[논문]댕댕이나무 열매 추출물이 지방전구세포와 마우스 지방유래줄기세포의 분화 및 지방 생성 억제에 미치는 영향

박미의; 이창호; 이해정

doi:10.4163/jnh.2019.52.1.17

댕댕이나무 열매 추출물이 지방전구세포와 마우스 지방유래줄기세포의 분화 및 지방 생성 억제에 미치는 영향
Effects of Lonicera caerulea extract on adipocyte differentiation and adipogenesis in 3T3-L1 cells and mouse adipose-derived stem cells (MADSCs) 원문보기

Journal of nutrition and health, v.52 no.1, 2019년, pp.17 - 25

박미의 (가천대학교 식품영양학과) , 이창호 (한국식품연구원) , 이해정 (가천대학교 식품영양학과)

초록
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본 연구에서는 댕댕이나무 열매 추출물이 3T3-L1과 마우스 지방유래줄기세포의 지방 분화유도 및 지방생성에 미치는 영향을 살펴보았다. 3T3-L1에 댕댕이나무 열매 추출물을 처리하였을 때, 농도의존적으로 지방구의 생성을 줄였고 지방세포 분화에 있어서 중요한 전사인자인 $PPAR{\gamma}$, $C/EBP{\alpha}$, SREBP1의 발현을 억제시켜 지방 합성이 감소됨을 확인하였다. 또한, 마우스 지방에서 분리한 줄기세포의 지방 분화과정에서도 댕댕이나무 열매 추출물이 $PPAR{\gamma}$, $C/EBP{\alpha}$, SREBP1의 단백질 발현을 감소시켜 지방 축적을 농도 의존적으로 억제하였다. 이상의 결과로 댕댕이나무 열매 추출물은 세포독성이 없는 농도에서 지방 세포의 분화를 억제 하는 것으로 확인되어 항비만 기능성 소재로서의 활용 가능성이 있을 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Purpose: Obesity is a major health problem of global significance because it is clearly associated with an increased risk of health problems, such as nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD), diabetes, cardiovascular diseases, and cancer. Lonicera caerulea (LC) originates from high mountains or wet areas and has been used as a traditional medicine in northern Russia, China, and Japan. LC contains a range of bioactive constituents, such as vitamins, minerals, and polyphenols. This study examined the anti-obesity effects of LC during differentiation in preadipocytes. Methods: The cell viability assay was performed after the differentiation of 3T3-L1 cells for 7 days. Oil Red O staining was used to visualize the changes in lipid droplets in 3T3-L1 cells and mouse adipose-derived stem cells (MADSCs). The mRNA expression of obesity-related genes was determined by quantitative real-time PCR. Results: According to the results of Oil Red O staining, the lipid levels and size of lipid droplets in the adipocytes were reduced and the LC extract (LCE, 0.25-1 mg/mL) markedly inhibited adipogenesis in a dose-dependent manner. The treatment of LCE also decreased the mRNA expression of peroxisome proliferator-activated receptor ${\gamma}$ ($PPAR{\gamma}$), CCAAT/enhancer binding protein-${\alpha}$ ($C/EBP{\alpha}$), and sterol regulatory element binding protein 1 (SREBP1) in 3T3-L1 cells. Western blot analysis showed that the $PPAR{\gamma}$, $C/EBP{\alpha}$, and SREBP1 protein levels in both 3T3-L1 and MADSC were reduced in a dose-dependent manner. Conclusion: These results suggest that LCE can inhibit adipogenic differentiation through the regulation of adipogenesis-related markers.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

최근 안토시아닌이 풍부한 식물자원들을 이용하여 항비만 연구들이 진행되고 있지만 [19-21] 아직까지 댕댕이나무 열매 추출물의 지방전구세포 분화 영향에 관련된 연구는 보고된 바가 없다. 따라서, 본 연구는 3T3-L1과 마우스 지방유래줄기세포를 이용하여 댕댕이나무 열매 추출물 (Lonicera caerulea extract, LCE)이 지방세포분화 및 증식에 미치는 영향을 살펴보고자 한다.

제안 방법

LCE를 농도별 함께 처리하여 분화시킨 세포를 PBS로 2회 세척한 후 세포를 수득하여 RNA extraction kit (17221, iNtRON Biotechnology, Gyeonggi-do, Korea)을 이용하여 total RNA를 분리하였다. RNA 50 ng을 cDNA로 합성한 후 SYBR Green Master Mix (TaKaRa Bio, Otsu, Japan)를 사용하여 ABI QuantStudio 3 (Applied Biosystems, California, USA) 장비로 qRT-PCR 분석을 수행하였다. 프라이머는 PPARγ, C/EBPα, and SREBP1 특이적인 프라이머를 사용하였다 (Table 1).
지방전구세포 와 지방유래줄기세포의 분화 및 lipid droplet 생성 정도를 확인하기 위하여 LCE를 0, 0.25, 0.5 와 1 mg/mL로 희석 처리하여 분화를 유도한 후 Oil Red O 염색을 실시하였고, Fig. 2 & 3과 같이 댕댕이나무 열매 추출물을 처리하지 않고 지방세포분화를 유도한 대조군 (Con; 0 mg/mL)에 비해 LCE를 처포의 LCE 농도리한 군에서 농도의존적으로 지방구 형성이 억제되는 것을 관찰할 수 있었다.

대상 데이터

3T3-L1 지방전구세포는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. 10% bovine calf serum (BCS), 1% penicillin 및 streptomycin (Gibco BRL, NY, USA)이 함유된 DMEM을 사용하여 37°C, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
댕댕이나무 열매는 강원도 정선에서 5월 말에 수확한 열매를 구입하여 사용하였고, 시료를 블랜더 (Hanil, Seoul, Korea)로 파쇄하여 60°C 수조 (Chang Shin Co., Seoul, Korea)에서 에탄올 25%가 함유된 증류수로 3시간 동안 환류 추출하였다. 용매 추출액은 여과지 No.
지방유래줄기세포는 4주령의 C57BL/6 mouse를 구입하여 경추 탈골 후 지방 (subcutaneous adipose tissue (SAT), epididymal adipose tissue (EAT)와 retroperitoneal adipose tissue (RAT))을 채취하여 사용하였다. 채취한 지방조직은 collagenase II를 처리하여 지방분해 후 원심 분리하여 stromal vascular fraction (SVF)를 획득 후 10% BCS를 첨가한 DMEM에 풀어 10 mm dish에 37°C, 5% CO2 조건에서 배양하였다.

데이터처리

)를 나타내었다. 각 실험군 간의 유의성 검증을 위하여 일원 배치 분산 분석 (one-way ANOVA)으로 분석하였으며 Tukey’s post hoc test로 분석하여, 유의수준 p-value＜0.05 인 경우 유의성이 있는 것으로 평가하였다.
통계분석 모든 자료의 통계 분석은 GraphPad Prism®5 (Graphpad Software Inc, CA, USA) 프로그램을 이용하여 3회 이상 측정한 평균 (mean)과 표준편차 (S.D.)를 나타내었다. 각 실험군 간의 유의성 검증을 위하여 일원 배치 분산 분석 (one-way ANOVA)으로 분석하였으며 Tukey’s post hoc test로 분석하여, 유의수준 p-value＜0.

성능/효과

5 와 1 mg/mL로 희석 처리하여 분화를 유도한 후 Oil Red O 염색을 실시하였고, Fig. 2 & 3과 같이 댕댕이나무 열매 추출물을 처리하지 않고 지방세포분화를 유도한 대조군 (Con; 0 mg/mL)에 비해 LCE를 처포의 LCE 농도리한 군에서 농도의존적으로 지방구 형성이 억제되는 것을 관찰할 수 있었다. Fig.
3T3-L1세포에 댕댕이나무 열매 추출물을 7일간 처리 후 8일째 지방 분화관련 전사인자들 및 그에 따른 단백질 발현을 살펴본 결과, PPARγ, C/EBPα, SREBP1의 mRNA발 현과 단백질 발현 모두 농도 의존적으로 대조군에 비해 댕댕이나무 열매 추출물을 처리한 군에서 감소하였는데 이는 댕댕이나무 열매 추출물을 처리한 마우스 지방유래줄 기세포에서도 동일한 결과를 얻었다. 이러한 결과는 지방 분화에 핵심적인 PPARγ, C/EBPα, SREBP1의 mRNA발현 저해가 단백질 발현 저해를 일으키고 나아가 3T3-L1과 마우스 지방유래줄기세포내 지방구 형성을 억제시키는 결과를 일으킨 것으로 사료된다.
지방 분화가 완료된 3T3-L1뿐만 아니라 마우스 지방유래줄기세포에서 현미경 사진으로 보이는 빨간 지방구들이 농도의존적으로 작아지거나 옅어지는 것을 확인하였는데, 이는 흡광도를 측정하였을 때와 같이 농도의존적으로 감소한 것으로 나타났다. 결론적으로, 이는 지방세포분화에 있어서 반드시 필요한 전사인자들의 발현을 댕댕이나무 열매 추출물이 저해시켜 이로 인하여 단백질 발현이 낮아지고 지방구 형성을 억제 및 감소시키는 것으로 사료된다.
본 연구에서는 머루에서 추출한 안토시아닌이 지방세포의 분화를 억제한다는 연구 [5]에서와 유사하게, 댕댕이나무 열매 추출물을 처리한 모든 농도에서 지방구의 형성이 억제된 것으로 나타났다. 지방 분화가 완료된 3T3-L1뿐만 아니라 마우스 지방유래줄기세포에서 현미경 사진으로 보이는 빨간 지방구들이 농도의존적으로 작아지거나 옅어지는 것을 확인하였는데, 이는 흡광도를 측정하였을 때와 같이 농도의존적으로 감소한 것으로 나타났다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	댕댕이나무 추출물을 3T3-L1세포에 처리한 결과 지방전구세포의 분화 및 지방 생성에 어떤 영향을 미치는 것으로 나타났는가?	3T3-L1세포에 댕댕이나무 열매 추출물을 7일간 처리 후 8일째 지방 분화관련 전사인자들 및 그에 따른 단백질 발현을 살펴본 결과, PPARγ, C/EBPα, SREBP1의 mRNA발현과 단백질 발현 모두 농도 의존적으로 대조군에 비해 댕댕이나무 열매 추출물을 처리한 군에서 감소하였는데 이는 댕댕이나무 열매 추출물을 처리한 마우스 지방유래줄기세포에서도 동일한 결과를 얻었다. 이러한 결과는 지방 분화에 핵심적인 PPARγ, C/EBPα, SREBP1의 mRNA발현 저해가 단백질 발현 저해를 일으키고 나아가 3T3-L1과 마우스 지방유래줄기세포내 지방구 형성을 억제시키는 결과를 일으킨 것으로 사료된다. 즉, 댕댕이나무 열매 추출물이 3T3-L1세포에서 지방 합성 전사인자 및 단백질 발현을 감소시켜 지방구 크기를 감소시키는 것으로 나타났는데 이는 다른 베리류의 지방합성 억제 효과 연구 결과들과 비슷하였다 [5,39,40].
	댕댕이나무 (Lonicera caerulea) 열매는 무엇인가?	그 중 강력한 항산화물질인 플라보노이드를 다량 함유한 베리류, 감귤류, 코코아, 녹차 등에 관한 연구들이 진행 중에 있다 [4-6]. 베리류의 일종인 댕댕이나무 (Lonicera caerulea) 열매는 허니베리로 많이 알려진 열매로 보라색의 납작한 모양으로 높은 산의 초지 또는 숲 가장자리에 서식하는데 러시아, 중국 만주 지방과 일본, 몽골 등지에서 볼 수 있고 전통 의료 목적으로도 사용되어 왔다 [7]. 국내에서는 강원도와 함경도, 그리고 한라산 능선 지역에서 생산되고 있다.
	지방유래줄기세포가 연구에서 활용시 가진 장점은 무엇인가?	항비만 in vitro실험으로 지방전구세포인 3T3-L1이 많이 사용되고 있으나 최근 연구에서는 다양한 조직으로 분화할 수 있는 지방유래줄기세포 (ex vivo)를 이용하여 갈색지방으로 의 분화 유도에 관한 연구가 진행되고 있다 [15]. 지방유래줄기세포는 많은 양을 얻을 수 있고 안정적이며 분화 유도 시 다양한 세포로의 분화가 가능하기 때문에 세포 치료용으로의 가능성도 높아지고 있다 [16]. 지방전구세포에 isobutylmethylxanthine (IBMX), dexamethasone (DEX), insulin을 처리하면 지방세포로 분화가 진행되는데 [17], 지방조직의 분화는 다른 조직세포분화와는 달리 여러 호르몬과 다양한 전사인자들의 상호작용을 통해 이루어진다 [18].

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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