[논문]미생물 분리주를 이용한 제비꽃 발효액의 생리활성 변화

이지영; 오수빈; 최낙식; 박용운; 강대욱

doi:10.5352/jls.2019.29.2.239

미생물 분리주를 이용한 제비꽃 발효액의 생리활성 변화
Biological Activity of Viola mandshurica Fermented with Bacillus methylotrophicus CBMB205 and Leuconostoc pseudomesenteroides NRIC1777 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.29 no.2 = no.226, 2019년, pp.239 - 247

이지영 (창원대학교 대학원 생명공학협동과정) , 오수빈 (창원대학교 생명보건학부) , 최낙식 (케이 프로텍) , 박용운 (지리산대한당영농조합법인) , 강대욱 (창원대학교 생명보건학부)

초록
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미생물의 발효를 이용하여 제비꽃의 효능과 기능성을 증진시켜 응용을 높이기 위한 목적으로 발효식품에서 분리하고 동정한 B. methylotrophicus CBMB205와 L. pseudomesenteroides NRIC1777 두 미생물을 이용하여 72시간 제비꽃을 발효하면서 12시간 마다 발효액의 총 폴리페놀과 총 플라보노이드 함량, 항산화력, 환원력, 혈당조절과 관련이 있는 ${\alpha}$-amylase와 ${\alpha}$-glucosidase 저해활성, 비만관련 췌장 리파제 저해활성 등을 측정하고 대조구인 비발효 제비꽃과 비교, 분석하였다. 총 폴리페놀 함량의 경우 Bacillus와 유산균은 대조구에 비해 각각 1.4배 및 1.17배 증가되었고, 총 플라보노이드 함량은 각각 3.2배와 3.4배 증가되었다. 항산화력 비교에서 DPPH 라디칼 소거능은 모두 변화가 없었으나 ABTS 라디칼 소거능의 경우 2.1배 및 1.6배 증가된 것으로 나타났다. 환원력의 경우 Bacillus는 1.6배 높게 나타났으나 유산균은 대조구와 유의적인 차이점이 없었다. ${\alpha}$-Amylase의 경우 Bacillus와 유산균은 대조구보다 각각 6배와 3배의 저해율을 보였고 ${\alpha}$-glucosidase는 2.9배와 2.6배의 저해활성을 나타내었다. 췌장 리파제에 대해서 Bacillus와 유산균은 대조구에 비해 3.4배와 2.8배 높은 저해활성을 보였다. Bacillus와 유산균으로 발효한 제비꽃은 DPPH 라디칼 소거능을 제외하고 시험한 모든 항목에서 대조구보다 우수한 결과를 얻었다. 따라서 미생물 발효를 통해 항산화력과 관련이 있는 총 폴리페놀과 총 플라보노이드 함량이 증가되고 ABTS 라디칼 소거능, ${\alpha}$-amylase, ${\alpha}$-glucosidase 및 췌장 리파제에 대한 저해능 등이 대조구에 비해 높아진 결과를 토대로 건강기능식품이나 화장품 첨가제 등으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Abstract ▼ AI-Helper

The aim of this study was to improve the efficacy and functionality of Viola mandshurica (VM). A water suspension of VM power was fermented for 72 hr with Bacillus methylotrophicus CBMB205 (BM) and Leuconostoc pseudomesenteroides NRIC1777 (LP) isolated from kimchi. The antioxidant activity and reducing power of fermented VM, its total phenolic and flavonoid compounds, as well its inhibitory activity on ${\alpha}$-amylase, ${\alpha}$-glucosidase, and pancreatic lipase were determined and compared to those of non-fermented VM (NVM), a negative control. The total phenolic and flavonoid compounds of VM fermented with BM and LP were higher than those of NVM by 1.4, 1.17, and about 3 times. There was no difference in 2, 2'-diphenyl-1-picryl hydrazyl (DPPH) radical scavenging activity between fermented VM and NVM. However, there was a 2.1- and 1.6-fold increase in 2, 2'-azino-bis-(3-ethylbenzothzoline-6-sulfonic acid) (ABTS) radical scavenging activity in VM fermented with BM and LP, respectively. The reducing power of BM was 1.6 times as high as NVM, but no significant difference was found between LP and NVM. Fermented VM's inhibitory activity on ${\alpha}$-amylase, ${\alpha}$-glucosidase, and pancreatic lipase was much higher than that of NVM. Fermenting VM with BM was superior to fermenting it with LP, except flavonoid content. Taken together, VM fermented with BM could be used as a functional food and as an additive to cosmetics.

주제어

표/그림 (9)

그림 Fig. 1. Cell growth of B. methylotrophicus CBMB205 and L. pseudomesenteroides NRIC1777 during fermentation of V. mandshurica.
그림 Fig. 2. Changes in total phenolic compounds of V. mandshurica fermented with B. methylotrophicus CBMB205 and L. pseudomesenteroides NRIC1777. Contents of total phenolic compounds of non-fermented and fermented V. mandshurica were determined using gallic acid as a standard.
그림 Fig. 3. Changes in total flavonoid compounds of V. mandshurica fermented with B. methylotrophicus CBMB205 and L. pseudomesenteroides NRIC1777. Contents of total flavonoid compounds of non-fermented and fermented V. mandshurica were determined using catechin as a standard.
그림 Fig. 4. DPPH radical scavenging activity of V. mandshurica fermented with B. methylotrophicus CBMB205 and L. pseudomesenteroides NRIC1777. DPPH radical scavenging activity was measured at 520 nm.
그림 Fig. 5. ABTS radical scavenging activity of V. mandshurica fermented with B. methylotrophicus CBMB205 and L. pseudomesenteroides NRIC1777. ABTS radical scavenging activity was measured at 734 nm.
그림 Fig. 6. Reducing power of V. mandshurica fermented with B. methylotrophicus CBMB205 and L. pseudomesenteroides NRIC1777. The reducing power activity was measured at 700 nm.
그림 Fig. 7. Effect of fermented V. mandshurica on α-amylase activity. α-Amylase activity was measured at 540 nm.
그림 Fig. 8. Effect of fermented V. mandshurica on α-glucosidase activity. α-Glucosidase activity was measured at 405 nm.
그림 Fig. 9. Changes in lipase inhibition activity of V. mandshurica fermented with B. methylotrophicus CBMB205 and L. pseudomesenteroides NRIC1777. Inhibitory activity on pancreatic lipase was measured at 412 nm.

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 발효식품에서 분리한 B. methylotrophicus CBMB205와 L. pseudomesenteroides NRIC1777 두 박이용하여 제비꽃 발효액의 항산화 활성, α-amylase, α-glucosidase 및 lipase 효소에 대한 저해활성과 같은 생리활성을 발효하지 않은 제비꽃과 비교, 분석함으로써 기능성 식품 소재로 개발하기 위한 가능성을 검토하고자 하였다.
본 연구에서는 미생물 발효기술을 이용하여 제비꽃의 기능성을 증진하여 기능성 식품이나 화장품 첨가제로 사용하기 위한 기초 연구를 수행하기 위한 일환으로 B. methylotrophicus CBMB205와 L. pseudomesenteroides NRIC1777 분리주를 이용하여 제비꽃을 발효하고 항산화능과 연관이 있는 총 폴리페놀과 총 플라보노이드 함량, 항산화 활성 그리고 α-amylase, α-glucosidase 및 췌장 리파제에 대한 저해활성 등을 대조구인 발효하지 않은 제비꽃과 비교, 분석하였다.

제안 방법

ρ-Nitrophenyl dodecanoate (ρNPD)를 기질로 사용하여 제비꽃 발효액의 pancreatic lipase 활성저해를 측정하였다.
0.25 M Tris-HCl (pH 7.7), 250 mM CaCl2, 5 mM ρNPD 등으로 구성된 반응액을 혼합하고 37℃에서 5분간 예열하였다.
제비꽃 발효액 50 μl, 멸균수 50 μl, diethylene gly테리아를 col 1,000 μl, 1 N NaOH 100 μl를 가한 후 37℃ 항온수조에서 1시간 반응시킨 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. Catechin을 표준물질로 사용하여 검량곡선을 작성하고 이로부터 총 플라보노이드 함량을 계산하였다.
제비꽃 발효액의 라디칼 소거능은 Mesor 등[20]의 방법에 따라 측정하였다. 대조구는 시료 대신 같은 부피의 증류수를 첨가하였고 시료의 라디칼 소거능은 대조구에 대한 백분율로 나타내었다. 0.
pseudomesenteroides NRIC1777 두 박테리아를 최종 선택하였다. 분쇄한 제비꽃 20 g과 증류수 200 ml를 1,000 ml 삼각플라스크에 넣고 121℃에서 15분간 멸균한 후 B. methylotrophicus CBMB205와 L. pseudomesenteroides NRIC1777를 Lactobacilli De Man, Rogosa and Sharpe (MRS) 배지에서 배양한 전 배양액 1%를 접종한 후 37℃, 150 rpm에 서 72시간 배양하였다. 12시간 간격으로 발효액을 10 ml씩 회수하여 생균수를 측정하고 나머지는 원심분리하고 상등액을 회수하였다.
제비꽃 발효액의 환원력은 Kim 등[10]의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 0.
제비꽃 발효에 사용된 미생물은 다양한 발효식품에서 분리하여 본 연구실에 보관되어 있는 균주들 중 가수분해 효소활성이 상대적으로 높은 분리주를 선택하여 ㈜솔젠트에 의뢰하여 16S rRNA 유전자 염기서열분석으로 동정한 B. methylotrophicus CBMB205와 L. pseudomesenteroides NRIC1777 두 박테리아를 최종 선택하였다. 분쇄한 제비꽃 20 g과 증류수 200 ml를 1,000 ml 삼각플라스크에 넣고 121℃에서 15분간 멸균한 후 B.
총 플라보노이드 함량은 Kim[9] 등의 방법을 변형하여 측정하였다. 제비꽃 발효액 50 μl, 멸균수 50 μl, diethylene gly테리아를 col 1,000 μl, 1 N NaOH 100 μl를 가한 후 37℃ 항온수조에서 1시간 반응시킨 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다.
4 ml를 첨가하고 혼합한 후 25℃에서 1시간 반응시키고 730 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 gallic acid를 사용하였고 검량곡선을 이용하여 총 폴리페놀 함량을 계산하였다.
회수한 상등액을 0.2 μm 막여과지(Millipore, Billerica, MA, USA)로 여과하여 Folin과 Denis 등[5]의 방법을 약간 변형하여 총 폴리페놀을 정량하였다.
효소 활성은 ρNPD가 ρ-nitrophenol (ρNP)과 dodecanoic acid로 분해되어 생성된 ρNP의 양을 412 nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였다.

대상 데이터

1 ml를 혼합하고 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구로 vitamin C를 사용하였다.
Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 미생물 배지류는 Difco Laboratories (Sparks, MD, USA) 제품을 사용하였다.
본 실험에 사용한 제비꽃은 지리산 대한당 영농조합법인에서 채집, 동정하고 건조한 제비꽃 전 초본을 제공받아 분쇄하여 사용하였다. 폴리페놀과 플라보노이드류 정량분석, 항산화 활성 측정 그리고 α-amylase, α-glucosidase 및 lipase 등의 효소와 효소저해활성 측정에 사용된 시약과 효소들, catechin, gallic acid은 Sigma-Aldrich (St.
폴리페놀과 플라보노이드류 정량분석, 항산화 활성 측정 그리고 α-amylase, α-glucosidase 및 lipase 등의 효소와 효소저해활성 측정에 사용된 시약과 효소들, catechin, gallic acid은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

데이터처리

모든 실험은 3회 측정한 값의 평균치와 표준편차(means ± SD)로 나타내었고, SPSS package program software (version 25)를 이용하여 시료를 첨가하지 않은 대조구와 비교하여 Student’s t-test로써 유의성을 검증하였으며 F 값이 0.05 미만일 경우 유의성이 있는 것으로 판단하였다.

이론/모형

제비꽃 발효액의 α-amylase 저해활성은 Lim 등[19]의 방법을 사용하여 측정하였다.
제비꽃 발효액의 α-glucosidase 저해활성은 Tibbot와 Skadsen 등[31]의 방법에 따라 측정하였다.
제비꽃 발효액의 ABTS 라디칼 소거능은 Fellegrini 등[4]의 방법에 따라 측정하였다. 7.
제비꽃 발효액의 라디칼 소거능은 Mesor 등[20]의 방법에 따라 측정하였다. 대조구는 시료 대신 같은 부피의 증류수를 첨가하였고 시료의 라디칼 소거능은 대조구에 대한 백분율로 나타내었다.

성능/효과

72시간 발효 동안 Bacillus가 유산균보다 더 높은 α-glucosidase 저해율을 나타내었다.
pseudomesenteroides NRIC1777 분리주를 이용하여 제비꽃을 발효하고 항산화능과 연관이 있는 총 폴리페놀과 총 플라보노이드 함량, 항산화 활성 그리고 α-amylase, α-glucosidase 및 췌장 리파제에 대한 저해활성 등을 대조구인 발효하지 않은 제비꽃과 비교, 분석하였다. B. methylotrophicus CBMB205로 발효한 경우 DPPH 라디칼 소거능만 대조구와 차이가 없었고 나머지 시험항목에 대해서는 대조구에 비해 여러 생리활성과 이화학적 특성이 훨씬 높아진 것을 확인하였을 뿐만 아니라 L. pseudomesenteroides NRIC1777보다 거의 모든 항목에서 우수한 효과를 나타내었다. 따라서 B.
3에 나타내었다. B. methylotrophicus CBMB205와 L. pseudomesenteroides NRIC1777로 72시간 발효한 경우 발효시간이 경과함에 따라 플라보노이드 함량은 꾸준히 증가하여 각각 8,030 mg%와 8,362 mg%을 나타내어 비발효 제비꽃에 비해 3.2배와 3.4배로 발효 균주에 상관없이 유사하게 증가하였다. Park 등은 아마씨를 유산균으로 발효 후 플라보노이드 함량이 발효 전 대조구에 비해 1.
9와 같다. Bacillus로 발효한 제비꽃은 비 발효 대조구에 비해 최대 3.4배, 유산균의 제비꽃 발효에서는 대조구보다 최대 2.8배 높게 나타났다. 전 발효시간 동안 Bacillus는 유산균보다 훨씬 높은 저해율을 나타내었다.
8에 나타내었다. Bacillus의 경우 48시간부터 75% 저해율을 보여 비 발효 대조구에 비해 2.9배 증가되었으며 유산균에서는 증가되는 정도가 상대적으로 낮았으나 72시간 발효에서 비 발효 대조구보다 2.6배 높게 나타났다. 72시간 발효 동안 Bacillus가 유산균보다 더 높은 α-glucosidase 저해율을 나타내었다.
2에 나타내었다. 그 결과 B. methylotrophicus CBMB205로 발효한 경우 48시간까지 증가하여 최대인 13,235 mg%(132 mg/g)로 비발효 제비꽃 함량인 9,324 mg%보다 약 1.4배 증가 하였고 L.pseudomesenteroides NRIC1777도 48시간까지 총 폴리페놀 함량이 점진적으로 증가하여 10,967 mg%을 나타내었으나 유의한 증가는 아닌 것으로 나타났다. 어성초를 L.
발효에 사용된 두 균주는 유사하게 24시간 배양까지 생균수가 거의 대수적으로 증가하였으나 24시간 이후 B. methylotrophicus CBMB205는 소폭 증가하여 약 2.0×108 CFU/ml을 유지하였다.
)로 전환시키는 시료의 환원력을 700 nm에서 흡광도를 측정하는 것으로 환원력이 강할수록 녹색을 띠게 되어 항산화 활성이 큰 물질일수록 높은 흡광도를 나타낸다[10, 25]. 본 연구결과에 서는 Bacillus로 발효한 제비꽃의 경우 환원력이 72시간 발효까지 유의적으로 증가하여 비발효 제비꽃보다 1.6배 높게 나타났으나 유산균에서는 비발효 제비꽃 대조구와 뚜렷한 차이점이 없었다(Fig. 6). Kim 등[10]은 다양한 미생물로 발효한 인삼꽃의 농도별 환원력을 조사한 결과 고초균 발효의 경우 환원력이 증가하지 않았으나 L.
8배 증가한 것을 보고하였다. 본 연구결과에서는 Bacillus와 유산균으로 제비꽃을 발효하면 폴리페놀과 플라보노이드 함량은 증가되었으나 DPPH 라디칼 소거능은 변화가 없었고 ABTS 라디칼 소거능만 증가되었는데 이것은 폴리페놀 함량의 변화양상과 유사하 게 나타났다. ABTS 라디칼과 잘 반응하는 항산화 물질이 DPPH와 반응하지 않을 수도 있는 것으로 알려져 있다.
곰팡이를 이용한 가시오가피의 발효에서는 발효 전보다 오히려 감소하였다[1]. 본 연구에 사용된 유산균보다 Bacillus를 사용했을 때 총 폴리페놀 함량이 소량 더 증가된 것으로 나타났는데 이는 발효 전 세포벽 및 세포 구성물질에 결합되어 있던 페놀류 및 생리활성물질들이 미생물의 발효작용에 의해 유리된 것으로 보인다[27]. 또한 페놀성 물질은 식물의 고유한 색을 부여하는 동시에 식품의 맛에 깊이 관여하며 천연물에서 얻어지는 항산화성 물질은 주로 페놀성 화합물과 플라보노이드류의 화합물로서 특히 caffeic acid, chlorogenic acid, gentistic acid 등이 강한 항산화 효과를 나타내는 것으로 알려졌다[22].
Jung 등[8]은 증숙, 건조된 더덕을 Lactobacillus rhamnosus를 이용하여 37℃에서 7일간 정체배양으로 발효한 결과 생균수가 10⁸ CFU/g까지 증가한 것으로 보고하였다. 본 연구에서 발효에 사용된 두 박테리아가 배양시간에 따라 생균수 변화가 나타나는 것으로 보아 제비꽃 성분을 대사적으로 발효함으로써 세포생장이 일어나는 것을 확인할 수 있었다.
5에 나타내었다. 비발효 제비꽃은 37% 소거율을 나타내었으나 Bacillus로 60시간 발효한 제비꽃은 78%, 유산균으로 72시간 발효한 제비꽃은 60% 소거율로 비발효 대조구에 비해 각각 2.1배와 1.6배 증가하였다. 전 발효기간 동안 유산균에 비해 Bacillus로 발효한 것의 소거율이 훨씬 높게 나타났다.
이상의 결과로부터 제비꽃의 발효를 통해 α-amylase 저해활성이 증가됨을 확인할 수 있었다.
제비꽃 발효시간에 따른 α-amylase 활성에 대한 저해능을 Fig. 7에 나타낸 바와 같이 Bacillus와 유산균 모두 24시간 동안에는 저해율의 변화가 거의 없었으나 Bacillus의 경우 24시간 이후부터 급격히 증가하여 72시간 발효 시 60% 저해율로 비 발효 대조구보다 6배 높게 나타났으나 유산균에서는 발효시간에 따른 저해율 증가율이 낮았으며 36, 48시간 배양 시 30% 저해율을 보여 비 발효 대조구에 비해 3배 증가되어 상대적으로 Bacillus가 효율이 더 높았다.

후속연구

pseudomesenteroides NRIC1777보다 거의 모든 항목에서 우수한 효과를 나타내었다. 따라서 B. methylotrophicus CBMB205로 발효한 제비꽃 발효산물에서 기능성을 나타내는 화합물을 분리하고 동정하고 항 비만이나 항 당뇨 효능을 검증하기 위한 동물실험과 같은 후속 연구의 진행이 필요할 것으로 사료된다.
전 발효시간 동안 Bacillus는 유산균보다 훨씬 높은 저해율을 나타내었다. 따라서 B. methylotrophicus CBMB205를 사용하여 제비꽃을 발효하면 항 비만 효능을 보유한 기능성 식품의 개발에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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