[논문]Gefitinib-민감성 또는 내성 비소세포폐암 세포에서 Licochalcone C에 의한 자가포식 유도

오하나; 윤구; 채정일; 심정현

doi:10.5352/jls.2019.29.12.1305

Gefitinib-민감성 또는 내성 비소세포폐암 세포에서 Licochalcone C에 의한 자가포식 유도
Licochalcone C Induces Autophagy in Gefitinib-sensitive or-resistant Human Non-small Cell Lung Cancer Cells 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.29 no.12, 2019년, pp.1305 - 1313

오하나 (목포대학교 약학대학) , 윤구 (목포대학교 약학대학) , 채정일 (전북대학교 치과대학) , 심정현 (목포대학교 약학대학)

초록
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감초(Glycyrrhiza inflata)의 뿌리에서 분리된 Licochalcone (LC)은 항염증 및 항종양과 같은 많은 약리학적 효과를 가지고 있다. 현재까지 LCC는 구강암과 방광암에서 연구되었지만 폐암에서의 연구는 밝혀진 바 없다. 또한, 암에서 LCC에 의해 유도된 autophagy에 대한 연구는 없었다. 본 연구는 gefitinib-민감성 또는 내성을 갖는 폐암 세포에 대한 LCC의 효과 및 작용 메커니즘을 조사하기 위해 고안되었다. MTT 분석 데이터는 LCC가 비소세포폐암 세포주인 HCC827 (gefitinib-민감성) 및 HCC827GR (gefitinib-내성)에서 세포생존율을 유의하게 억제함을 보여주었다. 흥미롭게도, Annexin V/7-aminoactinomycin D 이중 염색 및 세포주기 분석에서 가장 높은 농도의 LCC 처리는 apoptosis를 유도하는 비율이 약 10%였다. LCC는 비소세포폐암 세포주에서 세포주기 G2/M 관련 단백질인 cyclin B1 및 cdc2의 발현을 감소시킴으로써 G2/M 정지를 야기하였다. LCC의 처리는 autophagy marker 단백질인 microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3) 및 autophagy과정에 관여하는 단백질인 autophagy-related gene (Atg)5의 발현을 증가시킴으로써 autophagy를 유도하였다. 또한, LCC는 reactive oxygen species (ROS)의 생성을 증가시켰으며, ROS 억제제인 N-acetyl-L-cysteine (NAC)에 의해 세포생존율이 부분적으로 회복되었다. Western blotting 분석에서, NAC과 LCC의 동시처리에 의해 cdc2의 발현이 증가하고 LC3의 발현은 감소되었다. 이러한 결과는 LCC가 비소세포폐암에서 ROS-의존적 G2/M 정지 및 autophagy를 유도함으로써 항종양 효과에 기여할 수 있음을 나타낸다. 결론적으로, LCC 치료는 비소세포폐암에 대한 잠재적 치료제로서 유용할 수 있다.

Abstract ▼ AI-Helper

Licochalcone (LC), isolated from the roots of Glycyrrhiza inflata has multiple pharmacological effects including anti-inflammatory and anti-tumor activities. To date, Licochalcone C (LCC) has induced apoptosis and inhibited cell proliferation in oral and bladder cancer cells, but lung cancer has not yet been studied. In addition, no study reported LCC-induced autophagy in cancer until now. The present study was designed to investigate the effect of LCC on gefitinib-sensitive and -resistant lung cancer cells and elucidate the mechanism of its action. The 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide assay data showed that LCC significantly inhibited cell viability in non-small cell lung cancer (NSCLC) HCC827 (gefitinib-sensitive) and HCC827GR (gefitinib-resistant) cell lines. Interestingly, Annexin V/7-aminoactinomycin D double staining and cell cycle analysis showed an apoptosis rate within about 20% at the highest concentration of LCC. LCC induced G2/M arrest by reducing the expression of the cell cycle G2/M related proteins cyclin B1 and cdc2 in NSCLC cell lines. Treatment of LCC also induced autophagy by increasing the expression of the autophagy marker protein microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3) and the protein autophagy-related gene 5 involved in the autophagy process. In addition, LCC increased the production of reactive oxygen species (ROS), and the cell viability was partially restored by treatment with the ROS inhibitor N-acetyl-L-cysteine. In western blotting analysis, the expression of cdc2 was increased and LC3 was decreased by the simultaneous treatment of NAC and LCC. These results indicate that LCC may contribute to anti-tumor effects by inducing ROS-dependent G2/M arrest and autophagy in NSCLC. In conclusion, LCC treatment may be useful as a potential therapeutic agent against NSCLC.

주제어

표/그림 (4)

그림 Fig. 1. The effects of LCC on cell viability in HCC827 and HCC827GR cells.
그림 Fig. 2. The effects of LCC on cell cycle and apoptosis in NSCLC cells.
그림 Fig. 3. The effects of LCC on autophagy in NSCLC cells.
그림 Fig. 4. The effects of LCC on ROS in NSCLC cells.

AI 본문요약
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문제 정의

따라서, 본 연구에서는 폐암에서 LCC의 항종양 활성과 작용기전을 규명하기 위해 in vitro 실험을 통하여 향후 폐암을 극복하기 위한 치료제 및 보조제로써 LCC의 활용 가능성을 알아보고자 하였다.

제안 방법

이전에는 세포의 죽음에 있어 apoptosis와 autophagy는 별개의 프로그램으로 인식해 왔지만, 최근 들어 그 경계가 모호하고 서로 상호작용할 수 있음이 밝혀졌다[11]. 비소세포폐암에서 LCC에 의한 세포 증식 억제가 apoptosis및 autophagy와 관련이 있는지 확인하기 위하여, 유세포분석을 시행하였다. Annexin V 염색은 일반적으로 apoptosis의 marker인 phosphatidylserine (PS)이 원형질막의 내부에서 외부로 전위되어 세포 표면으로 노출되는 특징을 이용해 PS와 높은 친화성을 갖는 annexin V가 결합하는 능력에 의해서 apoptotic 세포를 검출하는데 사용된다.

대상 데이터

Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Autophagy 관련 항체는 Cell signaling (Beverly, MA, USA)에서, 나머지 항체는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
본 연구에서 사용된 G. inflata는 전남생약조합에서 구입하여 사용하였으며, LCC는 이전 연구에서 기술된 방법에 따라 목포대학교 윤구 교수에게 제공받았다[14]. 세포 배양에 필요한 RPMI-1640 배지, fetal bovine serum (FBS), phosphate buffered saline (PBS), penicillin/streptomycin (p/s), trypsin은 Hyclone (Logan, UT, USA)에서 구입하였다.

데이터처리

모든 실험은 평균 ± 표준편차로 표시하였고, Prism 5.0 패키지를 사용하여 ANOVA에 의해 p<0.05는 통계적으로 유의함을 나타내었다.

성능/효과

지금까지 암에서 LCC에 대한 항종양 보고는 apoptosis 유도만 연구되었기 때문에[14, 21], 이러한 결과들을 종합해보면 LCC에 의한 apoptosis 및 autophagy의 유도는 새로운 통찰력을 제공할 수 있다. 결론적으로, LCC는 gefitinib에 민감하거나 내성을 가지는 비소세포폐암 세포에서 ROS-의존적 G2/M arrest 및 autophagy를 유도하고 세포의 성장을 억제하여 항종양 효능을 나타낼 수 있다는 것을 보여준다. 따라서 이러한 결과는 감초 추출물인 LCC가 비소세포폐암의 항암제나 보조제로 사용될 수 있는 가능성을 보여주며, 폐암의 치료 및 예방을 목적으로 기초적인 자료로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
1C). 이러한 결과는 LCC가 gefitinib에 민감하거나 내성을 갖는 비소세포폐암의 세포증식을 억제할 수 있음을 나타낸다.
3C). 이러한 결과는 LCC가 비소세포폐암 세포에서 autophagy를 유도한다는 것을 보여준다.

후속연구

결론적으로, LCC는 gefitinib에 민감하거나 내성을 가지는 비소세포폐암 세포에서 ROS-의존적 G2/M arrest 및 autophagy를 유도하고 세포의 성장을 억제하여 항종양 효능을 나타낼 수 있다는 것을 보여준다. 따라서 이러한 결과는 감초 추출물인 LCC가 비소세포폐암의 항암제나 보조제로 사용될 수 있는 가능성을 보여주며, 폐암의 치료 및 예방을 목적으로 기초적인 자료로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Autophagy에서 ATG5-ATG12/ATG16L 복합체의 역할은?	Autophagy는 autophagosome을 형성할 때와 lysosome과 융합하여 autolysosome을 형성하는 단계에서 여러 autophagy-related gene (ATG)가 관여하고 있다[19, 25]. 그 중 ATG5-ATG12/ATG16L 복합체는 microtubuleassociated protein 1 light chain 3 (LC3)를 모집하여 phagophore의 팽창을 유도한다[25]. Autophagy가 일어나는 동안에 LC3-I는 ATG3 및 ATG7과 상호작용하여 지질화를 통해 autophagosome에 결합한 LC3-II로 전환되며, LC3-II는 autophagy의 지표로써 알려져 있다[25].
	Licochalcone은 무엇에서 분리되었나?	감초(Glycyrrhiza inflata)의 뿌리에서 분리된 Licochalcone (LC)은 항염증 및 항종양과 같은 많은 약리학적 효과를 가지고 있다. 현재까지 LCC는 구강암과 방광암에서 연구되었지만 폐암에서의 연구는 밝혀진 바 없다.
	Autophagy는 무엇을 조절하는가?	천연물에서 유래된 천연 화합물들은 주로 apoptosis 및 autophagy를 유도하여 다양한 항종양 특성을 나타낸다[26]. Autophagy는 세포분해 경로로써 세포 내에서 항상성을 유지하거나 단백질 및 세포소기관들을 조절하며, autophagy의 두드러지는 특징은 세포 내 autophagy vesicle의 축적 및 lysosomal degradative pathway를 조절한다는 점이다. Autophagy의 주요 메커니즘은 autophagosome이라 불리는 이중막 소포에 의해 세포분해가 유도되어 스트레스 조건하에 재순환되며, 분해를 통해 형성된 작은 분자들은 재활용되거나 에너지 생산에 이용된다[13, 25].

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