퇴비에서 식중독균 검출을 위한 DNA 추출 방법 비교 Comparison of DNA Extraction Methods for the Detection of Foodborne Pathogenic Bacteria from Livestock Manure Composts원문보기
본 연구에서는 가축분퇴비에 존재할 수 있는 식중독균의 검출을 위하여 기존의 배양을 이용한 방법을 대체할 수 있는 real-time PCR을 적용하고자 하였으며, 이에 따라 유전자 증폭에 영향을 미치는 DNA 추출 방법에 따른 식중독균 검출 효율을 비교하였다. 적용한 방법은 가열 처리, 유기용매 및 흡착제 처리, 효소 처리의 3가지로 구분할 수 있으며, 각 방법에 따른 DNA의 검출 효율을 실험 결과로 나타내었다. 가열 처리 방법에서는 가열 시간의 증가에 따라 DNA 검출 효율이 높아지는 경향을 나타냈으며, 유기용매 및 흡착제는 효과를 나타내지 않았고, 효소 처리의 경우에는 그람 양성균 보다는 그람 음성균의 DNA가 추출 효율이 더 높은 것으로 나타났다. 결론적으로 퇴비에서 30분 이상의 가열 처리와 효소의 처리를 통한 DNA 추출 방법은 real-time PCR을 적용한 식중독균 검출에 적합한 것으로 판단된다.
본 연구에서는 가축분퇴비에 존재할 수 있는 식중독균의 검출을 위하여 기존의 배양을 이용한 방법을 대체할 수 있는 real-time PCR을 적용하고자 하였으며, 이에 따라 유전자 증폭에 영향을 미치는 DNA 추출 방법에 따른 식중독균 검출 효율을 비교하였다. 적용한 방법은 가열 처리, 유기용매 및 흡착제 처리, 효소 처리의 3가지로 구분할 수 있으며, 각 방법에 따른 DNA의 검출 효율을 실험 결과로 나타내었다. 가열 처리 방법에서는 가열 시간의 증가에 따라 DNA 검출 효율이 높아지는 경향을 나타냈으며, 유기용매 및 흡착제는 효과를 나타내지 않았고, 효소 처리의 경우에는 그람 양성균 보다는 그람 음성균의 DNA가 추출 효율이 더 높은 것으로 나타났다. 결론적으로 퇴비에서 30분 이상의 가열 처리와 효소의 처리를 통한 DNA 추출 방법은 real-time PCR을 적용한 식중독균 검출에 적합한 것으로 판단된다.
This study investigated the efficacy of DNA extraction methods for real-time PCR detection of foodborne pathogenic bacteria in livestock manure composts. Livestock manure composts were inoculated with Escherichia coli O157:H7, Salmonella Typhimurium, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus and incub...
This study investigated the efficacy of DNA extraction methods for real-time PCR detection of foodborne pathogenic bacteria in livestock manure composts. Livestock manure composts were inoculated with Escherichia coli O157:H7, Salmonella Typhimurium, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus and incubated in enrichment broth. For DNA extraction, enriched samples were treated following boiling method, by chloroform, C18 powder, and proteinase K. As a result, 4 species of bacteria were detected by real-time PCR when subjected to boiling for 30 min and treated with proteinase K. These results suggest that detection of foodborne pathogens by real-time PCR from livestock manure composts could be applicable using effective DNA extraction methodology such as the boiling method or proteinase K.
This study investigated the efficacy of DNA extraction methods for real-time PCR detection of foodborne pathogenic bacteria in livestock manure composts. Livestock manure composts were inoculated with Escherichia coli O157:H7, Salmonella Typhimurium, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus and incubated in enrichment broth. For DNA extraction, enriched samples were treated following boiling method, by chloroform, C18 powder, and proteinase K. As a result, 4 species of bacteria were detected by real-time PCR when subjected to boiling for 30 min and treated with proteinase K. These results suggest that detection of foodborne pathogens by real-time PCR from livestock manure composts could be applicable using effective DNA extraction methodology such as the boiling method or proteinase K.
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문제 정의
대표적으로 사용되는 가열과 효소 처리 방법을 적용하였으며, 분리된 DNA의 정제를 위해서 chloroform과 흡착제(sorbent)를 처리하여 효과를 알아보고자 하였다. 각 실험 방법에 따른 미생물 검출 결과를 비교하여 퇴비에서 적합한 DNA 추출 방법을 확립하고자 수행하였다.
본 연구에서는 가축분퇴비에 존재할 수 있는 식중독균의 검출을 위하여 기존의 배양을 이용한 방법을 대체할 수 있는 real-time PCR을 적용하고자 하였으며, 이에 따라 유전자 증폭에 영향을 미치는 DNA 추출 방법에 따른 식중독균 검출 효율을 비교하였다. 적용한 방법은 가열 처리, 유기용매 및 흡착제 처리, 효소 처리의 3가지로 구분할 수 있으며, 각 방법에 따른 DNA의 검출 효율을 실험 결과로 나타내었다.
이에 따라 본 연구에서는 퇴비에서 식중독균 검출을 위한 미생물 DNA의 추출 방법을 비교하였다. 대표적으로 사용되는 가열과 효소 처리 방법을 적용하였으며, 분리된 DNA의 정제를 위해서 chloroform과 흡착제(sorbent)를 처리하여 효과를 알아보고자 하였다.
제안 방법
이에 따라 본 연구에서는 퇴비에서 식중독균 검출을 위한 미생물 DNA의 추출 방법을 비교하였다. 대표적으로 사용되는 가열과 효소 처리 방법을 적용하였으며, 분리된 DNA의 정제를 위해서 chloroform과 흡착제(sorbent)를 처리하여 효과를 알아보고자 하였다. 각 실험 방법에 따른 미생물 검출 결과를 비교하여 퇴비에서 적합한 DNA 추출 방법을 확립하고자 수행하였다.
지금까지 퇴비에서 식중독균 검출을 위한 real-time PCR 분석 방법의 적용을 위하여 가열 처리, 효소, 유기용매 및 흡착제에 의한 DNA 추출 결과를 비교하였다. 그 결과 30분 가열 처리와 proteinase K 효소 처리를 통하여 퇴비 배양액에서 DNA를 추출하고 real-time PCR을 사용한 식중독균의 검출이 가능한 것으로 판단되었다.
퇴비 배양액에서 DNA 추출을 위하여 가열 시간을 다르게 하였을 때 4종 식중독균 검출 결과를 비교하였다(Table 2). 10분간 가열을 통해서는 2가지로 구분한 저농도와 고농도에서 모두 검출되지 않았으며, 20분 가열에서는 4종균 모두 고농도로 초기 접종한 배양액에서만 유전자 증폭 결과 검출되었고 검출 Ct값은 20.
대상 데이터
퇴비는 가축분뇨와 음식물폐기물이 혼합된 것을 시료로 사용하였으며 25 g을 칭량하여 2가지로 구분된 혼합배양액 1 mL씩 각각 접종하였다. 접종량은 저농도(102CFU/g)와 고농도(105CFU/g)로 구분하였으며 멸균백(Whirl-pak, Nasco,Fort Atkinson, WI, USA)에 옮겨 담아 225 mL TSB를 첨가하여 37℃에서 24시간 증균배양(enrichment)을 실시하였다.
이론/모형
4종 식중독균의 검출은 시판되는 real-time PCR 키트Powerchek multiplex pathogen detection kit (Kogene Biotech)를 사용하였다13). 각 균의 target gene과 증폭 산물의 크기는 Table 1과 같다.
Proteinase K는 DNA 추출 시 단백질을 분해하는 용도로 사용 가능하며 해당 효소가 포함되어 있는 시판되는 DNA 추출키트 Powerprep DNA extraction from food and feed kit (Kogene Biotech, Seoul, Korea)를 사용하였다. DNA prep은 제조사에서 제공하는 방법에 따라 실시하였다.
성능/효과
퇴비 배양액에서 DNA 추출을 위하여 가열 시간을 다르게 하였을 때 4종 식중독균 검출 결과를 비교하였다(Table 2). 10분간 가열을 통해서는 2가지로 구분한 저농도와 고농도에서 모두 검출되지 않았으며, 20분 가열에서는 4종균 모두 고농도로 초기 접종한 배양액에서만 유전자 증폭 결과 검출되었고 검출 Ct값은 20.4-30.2 범위를 나타내었다. 30분 가열에서는 4종 식중독균이 저농도와 고농도에서 모두 검출되었으며, 60분 가열에서는 고농도의 Ct값(15.
적용한 방법은 가열 처리, 유기용매 및 흡착제 처리, 효소 처리의 3가지로 구분할 수 있으며, 각 방법에 따른 DNA의 검출 효율을 실험 결과로 나타내었다. 가열 처리 방법에서는 가열 시간의 증가에 따라 DNA 검출 효율이 높아지는 경향을 나타냈으며, 유기용매 및 흡착제는 효과를 나타내지 않았고, 효소 처리의 경우에는 그람 양성균 보다는 그람 음성균의 DNA가 추출 효율이 더 높은 것으로 나타났다. 결론적으로 퇴비에서 30분 이상의 가열 처리와 효소의 처리를 통한 DNA 추출 방법은 real-time PCR을 적용한 식중독균 검출에 적합한 것으로 판단된다.
가열 처리 방법에서는 가열 시간의 증가에 따라 DNA 검출 효율이 높아지는 경향을 나타냈으며, 유기용매 및 흡착제는 효과를 나타내지 않았고, 효소 처리의 경우에는 그람 양성균 보다는 그람 음성균의 DNA가 추출 효율이 더 높은 것으로 나타났다. 결론적으로 퇴비에서 30분 이상의 가열 처리와 효소의 처리를 통한 DNA 추출 방법은 real-time PCR을 적용한 식중독균 검출에 적합한 것으로 판단된다.
지금까지 퇴비에서 식중독균 검출을 위한 real-time PCR 분석 방법의 적용을 위하여 가열 처리, 효소, 유기용매 및 흡착제에 의한 DNA 추출 결과를 비교하였다. 그 결과 30분 가열 처리와 proteinase K 효소 처리를 통하여 퇴비 배양액에서 DNA를 추출하고 real-time PCR을 사용한 식중독균의 검출이 가능한 것으로 판단되었다. 향후 이러한 연구결과는 농산물의 안전성 확보를 위하여 농업자재로 사용되는 퇴비, 가축분퇴비 등의 식중독균 분석에 유용하게 사용될 것으로 사료된다.
Proteinase K가 포함된 DNA 추출 키트를 사용하여 저농도와 고농도의 2가지로 구분한 퇴비 배양액에서 DNA 추출을 수행하고 real-time PCR로 분석하였을 때 미생물별 검출 결과를 Table 3에 나타내었다. 퇴비 배양액에 proteinase K를 처리하면 효과적으로 DNA를 추출하여 유전자 증폭을 통해 미생물 검출이 가능하였으며 저농도 초기 접종 배양액보다 고농도 배양액의 Ct값이 낮게 나타나므로 접종량에 따라 배양 이후 존재하는 미생물 수준의 차이에 기인하는 것으로 판단할 수 있다. 하지만 B.
후속연구
그 결과 30분 가열 처리와 proteinase K 효소 처리를 통하여 퇴비 배양액에서 DNA를 추출하고 real-time PCR을 사용한 식중독균의 검출이 가능한 것으로 판단되었다. 향후 이러한 연구결과는 농산물의 안전성 확보를 위하여 농업자재로 사용되는 퇴비, 가축분퇴비 등의 식중독균 분석에 유용하게 사용될 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
국제식품규격위원회의 역할은 무엇인가?
전 세계적으로 농산물 생산환경에 대한 위생관리는 강조되고 있다. 2017년 국제식품규격위원회(CODEX)에서는 위생적인 신선 과일 및 채소의 생산을 위하여 생산환경에서 용수, 비료, 토양 등의 구체화된 위생관리 내용을 포함하여 신선 과채류에 대한 위생실행규범을 개정하였으며, 특히 비료의 경우에는 부숙, 살균 등을 통하여 병원균을 감소시키고 농산물의 교차오염을 예방할 수 있도록 규정하고 있다1). 국내에서는 비료 공정규격설정 및 지정에서 가축분퇴비, 퇴비, 부숙겨 등 부산물비료는 Escherichia coli O157:H7과 Salmonella spp.
농산물 생산을 위한 부산물 비료로 무엇이 있는가?
에 대해서 불검출 기준을 적용하고 있다2). 비료는 식물에 영양을 주거나 식물의 재배를 돕기 위하여 흙에서 화학적 변화를 가져오게 하는 토양개량용 자재를 지칭하며3), 부산물비료는 가축분뇨, 음식물폐기물, 톱밥 등의 유기성자원을 혼합한 비료이다2,4). 이중 가축분뇨, 가축분퇴비 등에는 다양한 종류의 병원성미생물이 포함될 수 있으며, 대표적인 식중독균으로는 pathogenic E.
국내 비료 공정 규격 설정 및 지정에서 불검출 기준을 적용하고 있는 것은 무엇인가?
2017년 국제식품규격위원회(CODEX)에서는 위생적인 신선 과일 및 채소의 생산을 위하여 생산환경에서 용수, 비료, 토양 등의 구체화된 위생관리 내용을 포함하여 신선 과채류에 대한 위생실행규범을 개정하였으며, 특히 비료의 경우에는 부숙, 살균 등을 통하여 병원균을 감소시키고 농산물의 교차오염을 예방할 수 있도록 규정하고 있다1). 국내에서는 비료 공정규격설정 및 지정에서 가축분퇴비, 퇴비, 부숙겨 등 부산물비료는 Escherichia coli O157:H7과 Salmonella spp.에 대해서 불검출 기준을 적용하고 있다2). 비료는 식물에 영양을 주거나 식물의 재배를 돕기 위하여 흙에서 화학적 변화를 가져오게 하는 토양개량용 자재를 지칭하며3), 부산물비료는 가축분뇨, 음식물폐기물, 톱밥 등의 유기성자원을 혼합한 비료이다2,4).
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