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문제 정의
- 따라서 본 연구는 자연적인 xylose 대사 효모인 P. stipitis에 적응진화를 유도하여 섬유소계 바이오매스 유래의 혼합당인 xylose와 cellobiose를 효과적으로 대사하는 균주를 개발하고자 하였다. 이를 위해 cellobiose 환경에서 지속적인 계대배양을 통해 P.
- 섬유소계 바이오매스로부터 바이오 연료 등과 같은 유용한 물질을 생산하기 위해서는 바이오매스로부터 유래하는 혼합당을 효과적으로 대사할 수 있는 균주의 개발이 필수적이다. 본 연구에서는 xylose를 대사가 가능한 효모인 P. stipitis를 적응진화하여 cellobiose 대사효율이 향상되고 cellobiose와 xylose를 동시에 대사할 수 있는 균주를 개발하고자 하였다. 총 10회의 계대배양을 통해 얻어진 진화된 P.
- stipitis에 적응진화를 유도하여 섬유소계 바이오매스 유래의 혼합당인 xylose와 cellobiose를 효과적으로 대사하는 균주를 개발하고자 하였다. 이를 위해 cellobiose 환경에서 지속적인 계대배양을 통해 P. stipitis의 cellobiose 대사효율이 향상되도록 유도하였으며, 이를 통해 cellobiose와 xylose를 동시에 대사할 수 있는 P. stipitis를 개발하고자 하였다.
- stipitis를 약 20 g/l의 cellobiose를 탄소원으로 하여 회분식 발효를 진행한 결과, cellobiose를 모두 대사하기까지 160시간 이상이 소요되며 ethanol은 전혀 생성되지 않고 온전히 세포의 생장만 이루어지는 것을 확인하였다(결과는 제시하지 않음). 이에 cellobiose 조건에서 지속적으로 계대배양하는 적응진화 방법을 통해 cellobiose의 대사효율이 증가된 P. stipitis 돌연변이 균주를 확보하고자 하였다.
제안 방법
- stipitis 돌연변이 단일 개체를 선별하기 위하여 열 번째 배양에서 회수한 효모 세포들을 20 g/l의 glucose를 포함하는 고체배지에 배양하여 대략 350개 정도의 콜로니를 확보한 후 40개의 콜로니를 무작위로 선별하여 20 g/l의 cellobiose 조건에서 회분식 발효를 수행하였다. 20 g/l의 cellobiose 조건에서 40개의 균주들은 거의 비슷한 수준의 cellobiose 대사 및 ethanol 생산 양상을 나타내었으며(보충 Fig. 1 및 보충 Table 1), 그 중 ethanol 수율을 비교하여 3개의 균주들을 골라 40 g/l의 cellobiose 조건에서 회분식 발효를 수행하여 우수한 cellobiose 대사효율을 보이는 균주를 선별하고자 하였다.
- 20 g/l의 glucose를 함유한 YPD 배지에서 전배양 한 효모 균주들을 회수한 후 cellobiose와 xylose를 각각 20 g/l, 30 g/l 및 40 g/l 씩 함유하는 YPCX 배지에 세포 흡광도가 0.1이 되도록 접종한 후 30℃에서 90 rpm 조건으로 혼합당 발효를 진행하였다. 혼합당 발효는 각각 2회에 걸쳐 반복 실험을 수행하였다.
- Cellobiose 조건에서 적응진화된 균주 집단으로부터 cellobiose 대사가 향상된 P. stipitis 돌연변이 단일 개체를 선별하기 위하여 열 번째 배양에서 회수한 효모 세포들을 20 g/l의 glucose를 포함하는 고체배지에 배양하여 대략 350개 정도의 콜로니를 확보한 후 40개의 콜로니를 무작위로 선별하여 20 g/l의 cellobiose 조건에서 회분식 발효를 수행하였다. 20 g/l의 cellobiose 조건에서 40개의 균주들은 거의 비슷한 수준의 cellobiose 대사 및 ethanol 생산 양상을 나타내었으며(보충 Fig.
- 1이 되도록 접종하고 30℃에서 90 rpm 조건으로 회분식 발효를 진행하여, 적응진화를 통해 선별한 균주의 cellobiose 대사가 glucose 조건에서의 계대배양에 의해 변화하는지 확인하였다. P. stipitis 진화 균주의 유전적 안정성을 확인하기 위한 회분식 발효는 한 번씩 수행하였다.
- 1이 되도록 접종하고 30℃에서 90 rpm 조건으로 배양을 진행하여 cellobiose 소모속도와 ethanol 생산수율이 높은 균주를 1차 선별한 후, 40 g/l의 cellobiose가 함유된 YPC 배지에서 동일한 조건 으로 배양을 진행하여 cellobiose 소모속도와 ethanol 생산 속도가 높은 균주를 최종 선별하였다. 돌연변이 균주의 선별을 위한 회분식 발효는 한 번씩 수행하였다.
- 아울러 이러한 결과는 YN14 균주를 cellobiose 대사에 관련된 스트레스를 유발하지 않는 환경에서 계대배양을 진행하는 경우 cellobiose 대사와 관련된 각종 인자들이 다시 변화하여 모균주와 비슷한 수준으로 회귀할 수도 있음을 시사한다. 따라서 YN14 균주가 유전적으로 안정한지 확인하기 위하여 glucose를 단일 탄소원으로 하는 조건에서 총 10회에 걸쳐 계대배양을 진행하였으며, 각배양 단계의 종료시점에서 회수한 세포를 cellobiose를 단일탄소원으로 하는 조건에서 회분식 배양을 진행하여 YN14 균주의 cellobiose 대사양상을 비교하였다.
- 발효 중 세포성장을 확인하기 위해 배양액을 적당히 희석한 후 UV-visible spectrophotometer (Biomate, Thermo, USA)를 사용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하였다. 발효중 대사산물의 분석을 위해 배양액을 원심분리하여 세포를 제외한 상등액을 회수한 후 refractive index detector (RID)가 장착된 액체크로마토그래프(HPLC US/e2695, Waters, USA)를 이용하여 농도를 분석하였다.
- 발효 중 세포성장을 확인하기 위해 배양액을 적당히 희석한 후 UV-visible spectrophotometer (Biomate, Thermo, USA)를 사용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하였다. 발효중 대사산물의 분석을 위해 배양액을 원심분리하여 세포를 제외한 상등액을 회수한 후 refractive index detector (RID)가 장착된 액체크로마토그래프(HPLC US/e2695, Waters, USA)를 이용하여 농도를 분석하였다. 컬럼은 Rezex ROA-Organic Acid H+ (Phenomenex, USA)를 사용하였으며, 이동상으로는 0.
- 1이 되도록 접종하고 30℃에서 90 rpm의 교반 속도로 본배양을 진행하였다. 본배양 중 대부분의 cellobiose가 소모되어 잔여농도가 약 1 g/l 내외까지 이르렀을 때 효모를 회수하여 새로운 YPC 배지에 세포 흡광도가 0.1이 되도록 접종하였으며 이 과정을 총 10회에 걸쳐 수행하였다.
- 1이 되도록 접종하고 30℃에서 90 rpm의 교반 속도로 배양을 진행하였으며, 24시간 후 세포를 회수하여 새로운 YPD 배지에 10회에 걸쳐 계대배양을 진행하였다. 아울러 각 배양 단계의 종료시점에서 효모 세포를 회수한 후 20 g/l의 cellobiose를 포함한 YPC 배지에 세포 흡광도 0.1이 되도록 접종하고 30℃에서 90 rpm 조건으로 회분식 발효를 진행하여, 적응진화를 통해 선별한 균주의 cellobiose 대사가 glucose 조건에서의 계대배양에 의해 변화하는지 확인하였다. P.
- 계대배양을 통해 얻어진 10번째 배양액을 20 g/l glucose를 포함한 YPD 고체배지에 적절하게 희석하여 도말한 후 30℃에서 약 2일간 배양하여 단일 콜로니를 확보하였다. 이후 무작위로 40개의 콜로니를 선별하여 20 g/l의 cellobiose가 함유된 YPC 배지에 세포 흡광도가 0.1이 되도록 접종하고 30℃에서 90 rpm 조건으로 배양을 진행하여 cellobiose 소모속도와 ethanol 생산수율이 높은 균주를 1차 선별한 후, 40 g/l의 cellobiose가 함유된 YPC 배지에서 동일한 조건 으로 배양을 진행하여 cellobiose 소모속도와 ethanol 생산 속도가 높은 균주를 최종 선별하였다. 돌연변이 균주의 선별을 위한 회분식 발효는 한 번씩 수행하였다.
- 적응진화를 통해 선별한 P. stipitis 진화 균주가 유전적으로 안정한지 확인하기 위해 20 g/l glucose를 포함한 YPD 배지에서 세포 흡광도 0.1이 되도록 접종하고 30℃에서 90 rpm의 교반 속도로 배양을 진행하였으며, 24시간 후 세포를 회수하여 새로운 YPD 배지에 10회에 걸쳐 계대배양을 진행하였다. 아울러 각 배양 단계의 종료시점에서 효모 세포를 회수한 후 20 g/l의 cellobiose를 포함한 YPC 배지에 세포 흡광도 0.
- 2D−2F). 특히 YN14 균주는 발효 후 24시간 동안 다른 균주들에 비해 빠른 cellobiose 소모 및 ethanol 생산 양상을 보였기 때문에 YN14 균주를 최종적으로 선별하여 P. stipitis YN14로 명명하였으며 이후 추가적인 실험을 진행하였다. P.
- cerevisiae는 cellobiose와 xylose를 동시에 대사하여 섬유소계 바이오매스로부터 ethanol과 같은 바이오 연료를 효과적으로 생산할 수 있음이 보고된 바 있다[12, 14]. 한편 야생형의 P. stipitis는 유전적인 조작 없이 xylose를 원활하게 대사할 수 있으며 본 연구에서 개발된 P. stipitis YN14 균주는 cellobiose를 매우 빠르게 대사할 수 있기 때문에 P. stipitis 모균주와 YN14 균주가 혼합당을 효과적으로 대사할 수 있는지 확인하고자 cellobiose와 xylose 혼합당 조건에서 회분식 발효를 진행하였다.
- 1이 되도록 접종한 후 30℃에서 90 rpm 조건으로 혼합당 발효를 진행하였다. 혼합당 발효는 각각 2회에 걸쳐 반복 실험을 수행하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서 적응진화를 통한 cellobiose 대사의 향상을 위해 P. stipitis CBS6054 균주가 사용되었다.
성능/효과
- cerevisiae 가 보였던 문제점 중 하나인 혼합당 발효 중 intracellular β-glucosidase의 글리코실전이 반응에 의한 각종 당중합체의 형성이 거의 일어나지 않았다[12, 15, 16]. Cellobiose와 xylose 혼합당 발효에서 발효시간이 경과하더라도 cellobiose의 중합체 및 cellobiose와 xylose의 중합체가 배지 내에 축적되는 현상이 거의 발생하지 않았으며(보충 Fig. 2), 이는 YN14 균주의 cellobiose 대사에 관련된 효소들이 기존에 보고된 효소들보다 향상된 성능을 가지고 있음을 나타낸다. 따라서 YN14의 유전체 분석 및 전사체 분석과 같은 추가적인 연구를 통해 cellobiose 대사 향상의 원인 및 이와 관련된 주요 유전자들을 확보할 수 있을 것이며, 이를 섬유소계 바이오매스에서 유래하는 혼합당으로부터 효과적으로 바이오 연료 및바이오 소재를 생산할 수 있는 미생물의 개발에 활용할 수 있을 것이다.
- Glucose 조건에서 4회, 7회 및 10회 계대배양한 후 회수한 YN14 균주들 역시 거의 변하지 않은 cellobiose 대사속도를 보였으며, glucose 조건에서 1회 배양한 YN14 균주와 거의 비슷한 ethanol 생산량 및 생산수율을 나타내었다(ethanol 생산 8.0−8.2 g/l, ethanol 생산수율 0.39−0.40 g ethanol/g cellobiose).
- P. stipitis의 cellobiose 대사효율을 확인하기 위하여 야생형의 P. stipitis를 약 20 g/l의 cellobiose를 탄소원으로 하여 회분식 발효를 진행한 결과, cellobiose를 모두 대사하기까지 160시간 이상이 소요되며 ethanol은 전혀 생성되지 않고 온전히 세포의 생장만 이루어지는 것을 확인하였다(결과는 제시하지 않음). 이에 cellobiose 조건에서 지속적으로 계대배양하는 적응진화 방법을 통해 cellobiose의 대사효율이 증가된 P.
- 각 혼합당 조건에서의 YN14 균주의 ethanol 생산수율과 ethanol 생산속도는 cellobiose와 xylose 가 각각 30 g/l씩 포함된 조건에서 0.44 g ethanol/g sugars 및 0.65 g/l·h로 가장 높았으며, 이러한 결과로부터 각 당이 약 30 g/l씩 포함된 조건이 혼합당 동시발효에 가장 효과적인 조건임을 알 수 있었다.
- 그러나 여섯 번째 배양부터 P. stipitis의 cellobiose 대사속도가 확연히 증가하여 다섯 번째 배양과는 달리 48시간 안에 모든 cellobiose를 소모하고 약 4.6 g/l의 ethanol을 생산하는 것이 관찰되었으며(ethanol 생산속도 0.1 g/l·h, ethanol 수율 0.29 g ethanol/gcellobiose), 일곱 번째 배양에서는 cellobiose 소모속도가 더욱 증가하여 24시간 동안 거의 모든 cellobiose를 소모하고 약 6.2 g/l의 ethanol을 생산하는 것이 관찰되었다(ethanol 생산속도 0.26 g/l·h, ethanol 수율 0.42 g ethanol/g cellobiose).
- 3B 및 3C). 그리고 모균주는 혼합당 발효 중 부산물(xylitol, glycerol 및 acetate 등)의 축적이 거의 일어나지 않는 것이 관찰되었다.
- 3D). 동일한 조건에서의 모균주 발효결과와 비교할 때 YN14 균주는 모균주와 거의 동일한 속도로 xylose를 대사하였으며, 이러한 결과는 cellobiose 조건에서의 적응진화는 YN14 균주의 xylose 대사에는 영향을 미치지 않았다는 것을 의미한다. 아울러 YN14 균주는 cellobiose와 xylose가 각각 30 g/l씩 포함된 혼합당 조건에서 보다 선명한 혼합당 동시대사 양상을 보였다.
- 43 g ethanol/g cellobiose). 따라서 총 10회의 cellobiose 조건에서의 계대배양을 통해 야생형의 균주보다 cellobiose의 대사속도 및 ethanol 생성이 현저하게 상승한 돌연변이 균주 집단을 확보할 수 있었다.
- 6 등)이나 intracellular β-glucosidase들(BGL1, BGL3 및 BGL5 등)이 유전적 변이를 일으켜 활성이 향상되었거나 발현 수준이 모균주에 비해 현격히 늘어났기 때문일 것으로 예상된다. 또한 YN14 균주는 적응진화에 의한 돌연변이에도 불구하고 xylose 대사가 거의 영향을 받지 않았으며 이를 통해 cellobiose와 xylose 혼합당을 동시에 대사하여 모균주에 비해 ethanol 생산 및 생산속도가 2배 가까이 빨라지는 발효결과를 나타내었는데, 이러한 결과를 cellobiose 와 xylose를 동시에 대사하는 재조합 S. cerevisiae에 관한 선행연구결과와 종합해 본다면 효모에서 cellobiose 대사와 xylose 대사는 서로 간의 대사를 저해하지 않고 상승효과를 낼 수 있음을 알 수 있다[12, 14]. 그리고 YN14 균주는 혼합 당의 농도가 높은 경우 약간의 xylitol이 축적되는 것이 관찰되었는데, 아마도 cellobiose와 xylose의 동시대사로 인해 YN14가 대사할 수 있는 한계치에 가깝게 혼합당이 유입되었기 때문인 것으로 추측된다.
- 또한 모균주는 cellobiose와 xylose가 각각 30 g/l 또는 40 g/l씩 포함된 혼합당 조건에서도 비슷한 발효양상을 나타내었다. 발효 중간 단계까지 xylose는 매우 원활하게 대사한 반면 cellobiose는 거의 대사하지 않았으며, xylose의 대사가 완료되는 단계에 이르러서야 cellobiose의 대사가 이루어지는 발효양상이 확인되었다(Fig. 3B 및 3C). 그리고 모균주는 혼합당 발효 중 부산물(xylitol, glycerol 및 acetate 등)의 축적이 거의 일어나지 않는 것이 관찰되었다.
- 본 연구에서는 cellobiose의 대사가 현저히 느린 야생형 P.stipitis를 이용하여 cellobiose 조건에서 적응진화를 진행하여 cellobiose 대사효율이 상승한 YN14 균주를 확보할 수 있었으며, 이는 P. stipitis 모균주가 cellobiose 대사와 관련된 유전자들의 돌연변이 혹은 발현 수준의 변화 없이는 생육이 어려운 환경에서 스스로 유전적 변이를 일으켜 YN14 균주로 진화하였다는 것을 나타낸다. 아울러 이러한 결과는 YN14 균주를 cellobiose 대사에 관련된 스트레스를 유발하지 않는 환경에서 계대배양을 진행하는 경우 cellobiose 대사와 관련된 각종 인자들이 다시 변화하여 모균주와 비슷한 수준으로 회귀할 수도 있음을 시사한다.
- 3E). 아울러 동일한 조건에서의 모균주 발효결과와 비교할 때, YN14 균주는 모균주와 거의 동일한 속도로 xylose 를 대사한다는 것도 확인되었다. Cellobiose와 xylose가 각각 40 g/l씩 포함된 혼합당 조건에서도 두 가지 당의 동시대사 양상은 동일하게 관찰되었다.
- 4 (g ethanol/g cellobiose)로 향상시켰다. 아울러 본 실험에서 개발한 돌연변이 균주는 cellobiose와 xylose 혼합당 조건에서 모균주에 비해 2배 가까이 향상된 ethanol 생산 및 생산속도를 나타내었다.
- 40 g ethanol/g cellobiose). 이러한 결과로부터 cellobiose 환경에서 적응진화한 YN14는 유전적으로 안정하기 때문에 스트레스를 유발하지 않는 환경에서 배양하더라도 진화에 필요했던 유전적 변이를 상실하지 않는다는 것을 확인하였다.
- stipitis를 이용한 적응진화의 첫 번째 배양에서는 발효 후 144시간이 지나도 cellobiose가 모두 소모되지는 않았으며 ethanol의 생성은 관찰되지 않았다. 적응진화의 두 번째부터 네 번째 배양도 첫 번째 배양과 마찬가지로 배양 시작 후 144시간이 지나도록 cellobiose가 모두 소모되지 않았으며, 다섯 번째 배양에서는 cellobiose가 144시간 안에 모두 소모되었으나 여전히 ethanol은 생성되지 않음을 확인하였다. 그러나 여섯 번째 배양부터 P.
- stipitis를 적응진화하여 cellobiose 대사효율이 향상되고 cellobiose와 xylose를 동시에 대사할 수 있는 균주를 개발하고자 하였다. 총 10회의 계대배양을 통해 얻어진 진화된 P. stipitis 돌연변이 균주는 모균주에 비해 6배 이상 증가된 cellobiose 대사속도를 나타내었으며 ethanol 생산수율을 0에서 0.4 (g ethanol/g cellobiose)로 향상시켰다. 아울러 본 실험에서 개발한 돌연변이 균주는 cellobiose와 xylose 혼합당 조건에서 모균주에 비해 2배 가까이 향상된 ethanol 생산 및 생산속도를 나타내었다.
- 추가적으로 수행한 열 번째 배양까지는 큰 폭의 cellobiose 대사속도의 향상은 관찰되지 않았으나, 일곱 번째 배양과 비교하여 열 번째 배양에서는 cellobiose가 배양 후 18시간 안에 모두 소모되어 약 6.9 g/l의 ethanol이 생성됨을 관찰하였다(ethanol 생산속도 0.38 g/l·h, ethanol 수율 0.43 g ethanol/g cellobiose).
후속연구
- 2), 이는 YN14 균주의 cellobiose 대사에 관련된 효소들이 기존에 보고된 효소들보다 향상된 성능을 가지고 있음을 나타낸다. 따라서 YN14의 유전체 분석 및 전사체 분석과 같은 추가적인 연구를 통해 cellobiose 대사 향상의 원인 및 이와 관련된 주요 유전자들을 확보할 수 있을 것이며, 이를 섬유소계 바이오매스에서 유래하는 혼합당으로부터 효과적으로 바이오 연료 및바이오 소재를 생산할 수 있는 미생물의 개발에 활용할 수 있을 것이다.
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