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문제 정의
- , 2004). 따라서, 본연구에서는 환경독성 물질인 톨루엔이 소장상피세포의 활성산소종 발생 및 환경독성 신호전달기전을 촉진시킬수 있는지 알아보고, 이때 느릅나무 당단백질이 톨루엔이 유도한 환경독성 메커니즘을 조절할 수 있는지를 밝히고자 한다
- 톨루엔이 유도한 세포독성 신호전달 기작을 알아보기 위해 환경독성물질의 일차적 표적인 reactive oxygen species (활성산소종) 발생에 미치는 영향을 알아보았다. 활성산소종은 세포의 일시적 산화적 스트레스 표지자로서, 세포질내의 다양한 단백질의 활성을 조절하여 질환 발생에 영향을 미치는 대표적인 신호전달 물질로 알려져 있다 (Stadtman, 2001).
- 느릅나무(Ulmus davidiana Nakai, UDN)는 예로부터 부종, 유방염, 위궤양 및 위암 등에 효과를 가진 전통 약재로 사용되어 왔다. 본 연구에서는 느릅나무로부터 추출된 116 kDa의 식물성 당단백질(UDN glycoprotein)을이용하여 휘발성 유기화합물인 톨루엔(Toluene)이 유도하는 환경독성 메커니즘을 제어하는 효과를 알아보았다. 느릅나무 당단백질은 소장상피세포(INT-407 cells)에서환경독성 방향족 탄화수소인 톨루엔이 유도한 lactate dehydrogenase (LDH) 방출을 유의적으로 억제하는 능력을 가지고 있었다.
제안 방법
- 용해된 느릅나무 추출물은Whatman 여과지로 여과하여 불순물을 제거한 후, 여과된 용액에 80% ammonium sulfate 첨가하여 침전시키고 침전물을 투석 반투막(Spectra/por MWCO 6,000~8,000, CAL., USA)을 이용하여 4°C 의 20 mM Tris HCl (pH 7.4) 용액에서 12시간 투석하였으며 동결건조기를 이용하여 건조시켰고 -70 에서 보관하였다.
- 약 50 μL의 세포 배양액에 50 μL의 LDH 기질 혼합물을 넣고 30분동안 상온에서 차광하여 반응시킨 후 바탕값인 490 nm와 680 nm에서 fluorescent microplate reader(SPARK, Seestrasse, Männedorf, Switzerland)로 흡광도를 측정하였으며, 측정값 (LDH cytotoxicity)은[(maximum LDH activity - spontaneous LDHactivity)/(compound-treated LDH activity - spontaneous LDH activity)×100]을 이용해 구하였다
- 정량된 단백질들을 0.1% Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 가 포함된 10% polyacrylamide gel에 105 V, 30 mA에서 3시간 동안 전기영동기 (LPS solution, Daejeon,Korea; major science, Saratoga, CA, USA)를 이용하여 분리하였고, 이를 polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane에 transfer 시킨 후, 5% 탈지분유가 함유된 TBS-Tween 용액(50 mM Tris base, 137 mM NaCl,0.1 % Tween-20)으로 25°C에서 30분 동안 반응시켰다.
- 이후 시료는 0.1% Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)가 포함된 10% polyacrylamide gel에서 2시간 30분 동안 110 V,30mA로 전기영동기(Mini-PROTEIN II, Bio-Rad,CA, USA)를 이용하여 분리한 후 당단백질을 Schiff’sreagent로 염색하여 (Neville and Glossmann, 1974), 116 kDa의 분자량을 가진 당단백질을 electro-eluter(Mini Whole Gel Eluter, Bio-Rad, CA, USA)로 용출하였고, 이후 이것들을 동결건조해서 사용하였다.
- 세포내 활성 산소량을 정량하기 위해 fluorescent microplate reader(SPARK, Seestrasse, Männedorf, Switzerland)를 이용하여 495 ~ 530 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였으며, 공초점 레이저 현미경(Olympus FluoView 300 confocal microscope, Tokyo, Japan)을 이용해 100배 배율로 세포내 발생되는 활성 산소량을 관찰하였다.
- Western blot 실험을 수행하기 위해 소장상피세포에 톨루엔과 느릅나무 당단백질을 동시에 처리하고, PBS로 1회 세척한 후 세포 단백질을 추출하였다. 세포 단백질은 단백질 분해 억제제가 포함된 RIPA lysis buffer (20mM HEPES, pH 7.
- Western blot 실험을 수행하기 위해 소장상피세포에 톨루엔과 느릅나무 당단백질을 동시에 처리하고, PBS로 1회 세척한 후 세포 단백질을 추출하였다. 세포 단백질은 단백질 분해 억제제가 포함된 RIPA lysis buffer (20mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% IGEPALCA-630, 0.1% SDS, 0.5% Sodium deoxycholate)에서 추출 되었고, BCA protein assay kit (Pierce, Rockford,IL, USA)를 이용하여 단백질의 농도를 확인하였다. 정량된 단백질들을 0.
- 소장상피세포에 환경독성물질인 톨루엔과 느릅나무당단백질을 동시 처리한 후 lactate dehydrogenase(LDH) cytotoxicity assay kit (Thermo Scientific, MA, USA)를 이용하여 세포막 손상 정도를 측정하였다. 약 50 μL의 세포 배양액에 50 μL의 LDH 기질 혼합물을 넣고 30분동안 상온에서 차광하여 반응시킨 후 바탕값인 490 nm와 680 nm에서 fluorescent microplate reader(SPARK, Seestrasse, Männedorf, Switzerland)로 흡광도를 측정하였으며, 측정값 (LDH cytotoxicity)은[(maximum LDH activity - spontaneous LDHactivity)/(compound-treated LDH activity - spontaneous LDH activity)×100]을 이용해 구하였다
- 느릅나무로부터 분리된 116 kDa 느릅나무 당단백질의 세포적 생리활성 능력을 알아보기 위해 환경독성물질 중 하나인 톨루엔(Toluene)을 소장상피세포(INT-407cells)에 처리하여 느릅나무 당단백질의 환경독성 제어 효과를 알아보았다. 방향족 탄화수소인 톨루엔은 휘발성 유기화합물의 한 종류로서 대기오염물질을 생성하여 환경독성을 유도하거나, 인체 건강에 심각한 부작용을 일으킬 수 있는 것으로 알려져 있다(Morvai et al.
- 마지막으로 톨루엔에 의해 유도된 환경독성의 세포 신호전달기전을 확인하기 위해 상기에서 밝혀진 환경독성 신호전달 표적인자의 억제제들을 처리하여, 세포독성 지표인 LDH 방출 수준을 측정하였다. Fig.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 시약 중, Dulbecco’s ModifiedEagle’s Medium (DMEM) 배지와 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)은 GE Healthcare Life Sciences(Morningside, Queensland, Australia)에서 구입하였으며, p38 MAPK, phospho p38 MAPK, NF-κBp65,phospho NF-κBp65 및 β-actin은 Santa Cruz Biotechnology (Paso Robles, CA, USA)에서 구입하였다.
- 소장상피세포(INT-407 cells)는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 구입하였으며, DMEM 배지에 10% FBS, 100 U/mL penicillin 및 100 μg/mL streptomycin을 혼합한 후 37°C의 5% CO2 조건의 incubator에서 배양하였다.
- 본 실험에 사용된 시약 중, Dulbecco’s ModifiedEagle’s Medium (DMEM) 배지와 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)은 GE Healthcare Life Sciences(Morningside, Queensland, Australia)에서 구입하였으며, p38 MAPK, phospho p38 MAPK, NF-κBp65,phospho NF-κBp65 및 β-actin은 Santa Cruz Biotechnology (Paso Robles, CA, USA)에서 구입하였다. N-acetyl-L-cysteine (NAC)은 Tocris (KOMA Biotech, Seoul, Korea)에서 구입하였고, SB203580과Bay11-7082는 MedChemExpress (Monmouth Junction,NJ, USA)에서 구입하였다. 이외의 모든 시약은 Sigma사(St.
- N-acetyl-L-cysteine (NAC)은 Tocris (KOMA Biotech, Seoul, Korea)에서 구입하였고, SB203580과Bay11-7082는 MedChemExpress (Monmouth Junction,NJ, USA)에서 구입하였다. 이외의 모든 시약은 Sigma사(St. Louis, MO, USA)의 제품을 구입하여 사용하였고, 사용된 시약은 순도가 높은 (순도 99% 이상) 등급을구입하여 사용하였다.
- 세포내 활성 산소량은 2',7'-Dichlorofluoresceindiacetate (CM-H2 DCFDA)를 이용해 측정하였다.
데이터처리
- 통계적 유의적 차이는 one-way analysis of variance (ANOVA) 이용하여 결정하였으며, p-values < 0.05의 값들을 유의적인 결과로 고려하였다.
- 3,000배 희석된 primary antibody와 함께 4 에서 12시간동안 반응 시킨 후 TBS-Tween 용액으로 세척하고 10,000배 희석된 secondary antibody를 2시간동안 25°C에서 처리하였다. 각 단백질의 발현은 Bio-radChemi Doc XRS+ System (Bio-Rad, Hercules, CA,USA)을 이용해 확인하였고, Scion imaging 소프트웨어(Scion Image Beta 4.02, Frederick, MD, USA)를 사용하여 단백질 발현 결과를 상대 강도값으로 계산하였다.
성능/효과
- 모든 실험은 3회 반복 실시하였으며, 실험결과는 평균± 표준 오차(S.E.)로 나타냈다.
- 흥미롭게도 느릅나무 당단백질 10, 20 및 50 μg/mL를 톨루엔과 4시간 동안 함께 처리하였을 때, LDH 방출 수준을 각각 73, 150 및 183% 만큼 억제되는 것을 관찰할 수 있었다 (Fig. 1B).
- 그러나 느릅나무 당단백질 20 μg/mL을 톨루엔과 15분 동안 함께 처리 하였을 때, 세포내 활성산소 방출 수준이 45% 만큼 유의적으로 감소되는 것을 관찰할 수 있었다 (Fig. 2B).
- , 2007). Fig. 1A에서 보는 바와 같이, 1 mM의 톨루엔을 소장상피세포에 처리하였을 때 세포막 손상으로 인한 세포독성 지표인 LDH (lactate dehydrogenase) 방출이 시간에 따라 증가함을 관찰할 수 있었다. 특히 톨루엔 처리 후, 4시간째 LDH 방출 수준은 대조군과 비교하여 208% 만큼 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다.
- 1A에서 보는 바와 같이, 1 mM의 톨루엔을 소장상피세포에 처리하였을 때 세포막 손상으로 인한 세포독성 지표인 LDH (lactate dehydrogenase) 방출이 시간에 따라 증가함을 관찰할 수 있었다. 특히 톨루엔 처리 후, 4시간째 LDH 방출 수준은 대조군과 비교하여 208% 만큼 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다. 흥미롭게도 느릅나무 당단백질 10, 20 및 50 μg/mL를 톨루엔과 4시간 동안 함께 처리하였을 때, LDH 방출 수준을 각각 73, 150 및 183% 만큼 억제되는 것을 관찰할 수 있었다 (Fig.
- 1B). 따라서 이와 같은 결과는 톨루엔은 세포막을 손상시켜서 세포독성을 유발한 결과물로서 세포질에 존재하고 있는 LDH를 밖으로 방출시키지만, 느릅나무 당단백질의 경우 특이적인 신호전달 기작을 통해 간접적으로 톨루엔이 유도하는 세포독성 기작을 막고 세포에 활력을 유지시키는 능력을가지고 있다는 것을 제시한다. 최근에 톨루엔과 동일한방향족 탄화수소의 한 종류인 벤젠의 경우, 세포에서LDH 방출을 유도하여 세포독성을 유도한다는 결과가 보고 되었으며 (Dere and Ari, 2009) 이와 정반대로 느릅나무 당단백질의 경우, 섬유아세포 뿐만 아니라 장 상피세포에서도 독성효과를 나타내지 않고 세포를 보호하는 효과가 있다는 결과가 밝혀졌다 (Lee et al.
- 활성산소종은 세포의 일시적 산화적 스트레스 표지자로서, 세포질내의 다양한 단백질의 활성을 조절하여 질환 발생에 영향을 미치는 대표적인 신호전달 물질로 알려져 있다 (Stadtman, 2001). Fig. 2A에서 보는 바와 같이, 1mM의 톨루엔을 소장상피세포에 처리하였을 때, 세포내 활성산소 발생 수준은 대조군과 비교하여 15분째 일시적으로 49% 만큼 유의적 수준으로 증가한 것을 확인할 수 있었다. 그러나 느릅나무 당단백질 20 μg/mL을 톨루엔과 15분 동안 함께 처리 하였을 때, 세포내 활성산소 방출 수준이 45% 만큼 유의적으로 감소되는 것을 관찰할 수 있었다 (Fig.
- , 1996). Fig. 3A에서 보는 바와 같이, 1 mM의 톨루엔을 소장상피세포에 처리하였을 때, p38 MAPK 단백질 인산화 수준은 대조군과 비교하여 30분째 유의적으로 가장 증가한 것을 확인할 수 있었다. 그러나 느릅나무당단백질 20 μg/mL을 톨루엔과 30분 동안 함께 처리 하였을 때, p38 MAPK 단백질 활성 수준이 현저하게 감소되는 것을 관찰할 수 있었다 (Fig.
- Fig. 4A에서 보는 바와 같이, 1 mM의 톨루엔을 소장상피세포에 처리하였을 때, NF-κB 단백질 인산화 수준은 대조군과 비교하여 1시간 동안 유의적으로 점차 증가한 것을 확인할 수 있었다.
- , 1996). 따라서 이와 같은 결과는 느릅나무 당단백질은 톨루엔이 유도한 산화적 활성산소종의 발생을 제거함을 통해 p38 MAPK 단백질 인산화 수준을 억제함으로서 세포독성을 막는다는 것을 시사한다.
- 그러나 활성산소종의 저해제인 N-acetylcysteine (NAC),p38 MAPK의 저해제인 SB203580 그리고 NF-κB의 저해제인 Bay 11-7082를 톨루엔과 4시간 동안 함께 처리 하였을 때, 세포적 LDH 방출 수준이 각각 140%,226% 그리고 205% 만큼 현저하게 감소되는 것을 관찰할 수 있었다.
- 지금까지의 연구를 종합해 볼 때, 느릅나무로부터 분리된 116 kDa 느릅나무 당단백질은 환경독성물질인 톨루엔이 유도한 소장상피세포의 산화적 스트레스를 억제함을 통해, 세포내 활성산소종을 소거하고, p38 MAPK및 NF-κB의 인산화 억제를 통해 다양한 환경독성 연관유전자 발현을 조절하여 환경독성 세포신호전달 기전을 차단하는 탁월한 약리학적 기능을 가지고 있음을 알 수 있다.
- 따라서 이와 같은 결과는, 환경독성물질인 톨루엔은 활성산소종 발생을 통해, p38 MAPK 그리고 NF-κB의 활성을 조절함으로써 세포손상을 일으켜LDH 방출을 촉진하며, 느릅나무 당단백질의 경우 강력한 항산화력을 바탕으로 톨루엔의 세포적 신호전달기전을 억제하는 환경독성 억제 물질이라는 것을 시사한다.
- 마지막으로 톨루엔에 의해 유도된 환경독성의 세포 신호전달기전을 확인하기 위해 상기에서 밝혀진 환경독성 신호전달 표적인자의 억제제들을 처리하여, 세포독성 지표인 LDH 방출 수준을 측정하였다. Fig. 5에서 보는 바와 같이, 1 mM의 톨루엔을 소장상피세포에 처리하였을 때, LDH 방출 수준은 대조군과 비교하여 4시간 동안 유의적으로 185% 만큼 증가한 것을 확인할 수 있었다. 그러나 활성산소종의 저해제인 N-acetylcysteine (NAC),p38 MAPK의 저해제인 SB203580 그리고 NF-κB의 저해제인 Bay 11-7082를 톨루엔과 4시간 동안 함께 처리 하였을 때, 세포적 LDH 방출 수준이 각각 140%,226% 그리고 205% 만큼 현저하게 감소되는 것을 관찰할 수 있었다.
- 느릅나무 당단백질은 톨루엔이 유도한 세포독성 신호전달물질인 p38 mitogen-activated protein kinase (MPAKs)의 인산화 및 산화적 스트레스성 전사인자인 nuclear factor-kappa B (NFκB)의 활성을 통해 유도되는 환경독성 세포 신호전달기전을 차단하는 약리학적 효과를 보여 주었다. 이러한 결과를 종합해 보면 느릅나무 당단백질은 강력한 항산화 효과를 바탕으로 톨루엔이 유도한 장 상피세포의 산화적스트레스를 억제함으로써 활성산소종을 저해할 뿐만 아니라, p38 MAPK와 NF-κB의 활성을 억제함으로써 소장상피세포의 환경독성 신호전달기전을 막는 효과적인 환경독성 신호전달기전 제어제라고 요약할 수 있다.
후속연구
- , 1999; Csete, 2005). 따라서 톨루엔이 유도한 세포독성 신호전달 기작을 알아보고, 이 결과를 바탕으로 톨루엔의 제어방법을 연구하는 것은 환경 독성 기작을 제어하는 최소한의 방법을 제시할 수 있을 것으로 생각된다. 그러나 아직까지 톨루엔이 유도한 세포독성의 메커니즘을 이해하고 알아내는 연구가 미흡한 실정이며, 이러한 환경독성효과를 제어하는 물질을 탐구하는 연구 또한 매우 부족하다.
- , 2013). 따라서 느릅나무에는 생리활성 물질이 함유되어 있으며, 이것의 탁월한 약리학적인 효과는 환경독성물질 및 활성산소종이 유도한 세포독성을 제어하는데 사용될 수 있음을 시사한다. 최근 본 연구실에서는 천연물로부터 생리활성물질을 탐색하고, 이로부터 당단백질만을 분리하여 그에 대한 생물학적인 이용성을 연구하였던 결과, 느릅나무로부터 추출된 116 kDa의 식물성 당단백질(UDNglycoprotein)은 탁월한 생체 방어적 조절자로서 강력한 항산화 효과 및 면역기능 조절효과 그리고 항암 효과를 가지고 있는 것을 알았다 (Lee et al.
- 지금까지의 연구를 종합해 볼 때, 느릅나무로부터 분리된 116 kDa 느릅나무 당단백질은 환경독성물질인 톨루엔이 유도한 소장상피세포의 산화적 스트레스를 억제함을 통해, 세포내 활성산소종을 소거하고, p38 MAPK및 NF-κB의 인산화 억제를 통해 다양한 환경독성 연관유전자 발현을 조절하여 환경독성 세포신호전달 기전을 차단하는 탁월한 약리학적 기능을 가지고 있음을 알 수 있다. 향후 느릅나무 당단백질의 환경독성 세포신호전달기전에 대한 분자생물학적인 연구로서, 환경독성물질의 수용체 작용기전에 대한 실험이 더 필요하며, 환경독성에 의한 상피세포 유해 메커니즘을 더욱 이해하는 연구가 수행되어야 할 것이다.
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