[논문]HPLC와 중수소 충돌기체 ICP/MS를 이용하여 분석한 셀레노단백질과 한국인 직장암과의 상관관계 연구

이서영; 박용남

doi:10.5012/jkcs.2019.63.6.420

HPLC와 중수소 충돌기체 ICP/MS를 이용하여 분석한 셀레노단백질과 한국인 직장암과의 상관관계 연구
A Study for the Relation Between Selenoproteins and Korean Rectal Cancer Using Deuterium Collision Gas HPLC-ICP/MS 원문보기

대한화학회지 = Journal of the Korean Chemical Society, v.63 no.6, 2019년, pp.420 - 426

이서영 (한국교원대학교 화학교육과) , 박용남 (한국교원대학교 화학교육과)

초록
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본 연구에서는 중수소를 충돌기체로 사용한 ICP-MS와 ammonium formate를 용리액으로 사용한 친화 크로마토그래피를 이용하여 한국인의 혈청에서의 셀레노단백질 GPx, SelP 및 SeAlb을 분리하고 후 칼럼 동위원소 희석법으로 정확히 정량하였다. 인증기준물질인 BCR 639 (133±12 ng g^-1)에 대하여 측정한 셀레늄 총량값은 130±6 ng g^-1으로 정확한 결과를 보여주었다. 이 방법을 적용하여 한국인의 직장암 그룹 25명과 통제군 30명의 혈청 속 셀레노단백질을 분석한 결과 셀레늄 총량에 대하여 직장암 그룹이 84±27 ng g^-1, 통제군이 119±28 ng g^-1으로 직장암 그룹이 통제군 보다 95% 신뢰수준에서 통계적으로 더 작은 결과를 보여 주었다. 즉 t 계산값은 4.93으로 95% 신뢰수준의 2.04보다 높았다. 이러한 경향은 남성보다 여성에서, 60대 이상의 고 연령층일 수록 더욱 뚜렷하였다. 각 셀레노단백질의 분포를 조사한 결과, 두 그룹은 서로 비슷하였고 각 셀레노단백질과 직장암에 따른 특별한 경향성은 보이지 않았다. 또한 직장암 병기가 진행됨에 따라 셀레노단백질 중 GPx의 농도가 약간 감소하는 경향이 있었고, 셀레늄 총량의 경우 2기에서 약간 증가하는 특징을 보였다.

Abstract ▼ AI-Helper

Selenoproteins,in Korean blood serum, GPx, SelP, and SeAlb were separated and determined with the use of HPLC-ICP/MS. Deuterium was used as a collision gas and affinity column with ammonium formate was used as an eluting solvent for the accurate quantitation of selenoproteins in human blood serum. Certified reference material BCR 639 (133±12 ng g-1) was tested for the accuracy and the result was satisfactory 130±6 ng g-1. Blood serum for the rectal cancer and controlled groups were collected and analyzed to give 84±27 ng g-1, and 119±28 ng g-1, respectively. The difference was statistically obvious when t-test was performed (tcal 4.93 > t95% 2.04). The decrease for cancer group was more obvious for female and aged group. The distributions of three selenoproteins were similar with each other, which means rectal cancer group did not show any specificity for any selenoproteins. As cancer developed, GPx showed a slight decrease but not obvious while the total concentration was increasing particularly at the second stage of cancer.

주제어

표/그림 (10)

그림 Figure 1. Change of sensitivity due to concentration change of mobile phase for (A) Ammonium acetate and (B) ammonium formate.
표 Table 1. Experimental conditions for HPLC ICP/MS
표 Table 2. Distribution of age for rectal cancer group & control group
그림 Figure 2. Comparison of Selenoproteins for rectal cancer and control groups.
표 Table 3. Comparison of Selenoprotein concentrations in Korean blood serum for rectal cancer & control groups
표 Table 4. Comparison of Selenoprotein concentrations in Korean blood serum for rectal cancer & control groups by gender
그림 Figure 3. Comparison of selenoprotein concentrations for age ranges.
표 Table 5. Comparison of Selenoprotein concentrations in Korean blood serum for rectal cancer & control groups with ages
표 Table 6. Concentration of selenoproteins for rectal cancer group with cancer development stage
그림 Figure 4. Comparison of selenoprotein concentration by rectal cancer stage.

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 이러한 동중간섭의 배제와 용리액에 의한 신호의 변화를 최소화시켜 정확한 분석법을 고안하고 혈청내의 셀레노단백질을 분석하여 한국인의 직장암과의 상관관계를 연구하였다.
에서 발표한 바 있다. 연구에서는 용리액의 변화와 실제 암환자에 대한 적용연구이다.

제안 방법

에서는 탄소를 배제한 ammonium nitrate를 용리액으로 사용하여 좋은 결과를 얻을 수 있었으나 토오치 끝부분이나 분무기 끝에서 생기는 염의 결정으로 말미암아 정밀도가 나빠지는 단점이 생겼다. 결국, 본 연구에서는 ammonium formate를 이동상으로 사용하여 분무기의 흐름변화를 없애고 탄소원에 의한 셀레늄의 감도변화를 최소화시켜 분석의 정확도와 정밀도를 높였다.
^13,14 하지만 이 경우에 신호의 세기가 약 1/3로 감소하며 이는 정밀도의 감소로 이어지므로 m/z 80을 측정하는 것이 더 유리하다. 따라서 본 연구에서는 수소 대신 중수소를 충돌셀의 기체로 사용하여 m/z 80에서의 동중간섭을 제거한 ⁸⁰Se신호의 측정을 가능하게 하였다. ¹⁵

대상 데이터

8 atom %)를 사용하였다. HPLC는 Hitachi의 L-6200A (Hitachi, Tokyo, Japan)를 사용하였다. 시료 주입에 사용한 밸브는 Rheodyne Model 7125(Cotati, CA, USA)이고, 주입량은 100 μL로 일정량을 유지하였다.
ICP-MS는 Agilent Technology회사의 팔중극자 충돌셀이 장착된 모델 7500ce (Agilent, Japan)를 사용하였다. 이때 충돌/반응 기체로 중수소(D₂, 99.
비교를 위해 선행연구19에서 사용된 이동상인 ammonium acetate (≥99.99%, trace metals basis, Sigma-Aldrich, Yongin-si, South Korea)와 ammonium nitrate (98%, Sigma-Aldrich, Yongin, South Korea)를 사용하였다.
99%, trace metals basis, Sigma-Aldrich, Yongin-si, South Korea)와 ammonium nitrate (98%, Sigma-Aldrich, Yongin, South Korea)를 사용하였다. 연동 펌프를 통해 실시간으로 주입되는 셀레늄 농축 동위원소 표준용액은 ⁷⁸Se 존재비가 97.9%인 ⁷⁸Se 동위원소 용액(Trace Sciences International Corp., DE, USA)을 사용하였다. 실험조건을 Table 1에 나타내었다.
이동상으로 ammonium formate (≥99.995%, trace metals basis, Sigma-Aldrich, Yongin, South Korea)를 사용하였다.
ICP-MS는 Agilent Technology회사의 팔중극자 충돌셀이 장착된 모델 7500ce (Agilent, Japan)를 사용하였다. 이때 충돌/반응 기체로 중수소(D₂, 99.8 atom %)를 사용하였다. HPLC는 Hitachi의 L-6200A (Hitachi, Tokyo, Japan)를 사용하였다.
직장암 환자 혈액은 전남대학교 화순병원 인체자원단위은행에서 제공받은 혈청을 사용하였다. 통제군 혈액은 대한적십자사 충청북도 혈액원에서 제공받은 신선동결 혈장(Fresh Frozen Plasma, FFP)과 충북대학교 인체자원단위은행에서 제공받은 흉통으로 병원을 내원한 환자의 혈청을 사용하였다.
직장암 환자 혈액은 전남대학교 화순병원 인체자원단위은행에서 제공받은 혈청을 사용하였다. 통제군 혈액은 대한적십자사 충청북도 혈액원에서 제공받은 신선동결 혈장(Fresh Frozen Plasma, FFP)과 충북대학교 인체자원단위은행에서 제공받은 흉통으로 병원을 내원한 환자의 혈청을 사용하였다. 이에 대한 정보는 Table 2에 나타내었다.

성능/효과

건강한 인간 혈장의 분석 결과 충돌/반응기체로 D2를 사용하면 혈청 속 Br− 에 의한 간섭을 효과적으로 배제할 수 있었고, 자연 존재비가 가장 높은 80Se를 PCID를 이용하는 것이 가능하였다.
두 집단 모두에서 남성이 여성보다 셀레노단백질 농도가 높았다. 성별에 따른 셀레늄 총량의 차이는 통제군의 경우 10 ng g^-1, 직장암 그룹은 19 ng g^-1 이었고, SelP에서 그 차이가 가장 컸다.
Se를 PCID를 이용하는 것이 가능하였다. 또한 이동상으로 ammonium formate를 사용하면 이동상의 농도변화에 따른 셀레늄의 감도변화가 작았고, 정밀한 실험결과를 보여주었다.
본 연구에서는 결과를 잘 살펴보면 통제군의 경우에는 연령과 혈청 속 셀레노단백질 농도의 상관관계가 크지 않았지만 암환자 군에서는 감소경향이 매우 뚜렷하게 나타나고 있는 특징을 보여준다. 즉, 통제군에서는 연령이 높아짐에 따라 셀레노단백질의 농도는 조금 감소(127 ng g^-1에서 114 ng g^-1) 하였지만, 직장암군에서는 현저하게 (137 ng g^-1에서 73 ng g^-1까지) 감소한다.
셀레노단백질 3종의 분포비율은 GPx, SelP, SeAlb가 통제군에서 21%, 66%, 13%이고 직장암 그룹에서는 21%, 67%, 12%로 서로 일치하였고, 두 집단 간 평균연령도 차이가 없다. 하지만 셀레노단백질의 농도는 큰 차이를 보이는데, 직장암 그룹은 통제군보다 셀레늄 총량이 29% 낮았고, 종별로는 GPx, SelP, 및 SeAlb가 각각 31%, 28%, 32% 낮았다.
암환자군과 통제군의 비교에서 총 셀레늄은 직장암 그룹이 통제군보다 현저히 낮았고(29%), 각 종별로는 어떤 특징을 보여주지 않았다. 이러한 감소경향은 남성보다 여성의 경우에, 그리고 무엇보다 60대 이상의 고연령대에서 매우 뚜렷하였다.
인증표준물질 BCR-639 (certified Se level 133±12 ng g-1)을 사용하여 정확도를 검증한 결과, 셀레늄 총량은 130 ± 6 ng g-1(95% 신뢰구간)으로서 이 방법은 좋은 정확도와 정밀도를 보여주었다.
직장암 그룹과 통제군의 혈청 속 셀레노단백질 분석 결과, 두 그룹은 서로 비슷한 분포를 보였으나, 남성이 여성보다 셀레노단백질의 농도가 높았으며, 연령이 증가할수록 셀레늄 총량은 감소하는 경향을 보였다.
직장암의 진행에 따른 농도의 경향성은 우선 GPx가 아주 조금 감소하는 경향을 볼 수 있었다. 이와 관련하여 Schrauzer⁹는 셀레늄의 항암작용이 GPx와 우선적으로 관련되어 있음을 밝힌바 있었다.
셀레노단백질 3종의 분포비율은 GPx, SelP, SeAlb가 통제군에서 21%, 66%, 13%이고 직장암 그룹에서는 21%, 67%, 12%로 서로 일치하였고, 두 집단 간 평균연령도 차이가 없다. 하지만 셀레노단백질의 농도는 큰 차이를 보이는데, 직장암 그룹은 통제군보다 셀레늄 총량이 29% 낮았고, 종별로는 GPx, SelP, 및 SeAlb가 각각 31%, 28%, 32% 낮았다. 이것은 Hughes²⁴가 유럽인을 대상으로 연구에서 낮은 혈장 셀레늄 농도는 직장암 위험과 관련이 있음을 보고한 것이나 대장암 환자의 혈장 셀레늄 농도는 대조군보다 낮으며 또한 농도가 낮은 집단일수록 대장 샘종에 대한 위험도가 더 증가함을 보고한 Russo²⁵의 연구와 일치하는 결과이다.

후속연구

3−5 한편 한국인의 대장암은 지난 20년간 2배 이상 급속도로 증가하여 10만명당 45명으로 전 세계 184개국 중 발병률 1위를 기록한 암이며 따라서 대장암의 일종인 직장암 역시 관심을 두고 연구되어야 할 분야이다.
본 연구에서는 HEP, BLUE 칼럼으로는 분리된 3가지 peak중, 처음의GPx 피크에는 GPx를 포함하여 칼럼에 결합하지 않는 모든 셀레늄 화학종(selenate, selenite 등)이 있으므로 경우에 따라 샘플을 정제하여야 할 것이다. 또한 좀 더 확실한 결론을 위하여서는 더 많은 수의 표본으로 체내 셀레늄 상태에 영향을 주는 인자들을 통제한 조건에서 추가 연구가 진행되어야 할 것으로 보인다.
직장암 병기에 따라서는 어떤 특별한 상관관계를 보여주지 않았다. 본 연구를 통해 혈청 속 셀레노단백질의 농도가 직장암 진단의 보조적인 지표로 활용될 가능성이 있음을 확인할 수 있었다.
본 연구에서는 HEP, BLUE 칼럼으로는 분리된 3가지 peak중, 처음의GPx 피크에는 GPx를 포함하여 칼럼에 결합하지 않는 모든 셀레늄 화학종(selenate, selenite 등)이 있으므로 경우에 따라 샘플을 정제하여야 할 것이다. 또한 좀 더 확실한 결론을 위하여서는 더 많은 수의 표본으로 체내 셀레늄 상태에 영향을 주는 인자들을 통제한 조건에서 추가 연구가 진행되어야 할 것으로 보인다.
^7,8 또한, 여러 화학종들을 분리하고 분석하기 위하여서는 크로마토그래피를 적용하여야 하고 정확한 정량을 위하여서는 후 칼럼 동위원소 희석법(Post Column Isotope Dilution, PCID)이 필요하다. 이 분석 방법은 혈청 내 셀레노단백질의 각 화학종들에 대한 정확한 결과를 제공할 수 있을 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	혈청 속 셀레노단백질의 정확한 분석을 방해하는 요인 중 가장 큰 것은 무엇인가?	이 때 혈청 속 셀레노단백질의 정확한 분석을 방해하는 몇 요인 중 가장 큰 것은 혈청 내 Br에 의한 동중간섭이다. 셀레늄분석에는 80[Ar2+]에 의한 동중간섭이 매우 크므로 반드시 제거되어야 하고 이러한 목적으로 충돌셀이 장착된 ICP/MS를 이용하게 된다.
	셀레늄의 특징은 무엇인가?	셀레늄은 21세기 비타민으로 주목 받고 있으며 또한 암 의 발병과 예방에도 관여하는 것으로 알려져 있다.1 1969 년 Shamberger2가 셀레늄의 항암효과를 처음 제시한 이후 현재까지 셀레늄과 암의 상관관계에 대한 연구가 많이 이 루어지고 있다.
	혈청 속 셀레늄 분석에 극미량 수준에서 정확한 분석이 요구되는 이유는 무엇인가?	암과 셀레늄의 상관관계 연구를 위한 혈청 속 셀레늄 분석에는 무엇보다 극미량 수준에서 정확한 분석이 요구된다. 이는 셀레늄이 인체에서 필수 미량원소로써 약 100 µg kg-1의 좁은 농도범위를 갖기 때문이다.6 유도결합 플라즈마 질량분석기(Inductive Coupled Plasma-Mass Spectrometry, ICP-MS)를 이용한 동위원소 측정은 약 0.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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