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제안 방법
- 각 유전자가 도입된 균주를 BL-OMT, BL-PGTM으로 명명하였다. BL-OMT, BL-PGTM균주를 이용하여 quercetin으로부터 isorhamnetin 3-O-glucoside의 생합성 가능성을 알아보기 위해 2 mL LB배지에 각 각의 균주를 배양하여 25℃에서 20시간 동안 각각의 재조합 단백질을 유도하였다. 그 후 각 균주의 밀도를 동일하게 AMM 배지에 현탁 하여 30℃ 배양기에서 생물전환을 하였다.
- 6 mm, Agilent Technologies)과 photodiode array를 이용하였다. HPLC 분석은 A버퍼(0.1% formic acid가 첨가된 3차 증류수)와, B버퍼(0.1% formic acid가 첨가된 acetonitrile)를 사용하였다. HPLC분석프로그램은 0분에 20% B버퍼, 8분에 45% B버퍼, 15분에 70% B버퍼, 17분에 20분까지 90% B버퍼, 20.
- 1% formic acid가 첨가된 acetonitrile)를 사용하였다. HPLC분석프로그램은 0분에 20% B버퍼, 8분에 45% B버퍼, 15분에 70% B버퍼, 17분에 20분까지 90% B버퍼, 20.1분에 12 B버퍼, 25분에 20% B버퍼의 조건을 이용하였다.
- Isorhamnetin 3-O-glucoside의 생합성 최적화 방법을 탐색하기 위해 BL-OMT와 BL-PGTM균주를 동일한 비율로 섞어 25, 30, 37℃에서 각각 생물전환 12시간 후 샘플을 회수하여 분석하였다. 생물전환온도 25℃에서 20.
- 재조합 단백질의 유도시간이 길어지면 재조합 단백질의 inclusion body 형성이 높아져 생물전환율이 줄어드는 것으로 보인다. Quercetin으로부터 isorhamnetin 3-O-glucoside의 생물전환에 미치는 배지의 영향을 알아보기 위하여 5개의 배지(YPD, TB, AAM-glucose, AAM-glycerol, LB)를 테스트하였다. AAM-glycerol배지를 사용하였을 때 가장 높은 52.
- Quercetin의 공급농도가 isorhamnetin 3-O-glucoside의 생합성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, AMM-glycerol배지에 BL-OMT와 BL-PGTM 의 세포 밀도를 OD600 nm에서 2.0:3.0으로 맞춘 후 서로 다른 5개의 농도(200, 300, 400, 500, 600 μM)의 quercetin을 공급하였다.
- 각각의 대장균 세포는 원심분리기를 이용하여 회수하고 10 mL AAM 배지로 간단히 씻고, ampicillin (100 μg/L), 0.1 mM IPTG, quercetin 200 M을 첨가한 AAM배지 25 mL에 각각의 세포 밀도가 2.0이 되게 현탁 하여 30 o C에서 생물전환을 하였다.
- 반응물은 배양 12시간 후 배양액 500 μL를 회수하여 동량의 에틸아세테이트를 첨가하여 2회 반복 추출하여 진공 건조기로 완전히 건조하였다. 건조한 반응 산물은 Dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹여 Varian high performance liquid chromatography (HPLC) 분석에 사용하였다.
- BL-OMT, BL-PGTM균주를 이용하여 quercetin으로부터 isorhamnetin 3-O-glucoside의 생합성 가능성을 알아보기 위해 2 mL LB배지에 각 각의 균주를 배양하여 25℃에서 20시간 동안 각각의 재조합 단백질을 유도하였다. 그 후 각 균주의 밀도를 동일하게 AMM 배지에 현탁 하여 30℃ 배양기에서 생물전환을 하였다. 배양 12시간 후에 반응액을 에칠아세테이트로 추출하여 HPLC분석을 하였다.
- 다음날 각각 250 mL 플라스크에 ampicillin (100 μg/L)이 첨가된 25 mL의 새로운 LB에 전날 배양액 250 μL를 접종하여 37℃ 인큐베이터에서 배양하였으며, 세포 밀도가 OD600nm에서 0.6이 되었을 때 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)의 최종농도가 0.1 mM이 되게 첨가하였다.
- 그 후 각 균주의 밀도를 동일하게 AMM 배지에 현탁 하여 30℃ 배양기에서 생물전환을 하였다. 배양 12시간 후에 반응액을 에칠아세테이트로 추출하여 HPLC분석을 하였다. 대조구로 사용된 균주의 생물전환 결과(Fig.
- 공조배양은 생합성에 관여하는 유전자들의 균주별로 분리함으로써 생합성 경로의 대사정체(metabolic burden)현상과 부산물의 생산을 줄일 수 있는 장점이 있다. 본 연구에서 O-methyl-transferase (ROMT-9)와 flavonol glycosyltransferase (PGTM)을 가진 대장균 균주를 이용한 공조배양시스템으로 isorhamnetin 3- O-glucoside 생합성 방법을 확립하였다. 확립된 공조배양시스템으로 500 μM의 quercetin으로부터 생물전환 12시간 후 181.
- 본 연구에서는 Populus deltoides에서 분리한 flavonol UDPglycosyltransferase (PGT-3)의 82번 아미노산을 glutamate에서 Leucine으로 치환한 돌연변이체(PGT-3 Glu82Leu)와 벼에서 분리한 O-methyltransferasse-9 (ROMT-9)을 대장균에 도입하여 quercetin으로부터 isorhamnetin 3-O-glucoside를 생산하는 방법을 최적화하였다.
- 생물전환으로 얻은 반응물은 분석은 HPLC 시스템(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)을 이용하였다. 반응물의 분리와 검출은 Polaris 5 C18-A column (250 mm×4.
- 이러한 결과는 다른 온도에 비해 37℃의 생물전환온도에서 PGT-3M의 활성이 낮은 결과에 의한 것으로 보인다. 세포 밀도가 isorhamnetin 3-O-glucoside의 생물전환에 미치는 영향을 알아보기 위하여 AMM-glucose 배지를 기본으로 세포 비율을 OD600 nm에서 BL-PGTM와 BL-OMT의 비율을 2.0:2.0, 2.0:3.0, 2.0:4.0, 2.0:5.0과 BL-OMT와 BL-PGTM의 비율을 2.0:3.0, 2.0:4.0, 2,0:5.0으로 맞추어 테스트하였다. 최적의 조합은 BL-OMT와 BL-PGTM의 세포 비율을 2.
- 0의 비율, quercetin 500 μM, 25 o C의 생물전환 온도였다. 이상의 조건으로 isorhamnetin 3-O-glucoside 의 생산을 48시간 동안 관찰하였다. 배양 후 4시간에 32.
- 이상의 결과로 보아 PGTM의 세포보다 ROMT-9의 세포 비율이 높아야 한다는 것을 의미한다. 재조합 단백질의 유도시간이 isorhamnetin 3-O-glucoside에 미치는 영향을 알아보기 위하여, ITPG추가 후 6, 12, 24, 36시간 후에 생물전환을 하였다. 6시간 단백질을 유도한 후 생물전환을 하였을 때 가장 높은 50.
대상 데이터
- Andrw’s Magic Media (AAM) [21]와 Difco사의 LB, M9, YPD, TB배지는 대장균 배양 및 생물전환용 배지로 사용하였다.
- Escherichia coli DH5α 균주는 유전자 클로닝 및 플라스미드를 증폭에 사용하였다. E. coli BL21 (DE3) 균주는 isorhamnetin 3-O-glucoside 생산을 위한 생물전환 호스트로 사용하였다. pGEX 5X-3벡터는 PGT-3 E82L 또는 ROMT-9 클로닝에 사용하였다.
- Escherichia coli DH5α 균주는 유전자 클로닝 및 플라스미드를 증폭에 사용하였다.
- 배지내 탄소원은 다른 언급이 없으면 글리세롤을 20 g/L 의 농도로 첨가하였다. Quercetin은 sigma사로부터, isorhamnetin, isorhamnetin 3-O-glucoside는 INDOFINE사로부터 구매하였다.
- 이전의 연구에 의하면 포플러에서 분리한 당전이 유전자의 돌연변이체가 isorhamnetin의 3번 위치에 특이적으로 당을 부착하는 것으로 보고되었다[23]. 따라서 본 연구에서는 벼에서 분리한 ROMT-9와 포플러 당전이 유전자의 돌연변이체 PGT-3M (PGT-3 Glu82Leu)를 quercetin에서 isorhamnetin 3-O-glucoside의 생합성에 사용하였다(Fig. 1). 각 유전자가 도입된 균주를 BL-OMT, BL-PGTM으로 명명하였다.
- 반응물의 분리와 검출은 Polaris 5 C18-A column (250 mm×4.6 mm, Agilent Technologies)과 photodiode array를 이용하였다.
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