[논문]꾸지뽕나무 열매에서 추출한 4'-O-methylalpinumisoflavone의 항산화 및 미백 효과

류지효; 노준용; 김수라; 이금산; 이동호; 김관회; 김형우

doi:10.15188/kjopp.2019.12.33.6.349

[국내논문] 꾸지뽕나무 열매에서 추출한 4'-O-methylalpinumisoflavone의 항산화 및 미백 효과
Anti-oxidative and Whitening Efects of 4'-O-methylalpinumisoflavone Isolated from Fruit of Maclura Tricuspidata Carrière 원문보기

동의생리병리학회지 = Journal of physiology & pathology in Korean Medicine, v.33 no.6, 2019년, pp.349 - 355

류지효 (부산대학교 한의학전문대학원 약물의학부) , 노준용 (부산대학교 한의학전문대학원 약물의학부) , 김수라 ((주)세원생명공학 바이오연구개발센터) , 이금산 (원광대학교 한의과대학 본초학교실) , 이동호 (고려대학교 생명과학대학 생명공학부) , 김관회 (부산대학교 의과대학 약리학교실) , 김형우 (부산대학교 한의학전문대학원 약물의학부)

Abstract ▼ AI-Helper

The anti-inflammatory effects of 4'-O-methylalpinumisoflavone (OMAI) has been reported in recent years. To develop effective and safe skin whitening agents, we investigated the anti-oxidative and melanogenic effects of OMAI isolated from fruit of Maclura tricuspidata Carrière (Cudrania tricuspidata) in macrophage and melanoma cell lines. In our results, OMAI showed effective superoxide scavenging activity and suppressed production of lipopolysaccharide (LPS)-induced intracellular reactive oxygen species (ROS) in RAW264.7 cells. In addition, α-melanocyte stimulation hormone (MSH)-induced production of melanin was also reduced by OMAI in B16F10 cells. Finally, OMAI significantly inhibited tyrosinase activity in B16F10 cells. These results suggest that OMAI suppressed melanin production via scavenging reactive oxygen species and inhibition of tyrosinase activity.

Keyword

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

최근 들어 피부 미용에 대한 수요가 증가함에 따라, 피부 과다 색소침착을 해결하기 위해 다양한 피부 미백 성분이 개발되고 있다. 연구자들은 미백 성분을 스크리닝하기 위하여 다양한 후보 물질들의 멜라닌 합성 억제 효과를 관찰한다. 멜라닌 합성은 tyrosinase, tyrosinase-related protein(TRP) 1, TRP2와 같은 enzymes에 의해 조절되는데, 특히 tyrosinase는 rate-limiting enzyme으로 알려져 있다.
따라서 인체에 무해하면서도 피부 미백 효과가 탁월한 성분을 발굴하고자 육상 식물, 해양 자원, 한약재 등의 천연물에서 유래된 물질을 활용하는 연구가 다각도로 진행되고 있다²¹⁾. 따라서 본 연구에서는 꾸지뽕나무의 과실에서 추출된 OMAI의 활성산소 소거 활성 및 멜라닌 생성 저해 효과를 확인하였다.
또한, mouse 유래 melanoma cell뿐만 아니라 human keratinocyte cell line인 HaCaT cell의 생존율에 OMAI가 미치는 영향을 확인하고자, MTT assay를 실시했다. 그 결과, B16F10 cells에서의 결과와 같이 5 μg/ml 농도에서는 세포 생존율에 거의 영향이 없었으나, 10 μg/ml를 처리한 군에서는 약 4.
OMAI의 항산화 효과를 확인하기 위하여, OMAI의 superoxide radical 소거 효과를 확인했다. 그 결과 OMAI 1, 5, 10 μg/ml에서의 superoxide radical 소거 능력은 각각 34.
멜라닌 생성을 억제하는 효능을 가진 OMAI가 tyrosinase 활성에는 어떤 영향을 미치는지 확인하고자 B16F10 cell 내에서 tyrosinase 활성 저해 효과를 확인하였다. 그 결과, 아무런 처리도 하지 않은 음성 대조군의 tyrosinase 활성을 100%로 했을 때, α-MSH만 처리한 군에서는 124.
본 연구에서는 꾸지뽕나무 열매에서 추출한 OMAI을 이용하여 murine melanoma cell line인 B16F10 cells에서 α-MSH로 유도된 멜라닌 생성에 대한 억제 효과 및 항산화 효과를 검토하여 기존의 피부 미백 성분보다 안전하고 효과적인 미백 효능을 가지는 미백제로의 유용성을 검토하고자 하였고 다음과 같은 결론을 도출했다.
. 따라서 본 연구에서는 꾸지뽕나무 열매로부터 추출한 OMAI의 피부 미백 성분으로서의 유용성을 확인하고자 하였다.
우수한 항산화 효과를 가지는 시료는 기능성 화장품 시장에서 피부 진정, 항염증, 미백 기능성 후보 물질로서 각광을 받는다. 이러한 추세를 반영하여 꾸지뽕나무 열매에서 추출한 OMAI의 피부 미백 효과를 좀 더 구체적이고 직접적으로 확인하고자, B16F10 cells를 이용하여 멜라닌 생성 정도에 OMAI가 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과, 최저 투여 농도인 0.

제안 방법

세포 생존율은 3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2-5-diphenytetrazolium bromide(MTT, Sigma, Mo, US)를 이용하여 측정하였다. 측정과정을 요약하면, B16F10 cells 및 HaCaT cells를 각각 24 well plate에 1×10⁵ cells/well로 접종한 후 37℃에서 세포가 약 80% 이상 부착될 때까지 배양하였다.
측정과정을 요약하면, B16F10 cells 및 HaCaT cells를 각각 24 well plate에 1×10⁵ cells/well로 접종한 후 37℃에서 세포가 약 80% 이상 부착될 때까지 배양하였다. 하루간의 배양이 끝난 후, phenol red-free DMEM 배지로 교체하고 24시간 동안 OMAI 및 alpinumisoflavone(AI)를 각 농도별로 처리 하였다. 24시간의 배양이 끝난 후, 배지를 제거하고, MTT 용액(500 μg/ml)을 첨가하여 30분 동안 37℃에서 다시 반응시켰다.
Superoxide radical 소거 효과는 Furuno K, et al.²⁹⁾ 및 Sim GS, et al.³⁰⁾에 소개된 방법을 변형하여 측정하였다. 측정 원리는 Xanthine/xanthine oxidase 반응에서 생성된 superoxide radical을 nitroblue tetrazolium(NBT)으로 검출하는 것이며 개략적 방법은 다음과 같다.
7 세포를 24 well plate에 1×10⁵ cells/well로 접종한 후 37℃에서 세포가 약 80% 이상 부착될 때까지 배양하였다. 세포가 충분히 부착되고 안정화된 후, phenol red-free DMEM으로 배지에 OMAI를 각 농도별로 처리하고 24시간 동안 배양하였고, lipopolysaccharide(LPS, Lonza) 100 ng/ml을 각 well에 첨가한 후 24시간 동안 추가로 배양하였다. 배양이 끝난 다음, carboxy-H2DCF-DA 100 μM/well 첨가하고 30분간 37℃에서 반응시킨 후 phosphate buffered saline(PBS)를 이용하여 2번 세척하였다.
측정과정을 간략히 정리하면, B16F10 cells를 6 well plate에 3×10⁵ cells/well로 접종한 후 37℃에서 세포가 약 80% 이상 부착될 때까지 배양하였다. 이후, 배지를 제거하고 phenol red-free DMEM으로 교체한 다음, 각 농도별로 OMAI를 첨가하고 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 α-MSH 200 nM을 각 well에 첨가하고, 48시간 동안 추가로 배양한 다음, 배지를 회수하고, microplate reader(Tecan, Männedorf, Switzerland)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
06 %의 세포 생존율 감소가 확인되었다. 이러한 결과가 OMAI의 구조적 특성 때문인지 확인하기 위해 꾸지뽕나무 열매에서 추출되었으며, OMAI와 구조적 유사성을 가진 AI를 이용하여 동일한 방법과 조건으로 MTT assay를 실시했다. 그 결과 alpinumisoflavone(AI)을 처리한 군에서는 OMAI를 처리한 군과 달리 현저하게 세포 생존이 저해되어 AI를 20 μg/ml 처리한 군에서는 대조군에 비해 약 53.
꾸지뽕나무 열매에서 추출한 OMAI가 피부 미백 성분으로서의 효용성이 있는지 확인하고자, B16F10 cells를 이용하여 멜라닌 생성 정도에 OMAI가 미치는 영향을 확인하였다. 멜라닌 생성량을 측정한 결과, OMAI는 농도 의존적으로 멜라닌 생성량을 감소시키는 경향이 관찰되었다.

대상 데이터

본 연구에 사용한 OMAI는 고려대학교 생명과학대학 생명공학부에서 제공받았다. Lui Y.
본 실험에 사용한 HaCaT cells(human keratinocyte cell line)은 Cell lines Service(CLS, Eppelheim, Germany), RAW264.7 cells(murine macrophage cell line) 및 B16F10 cells(murine melanoma cell line)는 American Type Culture Collection(Rockville, MD, US)에서 구매하였다. 각 세포는 10% fetal bovine serum(Gibco BRL, MD, US), 1% penicillin/streptomycin을 함유한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Hyclone, Logan, UT, US)을 이용하여 37℃, 5% CO₂ 세포 배양기에서 배양하였다.
반응 후 20 mU/ml xanthine oxidase를 첨가하여 37℃에서 25분간 추가로 반응한 후, microplate reader(Tecan, Männedorf, Switzerland)를 이용하여 565nm에서 흡광도를 측정한다. 양성 대조군으로 arbutin 및 3-t-butyl-4-hydroxyanisole(BHA)을 사용하였다.

데이터처리

연구의 결과는 평균±표준편차의 형태로 표기했으며, P값이 0.05 미만인 것을 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
모든 통계학적 비교는 one way ANOVA test를 통하여 이루어졌고 군간 비교에는 Dunnett test를 이용했으며, Prism 5 (Ver. 5.01, GraphPad Software Inc., CA, US)가 사용되었다. 연구의 결과는 평균±표준편차의 형태로 표기했으며, P값이 0.

이론/모형

OMAI의 미백 활성을 평가하기 위해 melanin 함량 정도를 식품의약품안전평가원의 기능성화장품의 유효성평가를 위한 가이드라인 Ⅰ³¹⁾의 방법을 참고로 하여 측정하였다. 측정과정을 간략히 정리하면, B16F10 cells를 6 well plate에 3×10⁵ cells/well로 접종한 후 37℃에서 세포가 약 80% 이상 부착될 때까지 배양하였다.
The Effects of OMAI on Cell Viability. Cytotoxicity caused by OMAI was measured MTT assay. B16F10 cells (A) and HaCaT cells (B) were treated with indicated concentrations of OMAI for 24h prior to analyses.

성능/효과

양성 대조군으로 사용한 arbutin과 BHA 10 μg/ml(최대 처리 농도) 처리군에서는 각각 24.68±2.128 %, 35.15±0.5364%의 superoxide radical 소거 효과가 나타났다(Table 1).
그 결과 OMAI 1, 5, 10 μg/ml에서의 superoxide radical 소거 능력은 각각 34.04±1.41%, 51.39±0.9394%, 57.19±0.7364%로 농도 의존적으로 증가하였다.
그 결과, B16F10 cells에서의 결과와 같이 5 μg/ml 농도에서는 세포 생존율에 거의 영향이 없었으나, 10 μg/ml를 처리한 군에서는 약 4.58%의 세포 생존율 감소가 나타났고, 20 μg/ml을 처리한 군에서는 약 7.8 %의 세포 생존율 감소가 확인되었다.
그 결과 alpinumisoflavone(AI)을 처리한 군에서는 OMAI를 처리한 군과 달리 현저하게 세포 생존이 저해되어 AI를 20 μg/ml 처리한 군에서는 대조군에 비해 약 53.37%의 세포 생존이 감소되었다(Fig. 2A).
세포의 생존에 영향이 없는 OMAI의 농도를 확인하기 위하여 B16F10 cells에 OMAI를 각각 5, 10, 20 μg/ml를 처리하고 24시간 후 MTT assay를 실시한 결과, 10 μg/ml를 처리한 군에서는 약 3.1 %의 세포 생존율 감소가 나타났고, 20 μg/ml을 처리한 군에 서는 약 9.06 %의 세포 생존율 감소가 확인되었다.
5364%의 superoxide radical 소거 효과가 나타났다(Table 1). 또한, murine macrophage cell line인 RAW264.7 cells를 이용하여 세포 내 활성산소 생성에 OMAI가 어떤 영향을 미치는지 확인한 결과, superoxide radical 소거 실험과 동일하게 OMAI 농도 의존적으로 세포 내 활성산소 생성이 감소되었다(Fig. 3).
아무런 처리도 하지 않은 음성 대조군의 멜라닌 합성 정도를 100%로 했을 때, α-MSH만 처리한 군에서 167.28%, OMAI 1 μg/ml와 α-MSH를 처리한 군에서 131.64%, OMAI 5 μg/ml와 α-MSH를 처리한 군에서 72.23%가 측정되었으며, 양성 대조군으로 사용한 arbutin 5 μg/ml와 α-MSH를 처리한 군에서는 104.12%의 멜라닌 합성 정도가 확인되었다(Fig. 4).
그 결과, 아무런 처리도 하지 않은 음성 대조군의 tyrosinase 활성을 100%로 했을 때, α-MSH만 처리한 군에서는 124.58%로 증가하였고, OMAI 1 μg/ml와 α-MSH를 처리한 군에서는 127.62%로 약간 증가했다가, OMAI 5 μg/ml와 α-MSH를 처리한 군에서는 96.07%로 현저하게 tyrosinase 활성이 감소되었다.
꾸지뽕나무 열매에서 추출한 OMAI가 피부 미백 성분으로서의 효용성이 있는지 확인하고자, B16F10 cells를 이용하여 멜라닌 생성 정도에 OMAI가 미치는 영향을 확인하였다. 멜라닌 생성량을 측정한 결과, OMAI는 농도 의존적으로 멜라닌 생성량을 감소시키는 경향이 관찰되었다. 아무런 처리도 하지 않은 음성 대조군의 멜라닌 합성 정도를 100%로 했을 때, α-MSH만 처리한 군에서 167.
또한, B16F10 cell에서 α-MSH로 유도된 멜라닌 생성을 억제했고, 멜라닌 합성 반응에 관여하는 tyrosinase 활성을 억제했다.
본 연구의 결과를 살펴보면, OMAI는 유의한 수준으로 tyrosinase 활성을 억제시켰으며 최고 농도인 5 μg/ml에서는 α-MSH를 처리하지 않은 대조군 수준의 tyrosinase 활성을 나타냄으로써 양성 대조군인 arbutin보다 우수한 tyrosinase 활성 저해효과를 나타냈다.
또한, 최고 농도인 5 μg/ml에서의 저해 효과가 양성 대조군으로 사용된 arbutin보다 높았다.
그 결과, 최저 투여 농도인 0.5 μg/ml를 사용한 군에서도 멜라닌 생성 저해 효과가 관찰되었으며, 이러한 저해 효과는 농도 의존적으로 증가되었다.
이러한 연구 결과로부터 OMAI의 세포 독성은 구조적 특성에 기인한 것으로 판단되며 세포 내 연구를 위한 OMAI의 적정 농도는 10 μg/ml 미만임을 알 수 있다.
본 연구의 결과에서 OMAI는 10 μg/ml 이상에서 유의한 수준의 세포 독성을 나타냈고, OMAI와 유사한 구조를 가진 AI는 5 μg/ml 처리 군에서도 유의한 수준의 세포 독성을 나타냈으며, 모든 처리 농도에서 OMAI보다 높은 세포 독성을 보였다(Fig. 2).
이상의 결과로 꾸지뽕나무 열매에서 추출한 OMAI는 활성산소를 제거함으로써 α-MSH에 의해 유발되는 tyrosinase의 활성을 억제하고, 그 결과 멜라닌 생성을 억제하는 것으로 보인다.
또한, B16F10 cell은 mouse 유래의 melanoma 세포로 실험적으로 사용하기 위해 변형이 가해진 상태이기 때문에 인간 유래의 정상 세포군에 대한 세포 독성을 확인하여 참고할 필요가 있다. 이러한 이유로, 본 연구에서 HaCaT cells의 생존율에 OMAI가 미치는 영향을 확인한 결과, B16F10 cell에서와 유사한 수준의 세포 독성이 관찰되었다. 이러한 결과로부터 OMAI가 B16F10 cell과 같은 생쥐 유래 종양세포와 인간 유래 정상에서 유사한 수준의 세포 독성을 나타낸 다른 것을 알 수 있다.
이러한 이유로 항산화 물질은 일련의 산화 과정을 억제함으로써 멜라닌의 생성을 억제하고, 생성된 활성산소를 제거함으로써 멜라닌 생성을 억제할 수 있는 피부 미백 물질로 인식되고 있다³⁸⁾. 본 연구의 결과를 살펴보면, OMAI의 superoxide radical 소거 능력은 농도 의존적으로 증가하였고 동일 농도에서 arbutin과 BHA보다 소거 능력이 우수하였다(Fig. 3). 이러한 결과에서 OMAI는 arbutin과 BHA보다 높은 superoxide radical 소거 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다.
3). 이러한 결과에서 OMAI는 arbutin과 BHA보다 높은 superoxide radical 소거 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다.
또한, OMAI가 세포 내 활성산소 생성에 미치는 영향을 확인한 결과, superoxide radical 소거 실험과 동일하게 농도 의존적으로 세포 내 활성산소 생성이 감소되었다(Fig. 4). 따라서 꾸지뽕나무 열매에서 추출한 OMAI는 기존의 피부 미백제 성분인 arbutin과 BHA보다 비교적 우수한 항산화 효과를 나타내는 것으로 사료된다.
4). 따라서 꾸지뽕나무 열매에서 추출한 OMAI는 기존의 피부 미백제 성분인 arbutin과 BHA보다 비교적 우수한 항산화 효과를 나타내는 것으로 사료된다.
또한, 최고 농도인 5 μg/ml에서의 저해 효과가 양성 대조군으로 사용된 arbutin보다 높았다. 이러한 결과는 OMAI가 기존의 피부 미백 성분인 arbutin보다 더 우수한 멜라닌 생성 저해 효과를 가졌음을 시사한다.
본 연구의 결과를 살펴보면, OMAI는 유의한 수준으로 tyrosinase 활성을 억제시켰으며 최고 농도인 5 μg/ml에서는 α-MSH를 처리하지 않은 대조군 수준의 tyrosinase 활성을 나타냄으로써 양성 대조군인 arbutin보다 우수한 tyrosinase 활성 저해효과를 나타냈다. 이러한 결과는 OMAI가 피부 미백 기능성 원료로서의 가능성이 있음을 의미하며 OMAI는 tyrosinase 활성 억제를 통하여 멜라닌 생성을 억제할 수 있음을 의미한다.
본 연구의 결과에서 꾸지뽕나무 열매에서 추출한 OMAI는 효과적으로 superoxide를 소거하며, RAW264.7 cell에서 LPS에 의해 유도된 세포 내 활성산소 생성을 현저하게 억제했다. 또한, B16F10 cell에서 α-MSH로 유도된 멜라닌 생성을 억제했고, 멜라닌 합성 반응에 관여하는 tyrosinase 활성을 억제했다.
이상의 결과로 꾸지뽕나무 열매에서 추출한 OMAI는 활성산소를 제거함으로써 α-MSH에 의해 유발되는 tyrosinase의 활성을 억제하고, 그 결과 멜라닌 생성을 억제하는 것으로 보인다. OMAI 는 기존의 항산화 효능이 있는 tyrosinase 억제제보다 높은 항산화 효능 및 멜라닌 생성 억제 효과를 나타내는 것으로 보아 피부 미백 성분으로 활용도는 높을 것이라 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	유해 자외선은 무엇인가?	피부 과다색소침착을 유발하는 원인 중 가장 잘 알려진 것은 유해 자외선이다. 자외선에 의해 피부 세포 내에서는 활성산소를 생성되고, 생성된 활성산소에 의해 DNA가 손상되어 산화적 스트레스가 유발된다.
	피부는 왜 멜라닌을 생산하는 가?	인간의 신체를 덮고 있는 피부는 유해한 자외선 및 물리화학적 외부 독성물질로부터 개체를 보호하기 위해 피부 표피층에 있는 melanocyte의 melanosome에서 멜라닌을 생산한다. 이러한 과정은 정상 과정이라고 할 수 있으나, 과생성된 멜라닌이 축적되어 피부에 착색되면 피부 과다색소침착(hyperpigmentation)을 유발한다 21).
	항산화 물질이 피부 미백 물질로 인식되고 있는 이유는?	피부 과다색소침착을 유발하는 원인 중 가장 잘 알려진 것은 유해 자외선이다. 자외선에 의해 피부 세포 내에서는 활성산소를 생성되고, 생성된 활성산소에 의해 DNA가 손상되어 산화적 스트레스가 유발된다. 또한 활성산소는 tyrosinase와 같이 tyrosine의 산화 과정에 작용하여 멜라닌 생성을 증가시킨다. 따라서 멜라닌 생성을 억제하는 것뿐만 아니라 세포 내 활성산소를 제거하는 것 또는 활성산소 생성을 억제하는 것은 피부 미백 성분의 중요한 기능으로 볼 수 있다34-38). 이러한 이유로 항산화 물질은 일련의 산화 과정을 억제함으로써 멜라닌의 생성을 억제하고, 생성된 활성산소 를 제거함으로써 멜라닌 생성을 억제할 수 있는 피부 미백 물질로 인식되고 있다38).

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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