[논문]토양에서 분리한 국내 미기록종 Pseudomonas 속 6종의 생화학적 특성과 계통 분류

김현중; 정유정; 김해영; 허문석

doi:10.7845/kjm.2019.8099

토양에서 분리한 국내 미기록종 Pseudomonas 속 6종의 생화학적 특성과 계통 분류
Isolation and characterization of 6 unrecorded Pseudomonas spp. from Korean soil 원문보기

Korean journal of microbiology = 미생물학회지, v.55 no.1, 2019년, pp.39 - 45

김현중 (경희대학교 생명과학대학 식품생명공학 전공) , 정유정 (국립생물자원관 생물자원연구부 미생물자원과) , 김해영 (경희대학교 생명과학대학 식품생명공학 전공) , 허문석 (국립생물자원관 생물자원연구부 미생물자원과)

초록
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생명공학산업의 주요한 자원인 미생물의 가치는 날로 증대하고 있으며, 이로 인해 생물자원을 확보하기 위한 국가간의 경쟁은 심화되고 있다. 이에 다양한 환경에서 미생물자원을 발굴하고 특성을 확인하는 것은 미래의 잠재적 생물자원을 확보하는데 큰 의미가 있다. 본 연구에서는 Pseudomonas속에 속하는 6종의 미생물들을 일반 토양에서 분리하여 분자계통학적 분석을 통해 국내 미기록종임을 확인하였다. 본 연구로 확보된 미생물들은 자생 생물자원의 다양성을 늘리고, 산업계에 생물자원의 선택의 폭을 늘리는데 도움이 될 것으로 기대된다.

Abstract ▼ AI-Helper

In 2017, as a study to discover indigenous prokaryotic species in Korea, a total of 6 bacterial strains assigned to the genus Pseudomonas were isolated from soil. From the high 16S rRNA gene sequence similarity (${\geq}99.5%$) and phylogenetic analysis with closely related species, the isolated strains were identified as independent Pseudomonas species which were unrecorded in Korea. The six Pseudomonas species were Pseudomonas mandelii, P. canadensis, P. thivervalensis, P. jessenii, P. lurida, and P. brenneri. Gram reaction, culture conditions, colony and cell morphology, basic physiological and biochemical characteristics are described in the species description section.

주제어

표/그림 (4)

그림 Fig. 1. Phylogenetic tree of Pseudomonas spp. based on the 16S rRNA gene sequence analysis using the neighbor-joining method showing the position of the newly isolated Pseudomonas strains (highlighted in bold) compared with the closely reference Pseudomonas strains.
표 Table 1. Pseudomonas strains isolated from soil in this study
그림 Fig. 2. Transmission electron micrograph of isolated Pseudomonas spp.
표 Table 2. Physiological and biochemical characteristics and differential carbohydrate assimilation patterns of isolated Pseudomonas spp. using API 20NE (2.1) kit, API ZYM kit, and API 32GN kit

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 국내에 존재하는 자생 미생물 자원의 확보를 목적으로 2017년 전라남도와 강원도 지역의 토양 시료로부터 다양한 미생물을 분리하였고, 동정 결과 6종의 Pseudomonas속 미생물이 국내 미기록 종으로 확인되었으며, 이들의 계통분류학적, 형태학적, 생화학적 특징에 대하여 분석하였다. 미생물 분리를 위하여 2017년 5월에 전라남도 함평군 함평읍 성남리(126°29'45.

제안 방법

생리학적, 생화학적인 특성은 API 20NE, API ZYM 및 API32GN kit (bioMérieux)를 사용하여 미생물의 다양한 효소 활성 및 당의 이용성을 확인하였다[Table 2]. G+C mol% 분석은 추출한 genomic DNA를 nucleoside 단위로 분해한 뒤, reverse phase HPLC를 사용하여 분석하였다(Mesbah et al., 1989).
Universal primer 27F(5'-GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')와 1492R (5'-GGT TACCTT GTT ACG ACT T-3') (Lane, 1991; Weisburg et al., 1991)을 사용하여 각 미생물의 16S rRNA 유전자를 polymerase chainreaction (PCR)으로 증폭하였다.
토양시료를 배양한 배지는 PBS 용액을 이용하여 연속희석법(serial dilution)으로 희석하였으며, 10³~10⁵ 희석액 200 µl를 각각의 고체배지에 도말 한 후 30°C 배양기에서 24~48시간 동안 배양하였다. 배양한 단일 군집들 중 형태, 색상 및 크기 등의 형태학적 특성을 비교하여 미생물을 선별하였고 동일한 분리 배지 및 온도에서 24 시간 동안 배양하여 순수분리 하였다.
순수분리한 미생물은 분자생물학적인 기법을 이용하여 계통 분류학적인 분석을 완료한 후 미생물의 동정을 실시하였다. 분리된 미생물의 계통 분류학적 분석을 위하여 genomicDNA extraction kit (GeneAll)를 사용하여 각 미생물의 배양체로부터 genomic DNA를 추출하였다. Universal primer 27F(5'-GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')와 1492R (5'-GGT TACCTT GTT ACG ACT T-3') (Lane, 1991; Weisburg et al.
분리된 미생물의 생리학적 실험은 미생물의 분리에 사용되었던 M17 및 TSB 배지에서 이루어졌으며, Gram stain kit(Sigma-Aldrich)를 이용하여 그람 염색을 실시한 후 광학현미경(CX23, Olympus)을 통하여 염색결과를 확인하였다.
생리학적, 생화학적인 특성은 API 20NE, API ZYM 및 API32GN kit (bioMérieux)를 사용하여 미생물의 다양한 효소 활성 및 당의 이용성을 확인하였다[Table 2].
순수분리한 미생물은 분자생물학적인 기법을 이용하여 계통 분류학적인 분석을 완료한 후 미생물의 동정을 실시하였다. 분리된 미생물의 계통 분류학적 분석을 위하여 genomicDNA extraction kit (GeneAll)를 사용하여 각 미생물의 배양체로부터 genomic DNA를 추출하였다.
온도 및 pH의 생장 조건 실험은 M17, TSB 액체 배지를 이용하여 4°C~45°C (10°C 간격으로 배양) 및 pH 4.0~10.0 (pH 4, 6, 8,10)까지의 범위에서 배양되어지는 미생물의 균체 흡광도(A600nm, Spark 10M, TECAN)를 측정하여 확인하였다.
이를 위하여 Dyne ready-2XGo (DYNEBIO) 10 μl와 3차 증류수 7 μl, forward primer와 reverse primer를 각각 10 pmol씩 넣고, genomic DNA를 1 μl넣어 총 20 μl의 PCR 반응액을 만들어 PCR을 수행하였다(Weisburg et al., 1991).
, 1991). 증폭된 PCR 산물은 1.5% (w/v) agarosegel 전기영동법을 이용하여 크기를 확인하였고, PCR purification kit (Cosmo Genetech)를 이용하여 정제한 뒤 유전자 염기서열을 분석하였다. 분석된 16S rRNA 유전자 염기서열(~1,474 bp)은 Seqman software (DNASTAR) 프로그램을 통하여 편집하였다.
채취한 토양시료에서 미생물을 배양하기위하여 토양 시료 4 g을 각각의 25 ml 배지[M17 (BD), TrypticSoy Broth (TSB, BD)]에 침지하여 48시간 동안 30°C에서 배양하였다.
토양시료를 배양한 배지는 PBS 용액을 이용하여 연속희석법(serial dilution)으로 희석하였으며, 103~105 희석액 200 µl를 각각의 고체배지에 도말 한 후 30°C 배양기에서 24~48시간 동안 배양하였다.
분석된 16S rRNA 유전자 염기서열(~1,474 bp)은 Seqman software (DNASTAR) 프로그램을 통하여 편집하였다. 편집된 16S rRNA 유전자 염기서열은 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)와 EzBioClould (www.ezbiocloud.net)를 이용하여 상동성이 높은 유전자 서열을 확인하고 분석을 하였다. 확보된 유사한 미생물들과 분리된 미생물의 16S rRNA 유전자 서열을 BioEdit 프로그램을 이용하여 정렬한 뒤, MEGA6 프로그램(Tamura et al.
형태학적 특징은 전자현미경(transmission electron microscopy, JEM1010, JEOL)을 사용하여 관찰하였다(Schädler et al., 2008).
확보된 유사한 미생물들과 분리된 미생물의 16S rRNA 유전자 서열을 BioEdit 프로그램을 이용하여 정렬한 뒤, MEGA6 프로그램(Tamura et al., 2013)의 Kimura2-parameter model (Kimura, 1983)과 neighbor-joining algorithms (Saitou and Nei, 1987)을 사용하여 계통수(Phylogenetic trees)를 작성하였다.

대상 데이터

미생물 분리를 위하여 2017년 5월에 전라남도 함평군 함평읍 성남리(126°29'45.9"E, 35°02'52.6"N, 31 m)와 강원도 정선군 화암면 백전리(128°53'55.6"E, 37°14'32.8"N, 711 m)의 토양 시료를 채취하였다.

데이터처리

5% (w/v) agarosegel 전기영동법을 이용하여 크기를 확인하였고, PCR purification kit (Cosmo Genetech)를 이용하여 정제한 뒤 유전자 염기서열을 분석하였다. 분석된 16S rRNA 유전자 염기서열(~1,474 bp)은 Seqman software (DNASTAR) 프로그램을 통하여 편집하였다. 편집된 16S rRNA 유전자 염기서열은 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)와 EzBioClould (www.

성능/효과

본 연구를 통하여 전라남도 함평군과 강원도 정선군 화암면 백전리에서 채취한 토양으로부터 형태학적으로 다양한 미생물단일 군집을 분리할 수 있었으며 16S rRNA유전자 서열 분석을 통하여 Pseudomonas속에 속하는 총 6종의 국내 미기록종을 분리하였다[Table 1 and Fig. 1]. 분리된 6종의 Pseudomonas 속 미생물은 16S rRNA 유전자 서열 분석 결과, 국외에서 보고된Pseudomonas 종들과 최소 99.
분리된 6종의 Pseudomonas 속 미생물은 16S rRNA 유전자 서열 분석 결과, 국외에서 보고된Pseudomonas 종들과 최소 99.5% 이상의 유전자 염기서열 상동성이 확인되었으며 각각 Pseudomonas mandelii, Pseudomonas canadensis, Pseudomonas thivervalensis, Pseudomonasbaetica, Pseudomonas lurida, 및 Pseudomonas brenneri로 확인 되었다(Verhille et al., 1999; Achouak et al., 2000; Baïda etal., 2001; Behrendt et al., 2007; López et al., 2012; Tambong etal., 2017).
8"N, 711 m)의 토양 시료를 채취하였다. 조사지역은 농경 및 거주 등의 이용이 없는 나대지이며, 약산성 또는 중성(함평군: pH 4.7, 정선군: pH 7.7)으로 확인되었다. 채취한 토양시료는 실험 전까지 4°C에서 냉장 보관하였다.

후속연구

따라서 다른 환경에서 분리된 종들의 특성을 분석하고 비교하는 것은 다양한 환경 내에서 미생물들의 생태학적 기능을 이해하는데 중요한 자료로 활용될 수 있다. 본 연구를 통한 국내 미기록 미생물의 발굴과 특성 분석 결과는 미생물의 생태적 기능 파악과 산업적 응용을 위한 자생 미생물의 자원화에 유용한 정보를 제공할 수 있을 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Pseudomonas속 미생물은 분류학상으로 어디에 속하는 미생물인가?	, 2010) 일부 종은 식물의 생장을 돕기도 하는 것으로 알려져 있다(Palleroni, 1984). Pseudomonas속 미생물은 분류학상으로 Proteobacteria (문), Gammaproteobacteria (강), Pseudomonadales (목), Pseudomonadaceae (과)에 속하는 미생물로 토양 등의 자연계에 널리 분포, 존재하는 미생물이다(Peix et al., 2009).
	Pseudomonas속 미생물의 공통된 특징은?	, 1966), 동·식물, 토양, 해수 그리고 담수 등의 광범위한 자연 환경에서 분리가 되는 것으로 확인된다(Palleroni, 1984). Pseudomonas속 미생물의 공통된 특징은 그람 음성(Gram-negative), 호기성, Oxidase양성 또는 음성, Catalase 양성, 형태학적으로 간균의 모양을하고 있다. DNA의 GC 함량은 58~69 mol%이며 하나 혹은 몇개의 극편모(polar flagella)를 이용하여 운동성을 갖는 것으로 알려져 있으며, 현재까지 총 253개 종이 보고 되어 있다(http://www.
	Pseudomonas속 미생물 몇 종은 생물질을 포함한 800여 종의 생리활성 물질을 생산한다고 알려져 있는데, 이들은 환경에서 어떤 역할을 하는가?	, 2010). Pseudomonas속 몇 종은 항생물질을 포함한 800여 종의 생리활성 물질을 생산한다고 알려져 있으며(Berdy, 2005) 환경에서 다양한 생태학적 역할을 수행하고 있다. 비병원성으로 알려져 있으나 일부 종은 식물, 동물 또는 인간에 병원성을 일으키기도 하며(Anzai et al., 2000; Peix et al., 2009; Mulet et al., 2010) 일부 종은 식물의 생장을 돕기도 하는 것으로 알려져 있다(Palleroni, 1984). Pseudomonas속 미생물은 분류학상으로 Proteobacteria (문), Gammaproteobacteria (강), Pseudomonadales (목), Pseudomonadaceae (과)에 속하는 미생물로 토양 등의 자연계에 널리 분포, 존재하는 미생물이다(Peix et al.

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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