[논문]구강편평세포암종 세포에서 감초 유래 Liquiritigenin의 항증식, 세포주기 정지 및 세포사멸 유도

곽아원; 윤구; 채정일; 심정현

doi:10.5352/jls.2019.29.3.295

구강편평세포암종 세포에서 감초 유래 Liquiritigenin의 항증식, 세포주기 정지 및 세포사멸 유도
Anti-proliferation, Cell Cycle Arrest, and Apoptosis Induced by Natural Liquiritigenin from Licorice Root in Oral Squamous Cell Carcinoma Cells 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.29 no.3 = no.227, 2019년, pp.295 - 302

곽아원 (목포대학교 약학대학) , 윤구 (목포대학교 약학대학) , 채정일 (전북대학교 치과대학) , 심정현 (목포대학교 약학대학)

초록
AI-Helper

Liquiritigenin (LG)은 licorice 뿌리에서 분리된 chiral flavonoid이다. LG는 항산화, 항암 및 항염증 효과를 포함하여 다양한 생물학적 활성을 가지고 있다. 구강편평세포암종에서 LG의 항암 활성은 아직 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 구강편평상피암 세포(HN22)에서 LG의 항암 효능을 시험하였다. HN22 세포에 LG를 처리하여 MTT 분석으로 세포 생존율을 평가하였으며, Annecin V/7-Aminactinomycin D 염색, 세포주기 및 Multi-caspase 활성을 $Muse^{TM}$ cell Analyzer로 분석하여 세포사멸 유도를 확인하였다. 분석결과, 구강편평상피암 HN22 세포에 LG를 처리시 G2/M 세포주기 정지를 일으켰으며, Western blotting 통하여 cyclin B1 및 CDC2 발현 감소와 p27 발현 증가를 확인하였다. LG는 활성산소종의 생성을 유발하고, CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein (CHOP) 및 78-kDa glucose regulated protein (GRP78)의 발현을 농도의존적으로 유도하였다. HN22 세포에 LG의 처리는 미토콘드리아 막전위의 손실(${\Delta}{\Psi}m$)을 일으켰다. LG를 처리한 HN22 세포의 단백질 분석결과 apoptotic protease activating factor-1 (Apaf-1), cleaved Poly (ADP-Ribose) Polymerase (C-PARP) 및 Bax의 발현을 증가함을 확인하였다. 따라서 우리의 결과는 LG이 구강편평상피암 세포의 세포사멸을 유도하여 항암제 역할을 할 수 있는 천연 화합물임을 시사한다.

Abstract ▼ AI-Helper

Liquiritigenin (LG) is a chiral flavonoid isolated from the roots of licorice. It exhibits multiple biological activities including anti-oxidant, anti-cancer, and anti-inflammatory effects. In particular though, the anti-cancer activity of LG in oral squamous cell carcinoma has yet to be elucidated, and LG-induced apoptosis in oral squamous cell carcinoma remains poorly understood. In the present study, we tested the role of LG in inducing apoptosis in oral squamous cell carcinoma cells. LG treatment of HN22 cells resulted in a dose-dependent inhibition of cell viability as detected by a 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromide assay. The induction of apoptosis in terms of Annexin V/7-Aminoactinomycin D staining, sub-G1 population, and multi-caspase activity were assessed with a $Muse^{TM}$ Cell Analyzer. Flow cytometric analysis revealed that LG treatment resulted in G2/M arrest in cell cycle progression and downregulation of cyclin B1 and CDC2 expression in a concentration-dependent manner. It also resulted in significant upregulation of p27. In addition, LG was seen to trigger the generation of reactive oxygen species and induce CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein and 78-kDa glucose-regulated protein in concentration-dependent upregulation. The LG treatment of HN22 cells led to a loss of mitochondrial membrane potential (${\Delta}{\Psi}m$); it also reduced the levels of anti-apoptotic protein and increased the expression of apoptotic protease activating factor-1, cleaved poly (ADP-ribose)polymerase and Bax. Overall, our results indicate that the pro-apoptotic effects of LG in HN22 cells depend on the activation of both intrinsic and extrinsic signaling pathways. Thus, our results suggest that LG constitutes a natural compound with a potential role as an anti-tumor agent in oral squamous cell carcinoma.

주제어

표/그림 (4)

그림 Fig. 1. Effects of LG on the cell viability and apoptosis in human oral squamous carcinoma HN22 cells.
그림 Fig. 2. Effects of LG on cell cycle distribution and cell cycle regulation protein expression in HN22 cells.
그림 Fig. 3. Generation of ROS and defect of MMP by LG treatment in HN22 cells.
그림 Fig. 4. Effects of LG on protein expression and multi-caspases activation related to apoptosis.

AI 본문요약
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문제 정의

Apoptosome은 caspase-9을 활성화 시켜 effector caspase (caspase-3/-7)의 활성을 통해 apoptosis를 유발한다[9]. 본 논문에서는 LG가 구강편평상피암 세포(HN22)의 성장 억제 및 세포사멸 기전을 확인하였다.

제안 방법

HN22 세포 내 활성산소종 생성 변화를 확인하기 위하여, HN22 세포를 6-well plate에 24시간 동안 배양한 후, LG를 다양한 농도로 처리하였다. LG 처리 후, 세포를 회수하여 PBS로 세척한 후 Muse Oxidative Stress Reagent working sol-ution (Merck Millipore, Darmstadt, Germany)을 처리하여 37°C에서 30분간 반응시켰다.

대상 데이터

본 실험에 사용된 LG은 목포대학교 약학대학의 윤구 교수에게 제공받아 실험을 수행하였다[24]. 세포의 배양에 사용된 DMEM 배지은 Welgene (Daegu, Korea)에서 구입하였다.
인간 구강편평상피암 HN22 (RRID:CVCL_5522) 세포는 단국대학교에서 제공받았다[29]. HN22 세포는 10% FBS 및 1% penicillin/streptomycin을 포함하는 DMEM 배지에 5% CO₂가 공급되는 37°C incubator에서 배양하였다.

데이터처리

모든 실험 결과는 평균값(mean values) ± 표준편차(SD)로 나타내었다. 분석된 실험 데이터의 통계적 유의성은 분산분석(Analysis of Vatiance, ANOVA)을 사용하여 검증하였고, p value<0.05인 경우 유의성이 있는 것으로 판단하였다.

이론/모형

LG의 처리에 의한 HN22 세포의 세포사멸 효과 기전을 알아보기 위하여, apoptosis 관련 단백질들의 발현양상을 확인하고자 Western blotting을 실시하였다(Fig. 4A). 과도한 ROS가 생성됨에 따라 ER stress에 의하여 apoptosis가 유도된다[10].
9 μM로 나타났다[38]. 감초에서 추출된 LG가 구강편평상피암세포 HN22에서의 세포 생존율에 미치는 영향을 확인하기 위하여 HN22 세포에 LG (50, 100 및 150 μM)를 24, 48시간 동안 처리한 후 MTT assay를 실시하였다. Fig.

성능/효과

cip/kip family 구성원인 p27의 발현이 증가하였다. 따라서, LG가 HN22 세포에서 sub-G1기의 증가 및 G2/M ar-rest를 통하여 세포사멸 유도함을 시사한다.
이상의 결과를 종합해 보면 LG에 의한 인간구강상피세포암종인 HN22 세포의 증식 억제가 세포사멸 유도에 의한 것임을 알 수 있었다. 또한, LG은 sub-G1기의 세포수 증가, G2/M기 cell cycle arrest 현상, 활성산소종에 의한소포체 스트레스, 미토콘드리아 막전위 소실 및 세포사멸 단백질들을 조절함으로써 내·외인적 경로를 통해 세포사멸을 유도하였다. 따라서, LG의 임상적 실현 가능성을 확인하기 위해in vivo 실험을 수행할 수 있지만, 다른 약물에 비하여 분리와 정제 과정이 어렵다.
내인성 apopto-sis 경로는 MMP 소실 및 ROS 생산과 같은 내부 자극에 의한 세포 사멸을 일으키는 것으로 입증되었다[33, 39]. 이 결과는 LG 처리에 의한 HN22 세포의 apoptosis 유발에는 ROS의 생성과 이를 통한 미토콘드리아 기능 소실이 관여함을 보여준다.
이는 LG가 HN22 세포에서 외인적 및 내인적 경로를 통하여 세포사멸을 유도한다는것을 시사한다. 이상의 결과를 종합해 보면 LG에 의한 인간구강상피세포암종인 HN22 세포의 증식 억제가 세포사멸 유도에 의한 것임을 알 수 있었다. 또한, LG은 sub-G1기의 세포수 증가, G2/M기 cell cycle arrest 현상, 활성산소종에 의한소포체 스트레스, 미토콘드리아 막전위 소실 및 세포사멸 단백질들을 조절함으로써 내·외인적 경로를 통해 세포사멸을 유도하였다.

후속연구

따라서, LG의 임상적 실현 가능성을 확인하기 위해in vivo 실험을 수행할 수 있지만, 다른 약물에 비하여 분리와 정제 과정이 어렵다. 그러므로 향후 충분한 양의 LG를 분리한 후 생물학적 영향에 대한 효과를 확인하기 위하여 본 in vitro연구결과를 토대로 in vivo 실험을 진행하여 암세포 사멸기전에 대한 상세한 기전 규명, 항암 효과에 대한 연구 및 향후항암제로써 활용하기 위한 동물실험 등의 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	LG가 가진 생화학적 기능들은 무엇인가?	천연물인 감초에서 추출한 Liquiritigenin (LG)은 플라보노이드 구성원이다[21]. LG는 항암, 항산화, 항염증, 항고지혈증 및 항알레르기작용을 포함하여 다양한 생화학적 활성을 가지고 있다[1, 37]. LG는 포유류 세포주에서 세포사멸을 통한 항 종양 활성을 나타낸다는 연구 결과가 있다[14, 21, 37].
	Liquiritigenin (LG)은 무엇인가?	Liquiritigenin (LG)은 licorice 뿌리에서 분리된 chiral flavonoid이다. LG는 항산화, 항암 및 항염증 효과를 포함하여 다양한 생물학적 활성을 가지고 있다.
	구강편평세포암종에서 LG의 항암 활성을 확인한 결과, 세포주기에 어떤 영향을 주었으며 이에 어떤 유전자 발현에 변화를 보였는가?	HN22 세포에 LG를 처리하여 MTT 분석으로 세포 생존율을 평가하였으며, Annecin V/7-Aminactinomycin D 염색, 세포주기 및 Multi-caspase 활성을 $Muse^{TM}$ cell Analyzer로 분석하여 세포사멸 유도를 확인하였다. 분석결과, 구강편평상피암 HN22 세포에 LG를 처리시 G2/M 세포주기 정지를 일으켰으며, Western blotting 통하여 cyclin B1 및 CDC2 발현 감소와 p27 발현 증가를 확인하였다. LG는 활성산소종의 생성을 유발하고, CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein (CHOP) 및 78-kDa glucose regulated protein (GRP78)의 발현을 농도의존적으로 유도하였다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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