[논문]건칠(乾漆) 열수 추출물이 근원세포의 근분화에 미치는 영향

이상수; 김은미; 조남준; 한효상; 김기광

doi:10.6116/kjh.2020.35.3.9.

건칠(乾漆) 열수 추출물이 근원세포의 근분화에 미치는 영향
Investigation of the effect of Lacca Sinica Exsiccata water extract on myoblast differentiation 원문보기

大韓本草學會誌 = The Korea journal of herbology, v.35 no.3, 2020년, pp.9 - 16

이상수 (충남대학교 생화학과) , 김은미 (안전성평가연구소 예측독성연구본부) , 조남준 (충남대학교 생화학과) , 한효상 (중부대학교 보건행정학과) , 김기광 (충남대학교 생화학과)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : Sarcopenia is a disease that leads to a decrease in skeletal muscle, and the importance of prevention and treatment thereof is increasing in an aging society. However, there is a definite limitation of exercise therapy for sarcopenia, and thus, there is an urgent need for a pharmacologic research to the treatment of sarcopenia. Methods : 2,2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid (ABTS) assay was performed to confirm the antioxidant efficacy of water extract of Lacca Sinica Exsiccata (WELSE). To determine the effect of WELSE on myoblast activity, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) assay was performed. To confirm the effect of WELSE on the differentiation of myoblast into myotubes, protein expression levels of myosin heavy chain 3 (Myh3) and paired box 3/7 (pax3/7) were confirmed by immunoblot analysis. In addition, immunofluorescence microscopy was performed to confirm the effect on myotube formation of WELSE. Results : It was confirmed that WELSE had high antioxidant activity and showed no cytotoxicity to myoblast up to 200 ㎍/㎖ concentration. Myoblast was treated with WELSE at a concentration of 100 ㎍/㎖ and differentiated for 5 days. The expression of Myh3, which forms myotubes, was promoted and the morphology of myotubes was changed and Increasing the thickness. Conclusions : In this paper, we confirmed the excellent antioxidant efficacy of WELSE and positive effects on muscle differentiation and myotube formation. These results suggest valuable as a material for pharmaceutical research on the prevention and treatment of sarcopenia.

주제어

표/그림 (4)

그림 Fig. 1. ABTS radical scavenging activity of resveratrol and WELSE.
그림 Fig. 2. Effect of WELSE on cell viability.
그림 Fig. 3. Effect of WELSE on the differentiation of myoblasts.
그림 Fig. 4. Effect of WELSE on myotube formation of myoblasts.

AI 본문요약
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문제 정의

이러한 근감소증은 그 치료 및 예방방안에 관하여 연구가 활발히 진행되고 있다. 본 연구 역시 근감소증의 치료 및 예방을 목적으로 진행하였으며, 이를 위해 乾漆 열수 추출물이 근분화에 미치는 영향을 확인하기 위하여 실험을 진행하였다.
이 전 실험을 통하여 WELSE가 근원세포에 미치는 영향을 확인하였다. 이를 기반으로 근원세포의 근분화에 미치는 영향을 확인하기 위한 실험을 진행하였다. 근원세포를 differentiation medium에서 48 시간 동안 배양하여 분화를 유도했으며, 이 과정 각각의 근원세포에 WELSE를 12.
이에 본 연구는 건칠 열수 추출물 (water extract of Lacca Sinica Exsiccata, WELSE)의 근아세포의 근분화에 있어서의 긍정적 영향을 근분화 관련 단백질의 발현 수준 및 근관의 형성을 통하여 유의한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.

제안 방법

WELSE가 근원세포의 세포 활성도에 미치는 영향을 알아 보기 위하여 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3- carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetraz olium, inner salt (MTS) assay를 수행하였다. 96-well plat에 C2C12 세포를 3,000 cells/well로 분주한 뒤 24 h 동안 배양해 각 well에 약재를 농도 별로 처리한 뒤 다시 24 h 동안 배양해 주었다.
WELSE가 농도 의존적으로 근원세포의 근분화를 유도하는 것을 근분화 단백질 Myh3의 발현을 근거로 확인하였다. Myh3는 근관세포를 구성하는 단백질임을 고려하여 WELSE를 처리한 근원세포에서 근관세포의 형성이 촉진되는지 관찰해 WELSE의 효능에 대한 신빙성을 확보하였다.
WELSE의 항산화 효능을 확인하기 위해 ABTS assay를 수행하였으며, 항산화 효능이 입증된 resveratrol을 양성대조 군으로 설정해 실험의 신뢰성을 확보하였다. Resveratrol의 농도가 두 배씩 증가함에 따라 항산화 효능이 증가하여 100 μM에서 95.
근원세포의 분화 유도하는데 있어 적절한 WELSE 처리 조건을 설정하기 위해 MTS assay를 통해 WELSE의 세포독성을 확인하였다. 그 결과 200 ㎍/㎖ 농도에서 세포 생존율이 80.5 ± 3.68%로 WELSE가 근원세포의 세포 활성에 유의미한 영향을 주지 않았지만, 24 시간 동안 반응시킨 MTS assay와 달리 근분화는 48 시간 동안 유도하는 것을 고려해 100 ㎍/㎖을 최대 농도로 하여 실험을 진행하였다.
이를 기반으로 근원세포의 근분화에 미치는 영향을 확인하기 위한 실험을 진행하였다. 근원세포를 differentiation medium에서 48 시간 동안 배양하여 분화를 유도했으며, 이 과정 각각의 근원세포에 WELSE를 12.5 ㎍/㎖에서 100 ㎍/ ㎖까지 농도별로 처리한 후 면역 블롯을 통해 단백질 발현량을 분석하였다. 분화된 근원세포는 근관세포를 형성하는 과정에서 세포의 형태와 발현되는 단백질이 변화하여 면역 블롯을 통해 근분화 지표 단백질의 발현량을 확인하여 근원세포의 분화를 평가하였다.
근원세포에 WELSE을 처리해 근분화를 유도하기 이전에 다양한 농도의 WELSE를 처리한 근원세포의 생존율을 확인 하기 위해 MTS assay를 진행하였다. 근원세포에 radical 소거능이 확인된 농도인 12.
근원세포에 WELSE을 처리해 근분화를 유도하기 이전에 다양한 농도의 WELSE를 처리한 근원세포의 생존율을 확인 하기 위해 MTS assay를 진행하였다. 근원세포에 radical 소거능이 확인된 농도인 12.5 ㎍/㎖부터 200 ㎍/㎖까지 농도를 설정해 24 시간 동안 처리해 시료를 처리하지 않은 세포를 대조군으로 하여 비교해 세포독성을 확인하였다. 또한 그 이상의 농도는 WELSE가 medium에서 차지하는 비중이 과다하게 커 그 자체로 삼투압 등의 기작을 통하여 세포의 생존에 악영향을 줄 수 있다고 판단하여 진행하지 않았다.
근원세포의 근분화에 WELSE가 어떠한 형태로 영향을 주는지 확인하기 위해 WELSE를 처리한 differentiation medium에서 48 시간동안 분화를 유도하여, 근분화 단백질의 발현을 확인하였다. 이때 근분화 지표 단백질로 분화될수록 그 발현량이 가장 극적으로 변화하는 Myh3와 pax3/7으로 설정하여 분화 여부를 유추하는 기준으로 설정하였다.
근원세포의 분화 유도하는데 있어 적절한 WELSE 처리 조건을 설정하기 위해 MTS assay를 통해 WELSE의 세포독성을 확인하였다. 그 결과 200 ㎍/㎖ 농도에서 세포 생존율이 80.
해당 결과를 통하여 200 ㎍/㎖에서의 세포의 80% 이상이 생존할수 있는 것이 확인되어, WELSE가 세포 활성에 영향을 주지 않음을 확인하였다. 다만, 차후 근분화를 유도하는 실험에서 일반적인 Growth medium과 조성이 다른 differentiation medium에 48 시간 동안 처리하는 것을 고려할 때 200 ㎍/ ㎖은 추가적인 실험을 진행하기에 적합한 농도가 아니라 판단하여 최대 농도를 100 ㎍/㎖로 설정하고 추가적인 실험을 진행하였다.
본 연구는 이상의 실험 결과를 통하여 근원세포 (myoblast)에 항상화 효능과 세포독성을 확인한 乾漆 열수 추출물 (water extract of Lacca Sinica Exsiccata, WELSE)를 처리한 상태로 분화를 유도하여, 근원세포의 근분화 단백질 발현과 근관세포 (myotube)의 형성 양상을 확인하였으며, 이를 통해 다음과 같은 결론을 얻었다.
따라서이러한 urushiol은 함량이 작은 부위를 사용하거나, 건조를 포함한 여러 방법을 통하여 제거하는 등 차후 연구 및 실제 약품을 개발과정에서 배제할 필요가 있다. 본 연구에서도 urushiol이 물에서 용해도가 낮은 점을 고려해 완전히 건조된 乾漆 열수 추출물을 제조하여 실험을 진행하였다³⁰⁾ .
5 ㎍/㎖에서 100 ㎍/ ㎖까지 농도별로 처리한 후 면역 블롯을 통해 단백질 발현량을 분석하였다. 분화된 근원세포는 근관세포를 형성하는 과정에서 세포의 형태와 발현되는 단백질이 변화하여 면역 블롯을 통해 근분화 지표 단백질의 발현량을 확인하여 근원세포의 분화를 평가하였다. 근분화를 평가하기 위한 근분화 지표 단백질로 Myh3와 Pax3/7을 설정하였으며, 각각 Myh3는 분화되어 근관세포를 형성할수록 발현량이 증가하고 Pax3/7은 분화될수록 발현량이 빠르게 감소한다.
형성된 근관세포는 면역 형광 분석을 통하여 관찰하였으며, Myh3 단백질의 분포를 기준으로 근관세포의 두께를 판단하였다. 이전 실험과 동일하게 differentiation medium에서 48 시간 동안 배양해 분화를 유도했으며, 각각의 근원세포에 WELSE를 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖로 처리해 근관세포의 두께를 비교하였다. 그 결과, 근원세포에서 발현된 Myh3의 분포가 긴 대롱 형태를 이루었으며, 세포핵 역시 밀집한 것을 확인하였다.

대상 데이터

실험에 사용된 乾漆은 한약 제약 회사 (Jeong-Seong Drugstore, Korea)로부터 2018년 8월에 구매 (NO:2018-0815)하여 기원의 진위와 품질의 우열을 가천대학교 한의과 대학 본초학교실에서 감정하였고, 약재는 ultrasonic cleaner를 이용하여 불순물을 제거하고 실험에 사용하였다.
실험에 사용한 근원세포는 생후 3일 된 C57BL/6의 뒷다리 골격근에서 분리하여 배양해 사용하였다. 골격과 지방이 제거된 골격근을 DPBS (Corning, USA)에 세척한 뒤, 칼로 잘게 다져 1.

데이터처리

대조군에 관한 실험군의 유의성은 Student’s t-test를 이용 하여 p < 0.05 일 때 유의한 것으로 판단하였다.

이론/모형

WELSE의 항산화능은 2,2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid (ABTS) assay를 이용하여 측정하였다. Potassium persulfate (sigma, USA) 2.

성능/효과

1. WELSE의 항산화 효능을 ABTS assay를 통해 확인하였으며, rasveratrol을 대조군으로 하여 비교하였을 때 농도 의존적인 항산화 효능이 확인되었다.
2. WELSE를 근원세포에 48 시간 동안 처리 및 분화시켜 근분화 지표 단백질의 발현에 미치는 영향을 확인한 결과, WELSE 처리로 근분화 지표 단백질 중 pax3/7의 분해가 촉진되었으며 Myh3의 발현이 촉진되어, WELSE가 근분화 촉진에 효능이 있음을 확인하였다.
3. WELSE를 근원세포에 처리하여 48 시간동안 분화를 유도해 Myh3의 발현과 세포 융합을 통한 근관세포의 형성이 촉진됨을 확인하였으며 이러한 경향성이 WELSE 의 농도 의존적으로 이루어짐을 확인하였다.
근분화를 평가하기 위한 근분화 지표 단백질로 Myh3와 Pax3/7을 설정하였으며, 각각 Myh3는 분화되어 근관세포를 형성할수록 발현량이 증가하고 Pax3/7은 분화될수록 발현량이 빠르게 감소한다. WELSE를 처리한 근원세포에서 대조군과 비교해 근분화 단백질이 극적으로 변화하여 Myh3의 발현량이 증가하며, Pax3/7의 발현량이 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 3A).
또한 그 이상의 농도는 WELSE가 medium에서 차지하는 비중이 과다하게 커 그 자체로 삼투압 등의 기작을 통하여 세포의 생존에 악영향을 줄 수 있다고 판단하여 진행하지 않았다. 그 결과, 가장 높은 농도인 200 ㎍/㎖에서 근원세포의 생존율이 80.5 ± 3.68%로 나타났으며, 이후 100 ㎍/㎖에서 86.0 ± 3.68%, 50 ㎍/㎖에서 97.5 ± 2.63%, 25 ㎍/㎖에서 102.1 ± 4.96%, 12.5 ㎍/㎖에서 104.4 ± 2.77%로 나타났다(Fig. 2).
따라서 근분화를 유도하기 이전에 WELSE 항산화 효능을 ABTS assay를 통하여 우선적으로 확인하여, WELSE의 항산화 효능이 잘 알려진 양성대조군인 resveratrol과 비교하였을 때, 2 ㎍/㎖에서 200 ㎍/㎖ 농도에서 농도 의존적임을 확인하였다.
3A). 이 중 WELSE 100 ㎍/㎖를 처리한 근원세포에서 Myh3의 발현량이 204.4%로 크게 증가하며 pax3/7의 발현량이 64.6%로 감소하는 것이 확인되었다. 이 중 Myh3의 발현량은 근원세포에 처리한 WELSE의 농도에 비례하여 변화하는 것을 알 수 있다(Fig.
그러나 형성된 근관세포의 굵기가 Myh3의 단백질 분포를 근거로 판단하였을 때, 처리한 WELSE 의 농도 의존적으로 증가하는 것을 알 수 있으며, 이는 곧 WELSE를 처리한 근원세포에서 근관세포로 세포융합을 포함하는 분화과정이 촉진되었음을 의미한다. 이러한 결과를 통하여 WELSE가 근원세포에 대해 세포 활성에 영향을 주지 않으며, 근분화지표 단백질인 pax3/7의 분해와 Myh3의 발현과 근관 세포의 형성에 긍정적인 영향을 주어 근원세포의 근분화를 촉진하는 것을 알 수 있다.
또한 Myh3의 발현이 촉진된 근원세포는 형성된 근관세포가 더 굵으며, 이러한 경향성이 WELSE의 농도에 비례함을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 WELSE는 그 농도에 비례해 근원세포의 Myh3의 발현을 촉진하며 근관세포의 굵기를 증가시켜 근원 세포의 근분화를 유도하는 것을 확인하였다(Fig. 4).
3B). 이를 통하여 WELSE는 농도 의존적으로 근원세포의 근분화를 유도하는 것을 확인하였다.
이상의 결론을 통합하여, 항산화 효능을 기대할 수 있는 WELSE가 근원세포의 근분화 단백질의 발현과 근관세포의 형성에 긍정적인 영향을 주는 것으로 확인되었다. 이러한 근관세포 형성을 유도하는 것은 pax3/7의 분해와 Myh3의 발현을 유도하는 방향으로 진행되었다.
2). 해당 결과를 통하여 200 ㎍/㎖에서의 세포의 80% 이상이 생존할수 있는 것이 확인되어, WELSE가 세포 활성에 영향을 주지 않음을 확인하였다. 다만, 차후 근분화를 유도하는 실험에서 일반적인 Growth medium과 조성이 다른 differentiation medium에 48 시간 동안 처리하는 것을 고려할 때 200 ㎍/ ㎖은 추가적인 실험을 진행하기에 적합한 농도가 아니라 판단하여 최대 농도를 100 ㎍/㎖로 설정하고 추가적인 실험을 진행하였다.

후속연구

. 따라서이러한 urushiol은 함량이 작은 부위를 사용하거나, 건조를 포함한 여러 방법을 통하여 제거하는 등 차후 연구 및 실제 약품을 개발과정에서 배제할 필요가 있다. 본 연구에서도 urushiol이 물에서 용해도가 낮은 점을 고려해 완전히 건조된 乾漆 열수 추출물을 제조하여 실험을 진행하였다³⁰⁾ .
이러한 근관세포 형성을 유도하는 것은 pax3/7의 분해와 Myh3의 발현을 유도하는 방향으로 진행되었다. 또한, 이러한 WELSE의 근분화 촉진이 다른 근분화 단백질의 발현과 signaling pathway에 어떠한 형태로 관여하는지 연구한다면 근감소증의 치료 및 예방 방안에 대해 크게 이바지할 수 있을 것으로 예상된다.
이러한 WELSE의 효능에 관한 연구 및 어떠한 지표물질에 의한 반응인지에 관한 연구가 완료된다면 차후 근감소증의 치료 및 예방책에 관한 연구소재로서 상당한 가치를 기대할 수 있을 것으로 사료된다.
WELSE 처리에 의한 근분화의 촉진이 확인된 만큼 WELSE, 혹은 그 지표물질을 처리해 근육 조직의 재생능력을 보강하는것 역시 기대할 수 있으며, 이는 근감소증을 치료 혹은 예방하는 데 있어 매우 중요한 의미가 있다. 추가적인 연구를 통하여 WELSE에 의한 근분화 촉진 과정에서 pax3/7, Myh3 이외에 다른 근분화 지표 단백질의 발현량은 어떠한 변화양상을 보이는지, 근분화 지표 단백질 이외에도 어떠한 signaling pathway에 관여했는지 등 생물학적인 상관관계를 확인할 필요가 있다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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