[논문]산화적 스트레스에 의한 간세포의 DNA 손상 및 세포사멸 유도에 미치는 원지 에탄올 추출물의 보호 효과

김홍윤; 박철; 최영현; 황원덕

doi:10.15429/jkomor.2019.19.1.1

산화적 스트레스에 의한 간세포의 DNA 손상 및 세포사멸 유도에 미치는 원지 에탄올 추출물의 보호 효과
The Protective Effect of Ethanol Extract of Polygalae Radix against Oxidative Stress-Induced DNA Damage and Apoptosis in Chang Liver Cells 원문보기

한방비만학회지 = Journal of Korean Medicine for Obesity Research, v.19 no.1, 2019년, pp.1 - 11

김홍윤 (동의대학교 한의과대학 내과학교실) , 박철 (동의대학교 자연과학대학 분자생물학과) , 최영현 (동의대학교 한의과대학 생화학교실) , 황원덕 (동의대학교 한의과대학 내과학교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives: The purpose of the present study was to evaluate the preventive effects of ethanol extract of Polygalae radix (EEPR) against oxidative stress (hydrogen peroxide, $H_2O_2$)-induced DNA damage and apoptosis in Chang liver cells. Methods: Chang liver cells were pretreated with various concentrations of EEPR and then challenged with 0.5 mM $H_2O_2$. The cell viability and apoptosis were assessed using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay and flow cytometry analysis, respectively. The levels of reactive oxygen species (ROS), mitochondrial membrane potentials (MMPs) and adenosine tri-phosphate (ATP) contents were measured. Expression levels of Bcl-2 and Bax were also determined using Western blot analysis. Results: The results showed that the decreased survival rate induced by $H_2O_2$ could be attributed to the induction of DNA damage and apoptosis accompanied by the increased production of ROS, which was remarkably protected by EEPR. In addition, the loss of $H_2O_2$-induced MMPs and ATP contents was significantly attenuated in the presence of EEPR. The inhibitory effect of EEPR on $H_2O_2$-induced apoptosis was associated with up-regulation of Bcl-2 and down-regulation of Bax, thus reducing the Bax/Bcl-2 ratio. Conclusions: Our data prove that EEPR protects Chang liver cells against $H_2O_2$-induced DNA damage and apoptosis by scavenging ROS and thus suppressing the mitochondrial-dependent apoptosis pathway.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

Chang 간세포에서 H₂O₂ 처리에 의해 유발된 세포독성 및 세포사멸 유도에 대한 EEPR의 보호 효과가 산화적 스트레스의 직접적인 차단 효과 때문인지를 조사하기 위하여 ROS 생성에 미치는 영향을 조사하였다. 이를 위하여 0.
따라서 항산화제는 간세포에서 ROS 매개 DNA 손상에 대한 억제 효과뿐만 아니라 보호 효과를 가질 수 있다. 현재 산화적 스트레스에 대한 원지의 항산화 효능에 관한 연구는 보고된 바 없으며, 본 연구에서는 간세포에서 산화적 스트레스에 대한 원지 에탄올 추출물(ethanol extract of Polygalae radix, EEPR)의 억제 효과를 검증하였다. 본 연구결과에서 EEPR은 Chang 간세포(Chang liver cells)에서 과산화수소(hydrogen peroxide, H₂O₂)에 의한 ROS 생산 억제를 통해 DNA 손상과 세포사멸을 효과적으로 감소시켜줌을 확인 하였다.

제안 방법

Chang 간세포에서 EEPR의 산화적 스트레스 보호 효과를 조사하기 위하여 먼저 EEPR의 독성 여부를 조사하였다. 이를 위하여 다양한 농도의 EEPR을 단독 처리하여 24시간 배양한 후 MTT 분석을 실시하였다.
EEPR과 H₂O₂가 단독 또는 동시 처리된 세포에서 ATP 생성 수준의 변화를 관찰하기 위하여 luciferase/luciferin-based system을 적용하였다. 이를 위하여 준비된 세포에서 분리된 30 μg의 미토콘드리아 pellet을 0.
H2O2에 의한 ROS 생성과 EEPR에 의한 차단 효과를 확인하기 위하여 fluorescent probe인 2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCF-DA; Molecular Probes, Leiden, Netherlands)를 사용하였다.
H₂O₂에 의한 미토콘드리아 기능 손상 여부와 EEPR에 의한 보호 효과를 확인하기 위하여 MMP의 변화 정도를 측정하였다. 이를 위하여 준비된 세포들에 10 μM의 5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide (JC-1; Sigma-Aldrich Chemical Co.
의 조건에서 배양하였다. H₂O₂에 의한 세포독성에 미치는 EEPR의 영향을 조사하기 위하여 Chang 간세포에 적정 농도의 EEPR 또는 H₂O₂ (Sigma-Aldrich Chemical Co.)를 24시간 동안 단독으로 처리하거나, EEPR를 1시간 처리 후 H₂O₂를 24시간 처리하였다. 처리가 끝난 세포에 3시간 동안 0.
H₂O₂에 의한 세포사멸 유발에 미치는 EEPR의 영향을 조사하기 위하여 다양한 조건에서 배양된 Chang 간세포를 phosphate-buffered saline (PBS)로 2회 수세 후 0.1 M phosphate buffer (pH 7.2)에 희석된 3.7% paraformaldehyde 용액(Sigma-Aldrich Chemical Co.)에 1시간 동안 고정시켰다. 고정된 세포를 수세한 후 0.
다음은 Chang 간세포에서 H₂O₂에 의한 생존율 감소가 EEPR에 의해 억제되는 것이 EEPR의 세포사멸 유도 억제와 연관성이 있는 지를 확인하였다. 이를 위하여 전형적인 세포사멸이 일어난 세포의 핵에서 특이적으로 관찰되는 염색질의 응축(chromatin condensation)에 따른 apoptotic body의 형성을 DAPI 염색을 통하여 조사하였다.
다음은 Chang 간세포에서의 산화적 스트레스 억제가 미토콘드리아 기능 손상의 회복과 연계되어 있는지를 조사하였다. 이를 위하여 미토콘드리아 기능 손상을 의미하는 MMP 소실에 미치는 영향을 조사한 결과, H₂O₂ 단독 처리된 배지에서 배양된 Chang 간세포에서는 미토콘드리아 기능 손상을 의미하는 MMP 소실이 매우 증가되었으나, EEPR에 의해 이러한 현상이 유의적으로 차단되었다(Fig.
한편 미토콘드리아의 기능 손상과 연관된 세포사멸 유도에 핵심적인 조절자로 작용하는 인자가 Bcl-2 family 단 백질들이다. 따라서 이상에서 관찰된 EEPR의 미토콘드리아 손상 차단과 연관된 세포사멸 유도 억제가 이들 단백질들의 발현 변화와 연관되어 있는지를 조사하였다. Fig.
이를 위하여 준비된 세포들을 10 μM의 DCF-DA로 20분간 염색하고 non-specific staining을 제거하기 위하여 PBS로 수세한 후 flow cytometer를 이용하여 ROS 생성량을 정량적으로 비교하였다. 또한 동일한 조건에서 배양된 세포를 대상으로 형광 현미경 관찰에 의한 ROS 생산 정도를 조사하기 위하여 coverslip에 부착된 세포에 동일 조건으로 EEPR 및 H₂O₂를 처리한 후, 이들 세포를 DCF-DA로 염색하고, 4% paraformaldehyde으로 20분간 고정시켜 형광 현미경으로 관찰하였다.
반응이 끝난 세포를 20 μg/mL의 PI 용액으로 염색하고 이미지를 형광 현미경으로 관찰하였다.
5 mM CaCl₂가 포함된 annexin V binding buffer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)에 부유시킨 다음 annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC) 및 propidium iodide (PI)를 처리하여 암실에서 20분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 35 mm mesh를 이용하여 단일세포로 분리하고 flow cytometer (Becton Dickinson)에 적용시켜 세포사멸이 유발된 세포를 형광반응에 따라 분석하였다.
) 용액을 처리하여 암하, 상온에서 20분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 상층액을 제거하고 PBS를 첨가하여 세포를 부유시킨 다음 flow cytometer에 적용시켜 MMP의 변화를 정량적으로 측정하였다.
그 후 1차 항체(Table 1)를 처리하여 상온에서 2시간 이상 반응시킨 후, PBS-T 용액(PBS with Tween 20)으로 세척하고 2차 항체를 상온에서 1시간 정도 반응시켰다. 반응이 끝난 후 암실에서 enhanced chemiluminescence solution (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA)을 적용시킨 다음 X-ray film에 감광시켜 해당 단백질의 발현 변화를 분석하였다. Immunoblotting을 위해 2차 항체로 사용된 horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse 및 anti-rabbit 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc.
5], 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Nonidet-P40, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 5 mM dithiothreitol)를 첨가하여 4℃에서 1시간 이상 반응시켰다. 상층액에 있는 단백질을 분리한 후 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동을 실시하였다. Gel에 함유된 단백질을 polyvinylidene difluoride membrane (Schleicher & Schuell Bioscience Inc.
세포독성 결과에서 선정된 농도를 대상으로 H2O2에 의한 산화적 스트레스로부터 EEPR의 보호 효과를 조사하기 위하여 5 μg/mL의 EEPR 또는 0.5 mM의 H2O2를 24시간 동안 단독으로 처리하거나, EEPR를 1시간 처리 후 H2O2를 24시간 처리된 조건에서 24시간 배양된 Chang 간세포를 대상으로 MTT 분석을 실시하였다.
75)에 차례로 현탁시켰다. 여기에 0.1 mM adenosine diphosphate (ADP)를 첨가하여 반응을 개시하고 microplate reader를 사용하여 5분간 모니터링 하면서 ATP의 생성량을 조사하였다.
이 결과에 준하여 Chang 간세포에 산화적 스트레스를 유발하기 위한 H2O2의 농도는 약 60% 정도의 생존율 감소를 보인 0.5 mM로 선정하였으며, 이에 대한 EEPR의 보호 효과를 조사하기 위한 처리 농도는 세포독성이 나타나지 않았던 5 μg/mL를 선정하여 추후 실험을 수행하였다.
) 용액으로 상온 암하에서 20분 동안 염색하였다. 이를 다시 PBS로 수세하여 건조시킨 후 형광현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) 하에서 핵의 형태를 비교하였다.
이를 위하여 0.5 mM의 H2O2 단독으로 1시간 동안 처리하거나, 5 μg/mL 의 EEPR을 1시간 전처리 후 H2O2에 다시 1시간 노출한 Chang 간세포를 대상으로 DCF-DA로 염색한 후 flow cytometry 분석을 실시하였다.
DNA 손상을 평가하기 위하여 Alkaline comet 분석법을 적용하였다. 이를 위하여 EEPR 및 H₂O₂가 단독 또는 동시 처리된 조건에서 배양된 세포를 모은 후 0.5% low-melting-point agarose와 혼합하였다. 이 혼합물을 37℃에서 normal agarose (1% in PBS)로 미리 코팅한 슬라이드 위에 펼쳐 놓고 5분 동안 얼음 팩 위에서 냉각시켰다.
Chang 간세포에서 EEPR의 산화적 스트레스 보호 효과를 조사하기 위하여 먼저 EEPR의 독성 여부를 조사하였다. 이를 위하여 다양한 농도의 EEPR을 단독 처리하여 24시간 배양한 후 MTT 분석을 실시하였다. 그 결과, EEPR의 처리 농도가 5 μg/mL 이하에서는 유의적인 세포독성을 관찰할 수 없었으나, 7.
에 의한 생존율 감소가 EEPR에 의해 억제되는 것이 EEPR의 세포사멸 유도 억제와 연관성이 있는 지를 확인하였다. 이를 위하여 전형적인 세포사멸이 일어난 세포의 핵에서 특이적으로 관찰되는 염색질의 응축(chromatin condensation)에 따른 apoptotic body의 형성을 DAPI 염색을 통하여 조사하였다. Fig.
이를 위하여 준비된 세포들에 10 μM의 5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide (JC-1; Sigma-Aldrich Chemical Co.) 용액을 처리하여 암하, 상온에서 20분 동안 반응시켰다.
이를 위하여 준비된 세포들을 10 μM의 DCF-DA로 20분간 염색하고 non-specific staining을 제거하기 위하여 PBS로 수세한 후 flow cytometer를 이용하여 ROS 생성량을 정량적으로 비교하였다.
이를 위하여 준비된 세포에서 분리된 30 μg의 미토콘드리아 pellet을 0.1% bovine serum albumin, 1 mM malate 및 1 mM glutamate를 함유한 buffer A (150 mM KCl, 25 mM Tris-HCl, 2 mM potassium phosphate, 0.1 mM MgCl2, pH 7.4)와 buffer B (0.8 mM luciferin and 20 mg/mL luciferase in 0.5 M Tris-acetate, pH 7.75)에 차례로 현탁시켰다.
이상에서 관찰된 EEPR의 산화적 스트레스에 의한 ROS 생성 및 세포사멸 억제 효과가 DNA 손상의 차단과 연관성이 있는지를 조사하였다. 이를 위하여 Comet 분석법에 의한 DNA 손상 연부를 관찰한 결과, H₂O₂가 단독 처리된 Chang 간세포에서는 DNA 손상에 따른 comet tail의 현저한 증가가 관찰되었으며, 이러한 현상은 EEPR의 전처리 조건에서는 대조군 수준으로 완벽하게 차단되었다(Fig.
, Maidstone, UK)로 여과한 후 농축하였으며, 농축물은 동결 건조하여 분말화하였으며 최종 수율은 27% 정도였다. 획득된 고형성분(EEPR)을 실험에 사용하기 위해서 dimethyl sulfoxide (DMSO; Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 이용하여 100 mg/mL의 농도로 만든 다음 이를 적정 농도로 세포 배양 배지에 희석하여 처리하였다.

대상 데이터

Chang 간세포(CCL-13; a human hepatoma cell line)는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 구입하였으며, 10% fetal bovine serum (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA), 100 U/mL의 penicillin 및 100 mg/mL의 streptomycin이 함유된 minimum essential medium (GibcoBRL)을 이용하여 37℃ 및 5% CO₂의 조건에서 배양하였다. H₂O₂에 의한 세포독성에 미치는 EEPR의 영향을 조사하기 위하여 Chang 간세포에 적정 농도의 EEPR 또는 H₂O₂ (Sigma-Aldrich Chemical Co.
)를 처리하여 형성된 formazan을 DMSO에 용해시킨 후 96 well plate에 200 μL 씩 옮겨서 Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도 변화를 측정하였다. 대조군으로는 N-acetyl cysteine (NAC; Sigma-Aldrich Chemical Co.)을 사용하였으며, 각 실험군에 대한 세포 생존율은 아래와 같이 대조군 기준으로 백분율로 나타내었다.
본 연구에 시용된 원지는 ㈜대한생약제품(Seoul, Korea)에서 구입하였으며, 세척하고 건조시킨 후 잘게 분쇄하였다. EEPR을 얻기 위하여 원지 100 g 당 70% 에탄올 1 L를 첨가하여 60℃, 150 rpm으로 3일간 교반 후 3,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 분리하였다.
1A). 아울러 Chang 간세포에 산화적 스트레스를 유발하기 위하여서 H₂O₂를 사용하였으며, H₂O₂ 단독 처리에 따른 Chang 간세포의 생존율을 분석한 결과, 0.3 mM 이상의 처리군에서부터 유의적인 생존율 감소가 관찰되었다(IC₅₀=0.67 mM; Fig. 1B). 이 결과에 준하여 Chang 간세포에 산화적 스트레스를 유발하기 위한 H₂O₂의 농도는 약 60% 정도의 생존율 감소를 보인 0.

데이터처리

모든 측정값은 3회 반복하여 측정하였고 평균값(mean)과 표준오차(Standard deviation)로 나타냈으며, 각 실험군 간의 통계분석은 Prism 5 (GraphPad Software; San Diego, CA, USA)를 사용하였고 one-way analysis of variance test 혹은 Student t-test를 통해 시행했다. 실험 결과의 통계적인 유의성은 P-value가 0.

이론/모형

5 mM H₂O₂ for 24 h after pre-treatment with or without 5 μg/mL EEPR or 10 mM NAC for 1 h. After treatment, cell viability was examined by the MTT assay. The data were shown as mean±standard deviation obtained from three independent experiments (* P<0.
DNA 손상을 평가하기 위하여 Alkaline comet 분석법을 적용하였다. 이를 위하여 EEPR 및 H₂O₂가 단독 또는 동시 처리된 조건에서 배양된 세포를 모은 후 0.

성능/효과

5 mM의 H₂O₂ 단독으로 1시간 동안 처리하거나, 5 μg/mL 의 EEPR을 1시간 전처리 후 H₂O₂에 다시 1시간 노출한 Chang 간세포를 대상으로 DCF-DA로 염색한 후 flow cytometry 분석을 실시하였다. Fig. 4A, B에 나타난 흡광도 변화의 결과에서 알 수 있듯이, 0.5 mM의 H₂O₂ 단독 처리군에서는 대조군에 비하여 현저하게 ROS생성이 증가하였다. 그리고 EEPR 단독 처리군에서는 대조군과 비교하여 큰 변화는 관찰되지 않았지만, EEPR은 H₂O₂에 의하여 유도된 ROS 생성을 효과적으로 차단하였으며, 이는 NAC 처리군에서도 유사하게 나타났다.
5 mM의 H₂O₂를 24시간 동안 단독으로 처리하거나, EEPR를 1시간 처리 후 H₂O₂를 24시간 처리된 조건에서 24시간 배양된 Chang 간세포를 대상으로 MTT 분석을 실시하였다. 그 결과, EEPR은 H₂O₂에 의한 Chang 간세포의 생존율 저하를 처리하지 않은 대조군에 비해 유의적으로 억제되었다(Fig. 2). 아울러 양성 대조군으로서 사용된 대표적인 항산화제인 NAC 처리군에서도 H₂O₂에 의한 세포독성이 유의적으로 억제되었다.
그 결과, EEPR의 처리 농도가 5 μg/mL 이하에서는 유의적인 세포독성을 관찰할 수 없었으나, 7.5 μg/mL 이상의 EEPR이 처리된 Chang 간 세포에서는 의존적으로 세포 생존율이 감소되었다(Fig. 1A).
5 mM의 H₂O₂ 단독 처리군에서는 대조군에 비하여 현저하게 ROS생성이 증가하였다. 그리고 EEPR 단독 처리군에서는 대조군과 비교하여 큰 변화는 관찰되지 않았지만, EEPR은 H₂O₂에 의하여 유도된 ROS 생성을 효과적으로 차단하였으며, 이는 NAC 처리군에서도 유사하게 나타났다. 또한 Fig.
5B, C). 따라서 H₂O₂에대한 EEPR의 세포사멸 유발 억제효과는 ROS 생성 차단과 연관된 DNA 손상의 억제와도 직접적인 연관성이 있음을 알 수 있었다.
그리고 EEPR 단독 처리군에서는 대조군과 비교하여 큰 변화는 관찰되지 않았지만, EEPR은 H₂O₂에 의하여 유도된 ROS 생성을 효과적으로 차단하였으며, 이는 NAC 처리군에서도 유사하게 나타났다. 또한 Fig. 4C, D의 형광 현미경을 이용한 관찰에서도 ROS 생성을 의미하는 초록 형광의 강도가 H₂O₂ 단독 처리군에서는 매우 강하게 나타났으나 EEPR이 존재하는 조건에서 배양된 Chang 간세포에서는 현저히 감소되었다. 이러한 결과는 H₂O₂에 의한 Chang 간세포의 생존율 저하 및 세포사멸 억제에 미치는 EEPR의 영향이 ROS 생성의 차단과 밀접한 연관성이 있음을 의미한다.
에 의해 유도된 산화적 스트레스, 미토콘드리아 기능 장애, DNA 손상 및 세포사멸을 효과적으로 막아 줄 수 있음을 확인하였다. 또한, EEPR은 Bcl-2/Bax의 발현 비율 감소를 정상 수준으로 회복시킬 수 있었으며 이는 ROS 생성 억제에 따른 미토콘드리아의 항상성 유지에 기여하였음을 추론할 수 있었다. 따라서 EEPR이 Chang 간세포에서 산화적 손상으로부터 보호할 수 있음을 의미한다.
6A). 미토콘드리아의 기능 상실은 전자 수송 체인의 손상을 초래하여 ATP 생산이 감소될 수 있기 때문에 ATP 생 성에 미치는 EEPR의 영향을 조사한 결과, H₂O₂에 노출된 세포에서 MMP의 소실과 함께 세포 내 ATP 농도는 정상 배지에서 배양된 세포와 비교하여 유의하게 감소하였다. 그러나 EEPR이 존재할 경우에는 H₂O₂에 의한 ATP의 감소가 유의적으로 회복되었다.
또한 γH2AX 단백질은 DNA 이중 나선이 산화적 스트레스에 의해 절단되었을 경우 인산화형의 발현이 증가하기 때문에 DNA 손상 마커로 활용된다^32,33). 본 연구 결과에 의하면, EEPR 처리에 의해 H₂O₂에 의한 MMP의 소실과 APT 함량 저하가 현저하게 억제되었다. 이러한 결과는 에너지 항상성 유지 관점에서 산화적 스트레스에 의한 간세포의 세포사멸 보호 효과가 미토콘드리아 기능 보존에 의한 ATP 생산 유지와 관련이 있음을 보여주는 이전의 연구 결과들과 일치하였다^34-36).
현재 산화적 스트레스에 대한 원지의 항산화 효능에 관한 연구는 보고된 바 없으며, 본 연구에서는 간세포에서 산화적 스트레스에 대한 원지 에탄올 추출물(ethanol extract of Polygalae radix, EEPR)의 억제 효과를 검증하였다. 본 연구결과에서 EEPR은 Chang 간세포(Chang liver cells)에서 과산화수소(hydrogen peroxide, H₂O₂)에 의한 ROS 생산 억제를 통해 DNA 손상과 세포사멸을 효과적으로 감소시켜줌을 확인 하였다.
본 연구에서 EEPR은 Chang 간세포에서 항산화 작용을 통해 H₂O₂에 의해 유도된 산화적 스트레스, 미토콘드리아 기능 장애, DNA 손상 및 세포사멸을 효과적으로 막아 줄 수 있음을 확인하였다. 또한, EEPR은 Bcl-2/Bax의 발현 비율 감소를 정상 수준으로 회복시킬 수 있었으며 이는 ROS 생성 억제에 따른 미토콘드리아의 항상성 유지에 기여하였음을 추론할 수 있었다.
비록 원지 추출물이 신경세포의 손상에 대한 효과에서 항산화 효능의 중요성이 일부 확인된 바 있으나^14,15) 산화적 스트레스에 대한 직접적인 방어 효능에 관한 연구는 매우 미비한 편이다. 본 연구의 결과에서 H₂O₂가 Chang 간세포 에서 ROS의 생산을 유도함으로써 DNA 손상을 활성화시키고 세포사멸을 유도한다는 것을 보여 주었다. 그러나 원지 에탄올 추출물(EEPR)은 ROS의 축적 감소를 통해 DNA 손상을 억제함으로써 H₂O₂ 유도 세포독성 및 세포사멸을 유의적으로 억제하였다.
3A에서 알 수 있 듯이, H₂O₂만이 단독으로 처리된 배지에서 배양된 Chang 간세포에서는 세포사멸이 유발되었음을 의미하는 염색질의 응축 및 apoptotic body 형성의 증가가 관찰되었으나, 이러한 형태적 변화가 5 μg/mL의 EEPR이 존재하는 조건에서 배양된 세포에서는 거의 관찰되지 않았다. 아울러 H₂O₂에 의해 유발된 세포사멸에 대한 EEPR의 효능을 정량적으로 평가하기 위하여 annexin V-FITC/PI 이중 염색을 통한 flow cytometry 분석을 실시한 결과, H₂O₂ 단독 처리군에서는 대조군에 비해 세포사멸 유발 세포의 빈도가 현저히 증가하였으나 EEPR의 전처리군에서는 H₂O₂ 단독 처리군에 비해 유의적으로 감소되었음을 알 수 있었다(Fig. 3B). 이러한 결과는 EEPR의 산화적 스트레스에 대한 세포독성 보호 효과가 세포사멸 억제와 직접 연관성이 있음을 의미 하는 것이다.
그러나 EEPR의 전처리에 의해서는 두 Bcl-2 family 단백질들의 발현이 대조군 수준으로 유지되었다. 이러한 결과들은 EEPR가 H₂O₂에 의한 Bcl-2 family 인자들의 발현 변화를 억제함으로써 미토콘드리아 기능 손상을 차단시켜 세포사멸 유도를 억제하였음을 보여주는 것이다.
그러나 EEPR이 존재할 경우에는 H₂O₂에 의한 ATP의 감소가 유의적으로 회복되었다. 이러한 결과를 고려할 때 H₂O₂에 의한 미토콘드리아의 기능 손상이 Chang 간세포에서 EEPR에 의하여 차단되었으며, 이는 ROS 생산의 억제와 밀접한 관련이 있음을 의미한다.
이상에서 관찰된 EEPR의 산화적 스트레스에 의한 ROS 생성 및 세포사멸 억제 효과가 DNA 손상의 차단과 연관성이 있는지를 조사하였다. 이를 위하여 Comet 분석법에 의한 DNA 손상 연부를 관찰한 결과, H₂O₂가 단독 처리된 Chang 간세포에서는 DNA 손상에 따른 comet tail의 현저한 증가가 관찰되었으며, 이러한 현상은 EEPR의 전처리 조건에서는 대조군 수준으로 완벽하게 차단되었다(Fig. 5A). 다음은 DNA 이중 나선 손상 지표로 널리 사용되는 γH2AX 단백질의 인산화(p-γH2AX, serine 139) 여부를 비교한 결 과, H₂O₂가 처리된 Chang 간세포에서는 대조군에 비하여 γH2AX 단백질의 전체적인 발현에는 큰 변화 없이 인산화가 매우 증가하였으나, EEPR이 존재하는 조건에서는 이러한 현상이 관찰되지 않았다(Fig.
다음은 Chang 간세포에서의 산화적 스트레스 억제가 미토콘드리아 기능 손상의 회복과 연계되어 있는지를 조사하였다. 이를 위하여 미토콘드리아 기능 손상을 의미하는 MMP 소실에 미치는 영향을 조사한 결과, H₂O₂ 단독 처리된 배지에서 배양된 Chang 간세포에서는 미토콘드리아 기능 손상을 의미하는 MMP 소실이 매우 증가되었으나, EEPR에 의해 이러한 현상이 유의적으로 차단되었다(Fig. 6A). 미토콘드리아의 기능 상실은 전자 수송 체인의 손상을 초래하여 ATP 생산이 감소될 수 있기 때문에 ATP 생 성에 미치는 EEPR의 영향을 조사한 결과, H₂O₂에 노출된 세포에서 MMP의 소실과 함께 세포 내 ATP 농도는 정상 배지에서 배양된 세포와 비교하여 유의하게 감소하였다.

후속연구

이러한 관점에서 EEPR은 Bax/Bcl-2 발현율의 증가를 감소시킴으로써 H₂O₂에 의해 유발된 세포사멸을 억제하였음을 의미한다. 그러나 EEPR에 의한 세포사멸의 억제 효과가 caspase 신호전달 경로에 영향을 미치는지 외인성 및 내인성 경로 차단에 대한 추가적인 기전 연구가 필요할 것으로 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	원지란?	원지(遠志, Polygalae radix)는 원지과(遠志科: Polygalacea)에 속하는 다년생 초본인 원지(Polygala tenuifolia Willd) 뿌리의 목심 부위를 제거하고 건조한 것으로 전통적으로 거담제, 기억력 증진제, 수면 보조제 등으로 사용되어 왔다1). 원지에 함유된 주요 성분으로는 다양한 saponins, xanthones, oligosaccharide esters 등이 보고되었으며, 이들로 인하여 흥분을 진정시키고 가래를 제거하며 기침을 멈추는 기능을 발휘하거나2-7), 항치매, 퇴행성 뇌세포 보호, 신경 손상 보호, 항우울제 등의 효능을 나타내기도 한다8-11).
	원지 열수 추출물의 장점은?	또한 원지는 진통제, 항비만, 항진균제, 항암제 등으로의 개발 가능성이 있음이 보고된 바 있다12,13). 특히 원지 열수 추출물은 6-hydroxydopamine에 의해 유발된 신경 독성에 대한 보호 효과작용을 가지며, 이는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성의 억제에 따른 항산화 작용에 의한 신경세포의 세포 사멸(apoptosis) 억제와 관련이 있다14). 아울러 원지 추출물은 N-methyl-D-aspartate 처리에 의한 중추 신경계 손상의 차단 효과가 보고된 바 있으며, 이 또한 ROS의 생성 차단과 연관성이 있다15).
	간세포에서 원지 에탄올 추출물의 효과는?	현재 산화적 스트레스에 대한 원지의 항산화 효능에 관한 연구는 보고된 바 없으며, 본 연구에서는 간세포에서 산화적 스트레스에 대한 원지 에탄올 추출물(ethanol extract of Polygalae radix, EEPR)의 억제 효과를 검증하였다. 본 연구결과에서 EEPR은 Chang 간세포(Chang liver cells)에서 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2)에 의한 ROS 생산 억제를 통해 DNA 손상과 세포사멸을 효과적으로 감소시켜줌을 확인 하였다.

참고문헌 (44)

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10.1691/ph.2016.6714

저자의 다른 논문 :

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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