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문제 정의
- 본 연구에서는 독도의 자생식물인 번행초와 번행초의 근권토양에서부터 분리한 세균 중 식물병 저항성을 유도하는 능력을 갖추는 세균의 분포를 파악하며, 그 중 그람 양성 세균인 바실러스 속 세균에 초점을 맞추어 작물에서의 식물병저항 효과를 증명하려고 한다.
- 본 연구에서는 미생물의 식물병저항유도 효과를 확인하기 위해, 독도 자생식물의 근권에서 식물생장촉진세균을 선별하고, 그 중에도 상업적 가치가 높은 바실러스 속 세균에 초점을 맞추어 실험을 진행하였다. 우선 식물생장촉진근권세 균들이 가지고 있는 식물생장촉진특성인 옥신생산능과 siderophore 생산능, 난용성 인산 가용능을 확인하여 식물 근권에 군집하여 있는 균들의 PGP 분포비율을 확인하였다.
제안 방법
- 반응 후, Sensident Scan (Labsystems, Finland)을 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. IAA 농도는 IAA 표준 곡선을 비교에 하여 계산하였다.
- 3). 그 중 가장 효과가 가장 뛰어났던 KUDC6619에 대한 추가적인 실험으로 다른 작물인 고추로 실험을 진행하였다.
- 독도에 서식하는 번행초와 번행초의 근권토양으로부터 다양한 미생물을 순수분리 하였다. 근권토양에서 52개, 식물체 내생 환경에서 51개, 식물체 표면에서 35개 등을 포함하여 모두 138개가 분리되었다.
- kr/) 에 의뢰하여 분석을 진행하였다. 또한 EZbiocloud (https://www.ezbio-cloud.net/)를 이용하여 염기서열 정보를 얻어 비교하였다.
- 그 후 미생물들이 군집을 이룰 수 있도록 5−7일간 배양하였다. 병원균 Xpv를 10 9 CFU/ml의 현탁하여 고추의 잎 면의 30% 까지 흡수되도록 잎맥에 주사기를 이용하여 주입시켰다. 실험 비교를 위해 양성 대조군으로 BTH를 0.
- 분리 균을 처리하여 담배가 뿌리무름병에 대한 저항성을 가지게 하는지 ISR 활성을 확인하였다. 실험에 대한 비교를 위하여 음성대조군으로 식염수와 양성대조군으로 BTH를 사용하였다.
- 분리 균의 식물 호르몬인 IAA를 생산하는 능력에 대해 시험하였다. 분리 균을 실험에 사용하기 위하여 5 ml LB 액체배지에 24시간 동안 전배양을 진행한 후 옥신의 전구체인 트립토판(0.
- 본 연구는 독도에서 서식하는 자생식물인 번행초와 번행초의 근권에서 미생물들을 분리하였다. 분리 균의 식물생장 촉진 특성을 확인하였으며, 식물 병에 대한 저항성을 유도 효과를 가진 균 중 범용성이 좋은 바실러스 속 세균에 초점을 두어 실험을 진행하였다. 번행초의 분리 균들은 근권환경에 52종, 식물체 내생 환경에서 51종, 식물체 표면에서 35종으로 총 138종의 분리 균이 확보되었다.
- 본 연구는 독도에서 서식하는 자생식물인 번행초와 번행초의 근권에서 미생물들을 분리하였다. 분리 균의 식물생장 촉진 특성을 확인하였으며, 식물 병에 대한 저항성을 유도 효과를 가진 균 중 범용성이 좋은 바실러스 속 세균에 초점을 두어 실험을 진행하였다. 번행초의 분리 균들은 근권환경에 52종, 식물체 내생 환경에서 51종, 식물체 표면에서 35종으로 총 138종의 분리 균이 확보되었다.
- 분리 균의 식물생장촉진특징을 확인하여 보기 위하여, 식물 성장에 필요한 난용성인 가용화와 철의 결합에 사용되는 siderophore의 생산능, 식물생장호르몬인 옥신 생산능을 확인하여 각각의 비율을 확인하였고, 3가지 특성을 모두 가진 균의 비율을 확인하였다. 또한 분리 균을 담배에 처리하여 병원균에 대한 유도전신저항성을 확인하였고, 그 중 효과가 좋았던 균 35종을 부분 동정한 결과, 바실러스 속은 KUDC6588, KUDC6597, KUDC6606, KUDC6614, KUDC6615, KUDC6619로 나타났다.
- 분리 균이 PGPR로써 식물성장촉진능력를 확인하기 위해 옥신 생산능, siderophore 생산능, 인산 가용성 등을 조사하였다. 그 결과, 옥신생성능과 siderophore 생성능, 인산염 분해능 등은 각각 30.
- 분리된 6종의 바실러스가 병원균에 대한 항균효과를 가지고 있는지를 확인하였다. 그 결과, 분리 균들은 대장균과 2가지의 병원균을 포함하여 모두 항균효과는 나타나지 않았다 (데이터미제시).
- 35개 균을 대상으로 하여 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하였고, 그 결과, 저항효과가 높은 6개의 균이 Bacillus pumilus, Bacillus zhangzhouensis, Bacillus aryabhattai, Bacillus mobilis, Bacillus zhangzhouensis 등으로 부분동정 되어, 모두 바실러스 속인 것으로 밝혀졌다(Table 1). 분리된 바실러스의 연관관계를 확인하기 위하여 16S rRNA 염기서열을 비교분석하여 균주 간의 계통발생학적 관계를 확인하였다(Fig. 2).
- 선별된 세균들로 인하여 식물에 의한 병저항 유도능력을 확인하기 위해 조직부패병인 PCC를 식염수에 108 CFU/ml 가 되도록 희석하였다. 균 현탁액을 담배의 잎 중 첫 쌍의 잎에 5 µl씩 분주하였다.
- 소독한 종자에 멸균 증류수를 이용하여 15분간 2−3회를 진탕하여 세척하였다.
- 균 현탁액을 담배의 잎 중 첫 쌍의 잎에 5 µl씩 분주하였다. 실험 비교를 위해 양성대조군으로 benzothiadiazole (BTH)를 0.5 mM의 농도로 희석하여 사용 하였으며, 음성대조군으로 식염수를 사용하였다. 실험군과 대조군은 식물배양실에서 동일한 조건으로 2일간 배양하며 관찰하였다.
- 5 mM의 농도로 희석하여 사용 하였으며, 음성대조군으로 식염수를 사용하였다. 실험군과 대조군은 식물배양실에서 동일한 조건으로 2일간 배양하며 관찰하였다. 유도전신저항성의 효과를 증명하기 위해 뿌리무름증의 발병 수를 세었고, 수에 따라 평균값을 계산하였다 (병 발생여부에 따라 0과 5로 구분하였다; 병증 계산 방법 = 발병갯수 × 5/총 식물갯수).
- 분리 균을 처리하여 담배가 뿌리무름병에 대한 저항성을 가지게 하는지 ISR 활성을 확인하였다. 실험에 대한 비교를 위하여 음성대조군으로 식염수와 양성대조군으로 BTH를 사용하였다. 뿌리무름병의 발생으로 인하여 식물의 잎이 시들어버리는 결과가 나타난다.
- 본 연구에서는 미생물의 식물병저항유도 효과를 확인하기 위해, 독도 자생식물의 근권에서 식물생장촉진세균을 선별하고, 그 중에도 상업적 가치가 높은 바실러스 속 세균에 초점을 맞추어 실험을 진행하였다. 우선 식물생장촉진근권세 균들이 가지고 있는 식물생장촉진특성인 옥신생산능과 siderophore 생산능, 난용성 인산 가용능을 확인하여 식물 근권에 군집하여 있는 균들의 PGP 분포비율을 확인하였다. 또한 식물 병에 대한 유도전신저항성 효과를 확인하였고, 효과가 좋은 균을 선별하였다.
- 유도전신저항성의 효과를 증명하기 위해 뿌리무름증의 발병 수를 세었고, 수에 따라 평균값을 계산하였다 (병 발생여부에 따라 0과 5로 구분하였다; 병증 계산 방법 = 발병갯수 × 5/총 식물갯수).
- 일주일의 배양기간을 거친 후, 식물의 병증에 따라 수치를 측정하였다(0−5; 0 = no symptom, 1 = <10% 이하, 2 = 10−25%, 3 = 25−50%, 4 = 50−75%, 5 = >75%, 시들어 죽음).
대상 데이터
- carotovorum (PCC)와 Xanthomonas axonopodis pv. vesicatorya (Xpv)는 한국생명공학연구원 감염병연구센터 류충민 박사 연구팀으로부터 분양받아 실험을 진행하였다.
- 담배 종자는 Nicotiana benthamiana를 이용하여 실험을 진행하였다. 1.
- 분리 균의 16S rRNA 유전자 염기서열을 기반으로 비교분석하기 위하여, 프라이머를 518F(5'-CCAGCAGCCGCG GTAATACG-3')와 800R(5'-TACCAGGGT-ATCTAATCC-3')을 사용하였으며 바이오닉스(http://www.bionicsro.co.kr/) 에 의뢰하여 분석을 진행하였다.
- 분리 균의 난용성 인산염 가용화 능력을 확인하기 위해 national botanical research institute phosphate (NBRIP) 배지를 사용하였다[25]. NBRIP 배지는 세균의 인산염 분해 능력을 검증한다.
- 분리 균의 식물촉진효과 및 유도전신저항성의 능력을 확인하기 위해, 4개의 잎의 단계인 고추 근권에 109 CFU/ml의 MgCl2을 이용한 균현탁액 12 ml를 뿌리에 분주하였다. 그 후 미생물들이 군집을 이룰 수 있도록 5−7일간 배양하였다.
- 식물생장촉진근권세균의 후보군을 분리하기 위하여, 2017년 4월에 독도에서 채취한 번행초와 번행초의 근권토양에서 분리하였다. 근권토양 및 식물체에 있는 미생물을 분리하기 위하여, 토양시료 1 g을 9 ml의 0.
- 병원균 Xpv를 10 9 CFU/ml의 현탁하여 고추의 잎 면의 30% 까지 흡수되도록 잎맥에 주사기를 이용하여 주입시켰다. 실험 비교를 위해 양성 대조군으로 BTH를 0.5 mM의 농도로 희석하여 사용하였으며, 음성대조군으로 10 mM MgCl2를 사용하였다. 일주일의 배양기간을 거친 후, 식물의 병증에 따라 수치를 측정하였다(0−5; 0 = no symptom, 1 = <10% 이하, 2 = 10−25%, 3 = 25−50%, 4 = 50−75%, 5 = >75%, 시들어 죽음).
데이터처리
- 유도전신저항성 분석에 대한 데이터는 SPSS 버전 22.0 (SPSS Inc., USA)을 사용하여 least significant difference (LSD)으로 분산분석(ANOVA)을 통해 통계적으로 분석하였다.
이론/모형
- 분리 균의 siderophore 생산능력을 확인을 위해 Schwyn and Neilands [24]에 방법을 참고하여 chrome azurol S (CAS) blue 배지를 사용하였다.
성능/효과
- 35개 균을 대상으로 하여 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하였고, 그 결과, 저항효과가 높은 6개의 균이 Bacillus pumilus, Bacillus zhangzhouensis, Bacillus aryabhattai, Bacillus mobilis, Bacillus zhangzhouensis 등으로 부분동정 되어, 모두 바실러스 속인 것으로 밝혀졌다(Table 1). 분리된 바실러스의 연관관계를 확인하기 위하여 16S rRNA 염기서열을 비교분석하여 균주 간의 계통발생학적 관계를 확인하였다(Fig.
- 또한 분리 균을 담배에 처리하여 병원균에 대한 유도전신저항성을 확인하였고, 그 중 효과가 좋았던 균 35종을 부분 동정한 결과, 바실러스 속은 KUDC6588, KUDC6597, KUDC6606, KUDC6614, KUDC6615, KUDC6619로 나타났다. 6종의 바실러스 속 세균들은 모두 저항성 향상에 좋은 효과를 보였으며, 특히 KUDC6619의 경우 현재 화학항생물질인 BTH와도 비슷한 효과를 보였다. KUDC6619는 대표적인 식용작물인 고추에 서도 유도전신저항성의 향상에 대한 좋은 결과를 나타내었다.
- 고추에 KUDC6619를 처리하여 고추에서 세균성 점무늬병증이 대조군 비하여 24.5% 가량 증상이 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 4, Fig. 5). 이번 실험을 통하여 총 6종의 바실러스 속 세균이 식물의 면역에 이로운 영향을 주는 것을 알 수 있었다.
- 분리된 6종의 바실러스가 병원균에 대한 항균효과를 가지고 있는지를 확인하였다. 그 결과, 분리 균들은 대장균과 2가지의 병원균을 포함하여 모두 항균효과는 나타나지 않았다 (데이터미제시). 이러한 결과를 종합하면 분리 균들은 식물에 SAR을 보이는 것이 아닌 ISR 효과를 나타낸다는 결과를 보여준다는 것을 알 수 있었다.
- 분리 균이 PGPR로써 식물성장촉진능력를 확인하기 위해 옥신 생산능, siderophore 생산능, 인산 가용성 등을 조사하였다. 그 결과, 옥신생성능과 siderophore 생성능, 인산염 분해능 등은 각각 30.4%, 55.7%, 81.9%의 균들이 활성을 가졌다. 전체 균에 비교하여 옥신과 siderophore의 활성을 가진 균은 24.
- 독도에 서식하는 번행초와 번행초의 근권토양으로부터 다양한 미생물을 순수분리 하였다. 근권토양에서 52개, 식물체 내생 환경에서 51개, 식물체 표면에서 35개 등을 포함하여 모두 138개가 분리되었다.
- KUDC6619는 대표적인 식용작물인 고추에 서도 유도전신저항성의 향상에 대한 좋은 결과를 나타내었다. 따라서 사람과 동물에 대한 안전성, 식물 병원성 등 다양한 테스트를 진행한 후, 안정성이 확보된다면, KUDC6619는 식물의 ISR을 야기하는 생물농약 으로서의 높은 산업적가치가 있을 것으로 보인다.
- KUDC6619는 대표적인 식용작물인 고추에 서도 유도전신저항성의 향상에 대한 좋은 결과를 나타내었다. 따라서 사람과 동물에 대한 안전성, 식물 병원성 등 다양한 테스트를 진행한 후, 안정성이 확보된다면, KUDC6619는 식물의 ISR을 야기하는 생물농약 으로서의 높은 산업적가치가 있을 것으로 보인다.
- 분리 균의 식물생장촉진특징을 확인하여 보기 위하여, 식물 성장에 필요한 난용성인 가용화와 철의 결합에 사용되는 siderophore의 생산능, 식물생장호르몬인 옥신 생산능을 확인하여 각각의 비율을 확인하였고, 3가지 특성을 모두 가진 균의 비율을 확인하였다. 또한 분리 균을 담배에 처리하여 병원균에 대한 유도전신저항성을 확인하였고, 그 중 효과가 좋았던 균 35종을 부분 동정한 결과, 바실러스 속은 KUDC6588, KUDC6597, KUDC6606, KUDC6614, KUDC6615, KUDC6619로 나타났다. 6종의 바실러스 속 세균들은 모두 저항성 향상에 좋은 효과를 보였으며, 특히 KUDC6619의 경우 현재 화학항생물질인 BTH와도 비슷한 효과를 보였다.
- 우선 식물생장촉진근권세 균들이 가지고 있는 식물생장촉진특성인 옥신생산능과 siderophore 생산능, 난용성 인산 가용능을 확인하여 식물 근권에 군집하여 있는 균들의 PGP 분포비율을 확인하였다. 또한 식물 병에 대한 유도전신저항성 효과를 확인하였고, 효과가 좋은 균을 선별하였다.
- 분리 균의 식물생장 촉진 특성을 확인하였으며, 식물 병에 대한 저항성을 유도 효과를 가진 균 중 범용성이 좋은 바실러스 속 세균에 초점을 두어 실험을 진행하였다. 번행초의 분리 균들은 근권환경에 52종, 식물체 내생 환경에서 51종, 식물체 표면에서 35종으로 총 138종의 분리 균이 확보되었다.
- 생물농약으로 사용하기에 바실러스는 그람양성균으로 내생포자를 형성한다는 특징으로 다양한 악조건의 환경에서도 생존력이 매우 높아 가장 적합하다고 보이며, 이러한 특징으로 산업적 가치가 높다고 판단된다.
- 선별된 바실러스 속 세균은 음성대조군에 비하여 높은 병증 감소 효과를 보여주었다(Fig. 3). 그 중 가장 효과가 가장 뛰어났던 KUDC6619에 대한 추가적인 실험으로 다른 작물인 고추로 실험을 진행하였다.
- 그 결과, 분리 균들은 대장균과 2가지의 병원균을 포함하여 모두 항균효과는 나타나지 않았다 (데이터미제시). 이러한 결과를 종합하면 분리 균들은 식물에 SAR을 보이는 것이 아닌 ISR 효과를 나타낸다는 결과를 보여준다는 것을 알 수 있었다.
- 5). 이번 실험을 통하여 총 6종의 바실러스 속 세균이 식물의 면역에 이로운 영향을 주는 것을 알 수 있었다.
- 9%의 균들이 활성을 가졌다. 전체 균에 비교하여 옥신과 siderophore의 활성을 가진 균은 24.6%, 옥신과 인산염의 비율은 21.7%, siderophore 와 인산염의 비율은 52.9%로 나타났으며, 3가지의 식물성장 촉진특성을 생산하는 비율은 19.6%로 나타났다(Fig. 1). 식물 성장과 관련된 세균에 의한 이러한 특징적인 능력은 식물이 자라기에 적합하지 않은 환경에서 높은 정착성과 생장성을 높이는 결과를 보여줄 것으로 추측된다.
- 뿌리무름병의 발생으로 인하여 식물의 잎이 시들어버리는 결과가 나타난다. 하지만 분리 균들의 담배에 대한 식물 저항성은 대부분이 음성대조군에 비하여 방제효과가 20% 미만은 59개, 20% 이상 60% 미만은 44개, 60% 이상의 식물 방제 효과를 가지는 균은 35개로 나타났다.
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