캔 후 생성된 GenePix Results(GPR) 파일을 사용하여 miRNA 발현 패턴을 분석하였다. 각 시료의 신호값을 Internal control RNU6B의 신호값으로 샘플간 신호를 표준화하였으며, 대조군 (‘C’)의 샘플값을 기준으로 각각의 실험군 샘플에 대해서 발현 패턴 비율을 산출하여 분석하였다. 발현 레벨은 1.

이론/모형

miRNA 발현 분석을 위해 PANArray TM miRNA expression profiling kit(PANAGENE, KOREA)를 사용하였다.

성능/효과

1. K562 백혈병 세포주에서 의미있는 발현을 보인 miRNA는 let-7b, miRNA-193a-5p, miRNA-296-9p 등 32개이며 aRVS와 aRVS-A의 과발현 정도는 비슷하게 나타났다.
2. aRVS 군과 aRVS-A군 모두에서 과별현된 miRNA는 11개이며, aRVS 처치군에서만 과발현된 miRNA는 miRNA-198, miRNA-181c, miRNA-124a로 3개였고, aRVS-A 처치군에서만 과발현된 miRNA는 miRNA-210, miRNA-92b, miRNA-452, miRNA-191로 4개였다.
3. 이들의 기능을 조사하여 암과 관련된 기전으로 분류하면, 암의 증식 및 성장에 관련된 miRNA는 7개(let-7b, miRNA-193a-5p, 296-3p, 26a, 22, 124a, 92b), 침습 및 전이와 관련된 miRNA는 7개(miRNA-193a-5p, 26a, 200c, 183, 124a, 198, 210), 신생혈관 생성과 관련된 miRNA는 2개(let-7b, miRNA-210), 세포자 연사과 관련된 miRNA는 5개(let-7b, miRNA-26a, 181d, 181c, 296-5p), 마지막으로 진단 및 예후인자 로서의 miRNA는 6개(let-7b, miRNA-200c, 183, 370, 124a, 191)로 조사되었다.
miRNA-296-3p는 하향조절 유전자(down-regulated oncogene)로서 EAG1를 표적으로 종양의 증식을 조절하는 중요한 유전자로 교모세포종(Glioblastoma)에서 EAG1의 발현을 조절하여 세포침습능력 및 증식억제의 역할이 있다고 보고되었다¹⁷⁾. K562 백혈병 세포주에서도 종양의 증식 및 성장을 억제하는 miRNA로 과발현됨으로써 세포증식을 억제하는 것으로 나타났다.
aRVS-A를 처치한 K562 백혈병 세포주에서 0.5배 이하로 낮은 발현은 없었으며 15개의 miRNA 발현이 1.5배 이상으로 높은 발현 레벨을 보였다. 과발현 정도의 범위는 1.
aRVS와 aRVS-A는 K562 백혈병 세포주에서 miRNA의 발현 양상이 종양의 성장과 증식, 전이, 자연세포사와 관련된 miRNA에서 많은 발현을 보였으며, 신생혈관생성과 관련된 기전에도 작용하는 것으로 보였다. aRVS의 경우 암과 관련된 많은 기전에 대한 연구가 많았으나 당귀(Angelica gigas)의 경우 아직까지 단독으로 밝혀진 기전이 없어 향후 암과 관련된 기전연구가 필요할 것이며, 본 연구의 결과가 기본 데이터를 제공할 수 있을 것으로 생각된다.
본 연구의 결과 특징적인 miRNA에 대해서 살펴보면, miRNA-296-3p는 aRVS과 aRVS-A 처치군에서 과발현 되었다. miRNA-296-3p는 하향조절 유전자(down-regulated oncogene)로서 EAG1를 표적으로 종양의 증식을 조절하는 중요한 유전자로 교모세포종(Glioblastoma)에서 EAG1의 발현을 조절하여 세포침습능력 및 증식억제의 역할이 있다고 보고되었다¹⁷⁾.
알러젠(Urushiol)이 제거된 옻나무 추출물(allergenremoved Rhus Verniciflua Stokes, aRVS)는 다양한 암 치료 기전이 전 임상연구를 통해 밝혀졌으며^8-11) 유전자 발현을 조절 하는 miRNA는 다양한 유전자를 예측하는 인자로 작용하는데, 본 실험에서 암세포의 증식 및 성장, 암세포의 침습 및 전이, 신생혈관 생성, 세포자연사, 암의 예후 및 조기 진단인자로서 miRNAs가 관련이 있는 것으로 나타났다.

후속연구

aRVS와 aRVS-A는 K562 백혈병 세포주에서 miRNA의 발현 양상이 종양의 성장과 증식, 전이, 자연세포사와 관련된 miRNA에서 많은 발현을 보였으며, 신생혈관생성과 관련된 기전에도 작용하는 것으로 보였다. aRVS의 경우 암과 관련된 많은 기전에 대한 연구가 많았으나 당귀(Angelica gigas)의 경우 아직까지 단독으로 밝혀진 기전이 없어 향후 암과 관련된 기전연구가 필요할 것이며, 본 연구의 결과가 기본 데이터를 제공할 수 있을 것으로 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	알러젠(Urushiol)의 효능은?	이러한 어혈과 적취치료제로 옻나무를 사용하였는데 옻나무를 가공한 한약을 ‘건칠(乾漆)’이라 한다4). 최근 옻에서 알러지 반응을 일으키는 알러젠(Urushiol)을 제거하여 암환자들에게 투여함으로써 종양축소 효과 및 백혈병 환자에서 생존률 연장 등의 보고가 있었다5). 또한 당귀는 보혈(補血)하는 대표 약제로서 보혈활혈(補血活血)의 효능을 가지고 있다.
	옻나무에서 알레젠을 제거한 옻나무 추출물(allergen-removed Rhus Verniciflua Stokes, aRVS)은 인체에 어떤 영향을 미치는가?	건칠로 훈증한 당귀는 당귀가 어혈을부드럽게 풀어서 흐르게 하는 활혈(活血) 역할을 하고, 건칠은좀 더 강한 작용으로 어혈이 뭉쳐 덩어리진 적취를 파어(破瘀)하는 역할을 하게 된다6). 알러젠(Urushiol)이 제거된 옻나무 추출물(allergen-removed Rhus Verniciflua Stokes, aRVS)의 종양치료에 응용되는 측면에서의 전 임상연구결과 항산화작용7) , iNOS, Cox-2, TNF-α의 발현억제를 통한 항염증작용8) , 돌연변이억제9), 암세포증식억제 및 암세포에 대한 세포자멸사(Apoptosis) 유도작용10), 혈관형성 억제효과를11) 통한 암치료 기전 등이 알려져 있다.
	건칠(乾漆)이란?	이러한 어혈과 적취치료제로 옻나무를 사용하였는데 옻나무를 가공한 한약을 ‘건칠(乾漆)’이라 한다4). 최근 옻에서 알러지 반응을 일으키는 알러젠(Urushiol)을 제거하여 암환자들에게 투여함으로써 종양축소 효과 및 백혈병 환자에서 생존률 연장 등의 보고가 있었다5).

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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