[논문]인간 표피 각질형성세포에서 대기 미립자 물질 PM10에 의해 유도되는 반응성 산소종의 생성에서 Dual oxidase 2의 역할

석진경; 최민아; 하재원; 부용출

doi:10.15230/scsk.2019.45.1.57

인간 표피 각질형성세포에서 대기 미립자 물질 PM10에 의해 유도되는 반응성 산소종의 생성에서 Dual oxidase 2의 역할
Role of Dual Oxidase 2 in Reactive Oxygen Species Production Induced by Airborne Particulate Matter PM10 in Human Epidermal Keratinocytes 원문보기

大韓化粧品學會誌 = Journal of the society of cosmetic scientists of Korea, v.45 no.1, 2019년, pp.57 - 67

석진경 (경북대학교 의과대학 분자의학교실, BK21플러스 KNU의생명융복합창의인재양성사업단, 세포기질연구소) , 최민아 (경북대학교 의과대학 분자의학교실, BK21플러스 KNU의생명융복합창의인재양성사업단, 세포기질연구소) , 하재원 (경북대학교 의과대학 분자의학교실, BK21플러스 KNU의생명융복합창의인재양성사업단, 세포기질연구소) , 부용출 (경북대학교 의과대학 분자의학교실, BK21플러스 KNU의생명융복합창의인재양성사업단, 세포기질연구소)

초록
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직경 $10{\mu}m$ 미만의 대기 미립자 물질(particulate matter, PM10)은 다양한 신체기관에서 산화 스트레스와 염증반응을 유발한다. 본 연구의 목적은 인간 표피 각질형성세포(HEK)에서 PM10에 의해 유도되는 반응성 산소종(ROS) 생성의 메커니즘을 알아보는 것이다. 배양된 HEK를 PM10에 노출시켰을 때 ROS가 증가하였으며, 이는 항산화제 apocynin에 의해 저해되었다. PM10에 의해 유도되는 ROS 생성에서 NADPH oxidase(NOX) family의 역할을 규명하기 위하여 이들의 mRNA 발현을 분석하였다. PM10은 NOX1, NOX2, dual oxidase (DUOX)1 및 DUOX2의 mRNA 발현을 증가시켰다. 다른 NOX들에 비교하여 DUOX1 및 DUOX2의 발현 수준이 높았으며, 이들 효소의 maturation factors, 즉 DUOXA1와 DUOXA2의 mRNA 발현도 PM10에 의하여 증가하였다. 칼슘 의존성 효소인 DUOX1과 DUOX2가 PM10에 의해 유도되는 ROS의 생성을 매개하는지 조사하였다. 선택적인 세포내 칼슘 킬레이터인 BAPTA-AM은 PM10 및 칼슘 ionophore A23187에 유도된 ROS 생성을 감소시켰다. 작은 간섭 RNA (siRNA)에 의한 DUOX2의 하향 조절은 PM10에 의해 유도된 ROS의 생성을 감소시켰고 DUOX1 siRNA는 영향이 없었다. PM10은 interleukin $(IL)-1{\beta}$, IL-6, IL-8 및 interferon $(IFN)-{\gamma}$ 등 사이토카인의 발현을 증가시켰다. siRNA에 의한 DUOX2의 하향 조절은 $IFN-{\gamma}$의 발현을 저해하였지만 다른 사이토카인의 발현은 저해하지 않았다. 본 연구는 PM10에 노출된 HEK의 ROS 생성 및 염증 반응에서 DUOX2가 중요한 역할을 함을 시사한다.

Abstract ▼ AI-Helper

Particulate matters with a diameter of < $10{\mu}m$ (PM10) exert oxidative stress and inflammatory events in various organs. The purpose of this study was to examine the molecular mechanism of reactive oxygen species (ROS) production induced by PM10 in the human epidermal keratinocytes (HEKs). When cultured HEKs were exposed to PM10, ROS production was induced and it was inhibited by apocynin, an antioxidant. The mRNA expression of NADPH oxidase (NOX) family was analyzed in order to examine their role in PM10-induced ROS production. PM10 increased the mRNA expression of NOX1, NOX2, dual oxidase (DUOX) 1 and DUOX2. HEKs expressed DUOX1 and DUOX2 at higher levels compared to other NOXs. The mRNA expression of dual oxidase maturation factors, DUOXA1 and DUOXA2, was also increased by PM10. We examined whether these calcium-dependent enzymes, DUOX1 and DUOX2, mediate the PM10-induced ROS production. A selective intracellular calcium chelator, BAPTA-AM, attenuated ROS production induced by PM10 or calcium ionophore A23187. The small intereference RNA (siRNA)-mediated down-regulation of DUOX2, but not DUOX1, attenuated the ROS production induced by PM10. PM10 increased the expression of inflammatory cytokines such as interleukin $(IL)-1{\beta}$, IL-6, IL-8 and interferon $(IFN)-{\gamma}$. SiRNA-mediated down-regulation of DUOX2 suppressed the PM10-induced expression of $IFN-{\gamma}$ but not other cytokines. This study suggests that DUOX2 plays a crucial role in ROS production and inflammatory response in PM10-exposed keratinocytes.

주제어

표/그림 (7)

표 Table 1. Sequences of primers used for PCR amplification of gene transcripts
그림 Figure 1. PM10 stimulates ROS production in HEKs. HEKs were pretreated with apocynin (500 μM) or vehicle. And then the cells were loaded with H₂DCFDA (10μM) and stimulated with PM10 (100 μg/mL). DCF fluorescence was visualized after 30 min. Representative images of 3 separate analyses are shown. The graph shows the quantification of fluorescent cells. Data are expressed as folds compared to control values. Means ± SEM, n = 3. * p < 0.05.
그림 Figure 2. Effects of PM10 on the mRNA expressions of NOX family in HEKs. Cells were exposed to PM10 at increasingconcentrations (0, 3, 10, 30, 100 μg/mL) for 24 h. The mRNA expressions of NOX1, NOX2, NOX3, NOX4, NOX5, DUOX1 andDUOX2 were determined by qRT-PCR and normalized to that of GAPDH. Data are expressed as folds compared to control values.Means ± SEM, n = 3. * p < 0.05.
그림 Figure 3. Effects of PM10 on the mRNA expressions of DUOXs maturation factors in HEKs. Cells were exposed to PM10 at the indicated concentrations for 24 h. The mRNA expressions of DUOXA1 and DUOXA2 were determined by qRT-PCR and normalized to that of GAPDH. Data are expressed as folds compared to control values. Means ± SEM, n = 3. * p < 0.05.
그림 Figure 4. PM10 stimulates ROS production by a calcium-dependent mechanism in HEKs. Where indicated, cells were pretreated with BAPTA-AM for 30 min at the specified concentrations. Cells were loaded with H₂DCFDA (10 μM) for 30 min and stimulated with PM10 or A23187 at the indicated concentrations for 30 min. The fluorescent dye was extracted from the cells and quantified by measuring fluorescence intensity. Data are expressed as folds compared to control values. Means ± SEM, n = 3. * p < 0.05.
그림 Figure 5. PM10-induced ROS production is attenuated by siRNA-mediated down-regulation of DUOX2, but not DUOX1. The cells were transfected with siRNAs for DUOX1(siDUOX1 #1 and #2) and DUOX2 (siDUOX2 #1 and #2), or negative control (NC, oligonucleotide duplex with scrambled sequences), and incubated for 48 h. The mRNA expressions were determined by qRT-PCR and normalized to control GAPDH. For ROS measurement, the cells were loaded with H₂DCFDA (10 μM) for 30 min and stimulated with PM10 (100 μg/mL) for 30 min. The fluorescent dye was extracted from the cells and quantified by measuring fluorescence intensity. Data are expressed as folds compared to control values. Means ± SEM, n = 3. * p < 0.05.
그림 Figure 6. SiRNA-mediated down regulation of DUOX2 suppresses PM10-induced expression of IFN-γ but not other cytokines. The cells were transfected with a siRNA for DUOX2 (siDUOX2 #1) or negative control (NC, oligonucleotide duplex with scrambled sequences) for 48 h followed by exposure to PM10 (100 μg/mL) for 24 h. The mRNA expression levels were determined by qRT-PCR and normalized to control GAPDH. Data are expressed as folds compared to control values. Means ± SEM, n = 3. * p < 0.05.

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구의 목적은 인체 표피 각질형성세포에서 PM10에 의해 유도되는 ROS 생성에서 NOX family, 특히 DUOX2의역할에 대해 알아보는 것이다.

제안 방법

DUOX1과 DUOX2의 활성을 나타내기 위한 필수 요소인 maturation factors의 발현도 측정하였다. HEK에서 DUOX1의 maturation factor인 DUOXA1과 DUOX2의 maturation factor인 DUOXA2의 발현도 PM10의 농도에 의존적으로 증가되었다(Figure 3).
DUOX2의 발현과 염증성 사이토카인의 발현간의 관련성을 알아보고자 siDUOX2를 transfection한 HEK에 PM10을 처리하여 DUOX2 및 사이토카인들의 mRNA 발현을 분석하였다. PM10에 의해 유도된 DUOX2의 mRNA 발현은 10nM 이상의 siDUOX2에 의해 유의하게 억제되었고, PM10에 의해 유도된 인터페론 (interferon, IFN)-γ의 mRNA 발현도 100 nM siDUOX2에 의해 억제되었다.
HEK에 선택적 칼슘이온의 킬레이터인 BAPTA-AM을 처리한 후 PM10과 A23187에 의한 ROS 생성 변화를 측정하였다. 먼저 PM10의 농도를 달리하여 HEK에 처리한 결과 3 μg/mL 이상의 농도에서 ROS 생성이 증가되었다.
HEK에서 PM10 농도에 따른 NOX family의 mRNA 발현변화를 알아보았다. 각각의 PM10를 처리하지 않은 군과 비교하였을 때 NOX1, NOX2, DUOX1, DUOX2의 mRNA 발현이 유의하게 증가하였다(Figure 2).
PM10에 의한 ROS 생성에 있어 DUOX1과 DUOX2의 역할을 알아보고자 각각에 대한 siRNA를 2 종류씩 사용하여 HEK에 transfection 하고 mRNA 발현과 ROS 생성을 측정하였다. DUOX1의 mRNA 발현이 2종류의 siDUOX1에 의해 저해되었으나, 2종류의 siDUOX2와 음성 대조에 의해서는 영향을 받지 않았다.
PM10이 ROS를 생성하는지 알아보고자 항산화제인 apocynin 처리 유무 조건에서 HEK를 PM10에 노출시켰다. 세포 내 발생하는 ROS는 형광현미경을 통해 확인하였다.
본 연구는 DUOX1과 DUOX2 및 각각의 maturation factor인 DUOXA1과 DUOXA2의 발현이 PM10에 증가됨을 보여주었다. 또한 DUOXs는 세포내 칼슘 결합-EF-hands 도메인을 통해 활성화 되어 H₂O₂를 유도하므로 칼슘이온의 유무에 따른 ROS 생성을 알아보았다. 그 결과 PM10과 A23187에 의해 유도된 ROS의 생성이 칼슘 킬레이터인 BAPTA-AM에 의해 감소됨을 확인하였다.

대상 데이터

대기 미립자 물질(PM10, 유럽 표준물질 ERM-CZ120),1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acidtetrakis (acetoxymethyl ester) (BAPTA-AM), A23187와 2’7’-dichlorodihydro fluoresccein diacetate (H₂DCFDA)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) 에서 구매하였다.
성인의 표피 HEK(Invitrogen, USA)는 10% EpiLife Defined Growth supplement과 항생제(100 U/mL 페니실린,100 μg/mL 스트렙토마이신, 0.25 μg/mL 암포테리신 B)을 포함하는 EpiLife 배지(Gibco BRL, Grand lsland, USA)에서 배양하였다. 세포는 5% CO₂ 와 공기 95% 의 37 ℃ 에서 배양하였다.
인간 DUOX1 (Gene ID; 53905) 및 DUOX2 (Gene ID;50506)에 대한 siRNA와 음성 대조 올리고는 ㈜바이오니아(Daejeon, Korea)에서 구입하였다. 본 연구에 사용된 siRNA서열은 siDUOX1 #1, (sense) 5 ‘-CAG GAU ACC GGCCAU UUC U-3’과 (antisense) 5 ‘-AGA AAU GGC CGGUAU CCU G-3’; siDUOX1 #2, (sense) 5 ‘-CAC AAC UAAUUU CAC CCA A-3’과 (antisense) 5 ‘-UUG GGU GAAAUU AGU UGU G-3’; siDUOX2 #1, (sense) 5 ‘-GUG AUCUCA ACC CUA AUG U-3’과 (antisense) 5 ‘-ACA UUAGGG UUG AGA UCA C-3’; siDUOX2, #2, (sense) 5 ‘-CAGUCA AUG UCU ACA UCU U-3’과 (antisense) 5 ‘-AAGAUG UAG ACA UUG ACU G-3’이다.

데이터처리

모든 데이터의 결과는 3 회 이상의 독립적인 실험의 평균과 표준오차로 나타내었다. 실험군 간의 통계 처리는 SigmaStat v.3.11 software (Systat Software Inc, San Jose,USA)를 사용하여 일원배치분산 분석(one-way ANOVA)을 한 후 p < 0.05 수준에서 유의성을 결정하였다.

성능/효과

그 결과 PM10과 A23187에 의해 유도된 ROS의 생성이 칼슘 킬레이터인 BAPTA-AM에 의해 감소됨을 확인하였다. DUOX1과 DUOX2의 siRNA를 처리하여 각각의 발현을 저해시킨 후 ROS 생성을 확인해본 결과 DUOX1이 아닌 DUOX2의 발현 억제가 PM10에 의한 ROS의 생성을 감소시킴을 알 수 있었다. 따라서 본 연구는 PM10에 의해 다양한 경로로 발생되는 ROS의 생성에 있어서 특히 DUOX2 의존성 메커니즘이 중요함을 시사한다.
DUOX2의 발현과 염증성 사이토카인의 발현간의 관련성을 알아보고자 siDUOX2를 transfection한 HEK에 PM10을 처리하여 DUOX2 및 사이토카인들의 mRNA 발현을 분석하였다. PM10에 의해 유도된 DUOX2의 mRNA 발현은 10nM 이상의 siDUOX2에 의해 유의하게 억제되었고, PM10에 의해 유도된 인터페론 (interferon, IFN)-γ의 mRNA 발현도 100 nM siDUOX2에 의해 억제되었다. 그러나 PM10에 의해 유도된 IL-1β의 mRNA 발현에는 siDUOX2가 영향을 미치지 않았으며, IL-6 와 IL-8의 mRNA 발현은 100nM siDUOX2에 의해 더 증가되었다(Figure 5).
결론적으로 본 연구는 PM10에 노출된 HEK에서 ROS의 생성 및 염증 반응에서 DUOX2가 중요한 역할을 함을 시사한다.
또한 DUOXs는 세포내 칼슘 결합-EF-hands 도메인을 통해 활성화 되어 H₂O₂를 유도하므로 칼슘이온의 유무에 따른 ROS 생성을 알아보았다. 그 결과 PM10과 A23187에 의해 유도된 ROS의 생성이 칼슘 킬레이터인 BAPTA-AM에 의해 감소됨을 확인하였다. DUOX1과 DUOX2의 siRNA를 처리하여 각각의 발현을 저해시킨 후 ROS 생성을 확인해본 결과 DUOX1이 아닌 DUOX2의 발현 억제가 PM10에 의한 ROS의 생성을 감소시킴을 알 수 있었다.
소포체와 같은 세포 내 소기관의 칼슘 축적은 표피의 칼슘 구배를 형성하는 주요 구성 요소이며, 칼슘 항상성이 각질형성세포의 분화, 세포 간 접합 형성, 항균 장벽 및 투과성을 조절하는데 중요하다[24-26]. 따라서 PM10에 의한 칼슘 의존적 ROS 생성은 이러한 분화 마커의 발현 증가를 야기하여 각질형성세포의 비정상적인 분화를 촉진할 것으로 예상할 수 있다. PM10에 의한 ROS 생성에 대하여 칼슘을 매개로 한 DUOX2 관련 메커니즘의 연구는 피부 장벽의 손상과 피부 노화에 있어 중요할 실마리를 제공할 것으로 사료된다.
HEK에 선택적 칼슘이온의 킬레이터인 BAPTA-AM을 처리한 후 PM10과 A23187에 의한 ROS 생성 변화를 측정하였다. 먼저 PM10의 농도를 달리하여 HEK에 처리한 결과 3 μg/mL 이상의 농도에서 ROS 생성이 증가되었다. 또한 PM10에 의한 ROS 생성이 BAPTA-AM의 농도에 의존적으로 감소되었다.
본 연구는 DUOX1과 DUOX2 및 각각의 maturation factor인 DUOXA1과 DUOXA2의 발현이 PM10에 증가됨을 보여주었다. 또한 DUOXs는 세포내 칼슘 결합-EF-hands 도메인을 통해 활성화 되어 H₂O₂를 유도하므로 칼슘이온의 유무에 따른 ROS 생성을 알아보았다.
본 연구에서 DUOX2의 siRNA가 PM10에 의한 IL-1β의 발현에는 영향을 미치지 않았고 IL-6과 IL-8의 발현은 증가시켰다. 각질형성세포에서 IL-1β는 염증 반응을 상향 조절하며[32], IL-6는 건선과 같은 특정 피부 질환에서 중추적인 역할을 하는 염증성 사이토카인 중 하나이고[33],IL-8은 혈관 신생과 상처 치유에 중요한 역할을 매개하는 케모카인이다[34].
본 연구에서 PM10에 의해 증가된 IFN-γ의 발현이 DUOX2의 하향 조절에 의해 감소되었다. 전 연구들에 따르면 DUOX2의 발현은 IFN-γ에 의해서 조절이 되며[27,28], 반대로 IFN-γ의 발현도 DUOX2의 발현과 상관관계가 있다[29].

후속연구

IFN-γ가 DUOX2 발현을 다양한 신호 조절 경로를 통해 조절하므로[31] PM10에 의해 유도된 DUOX2가 IFN-γ의 발현을 조절하는 과정도 매우 복잡할 것이라 예상된다. DUOX2과 IFN-γ가 상호 관련된 메커니즘에 대한 후속 연구가 필요하다.
따라서 PM10에 의한 칼슘 의존적 ROS 생성은 이러한 분화 마커의 발현 증가를 야기하여 각질형성세포의 비정상적인 분화를 촉진할 것으로 예상할 수 있다. PM10에 의한 ROS 생성에 대하여 칼슘을 매개로 한 DUOX2 관련 메커니즘의 연구는 피부 장벽의 손상과 피부 노화에 있어 중요할 실마리를 제공할 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	미세먼지는 크기에 따라 어떻게 분류되는가?	PM은 탄소 중심의 연소 입자들, 2차 무기물 및 지각의 파생 입자를 포함한 여러 가지 화합물의 혼합물을 포함한다. 미세먼지는 입자의 크기에 따라 10 μm이하를 미세먼지(particulate matter, PM10), 2.5 μm이하를 초미세먼지(fine particulate matter, PM2.5), 0.1 μm이하를 극미세먼지(ultrafine particulate matter, PM0.1)로 정의하고 있다[2]. PM에 지속적으로 노출될 경우 심장질환[3,4], 호흡기질환[5,6] 및 심혈관질환[7]의 환자 수가 늘며 사망률도 높아진다.
	피부란 무엇인가?	피부는 신체를 보호하는 장벽으로서 환경오염물질에 직접적으로 노출되는 기관이다. 피부에는 PM보다 더 큰 모공이 있으며 PM이 직접적으로 침투할 수 있다[8].
	NADPH oxidase family 효소가 인체에 미치는 영향은 무엇인가?	NADPH oxidase (NOX) family는 세포 내 ROS의 공급원으로 NOX1, NOX2, NOX3, NOX4, NOX5, dual oxidase (DUOX) 1과 DUOX2로 7개의 NOX 동족체로 분류된다. 각 효소의 서브 유닛의 조성을 다르지만 이들은 NADPH 로부터 산소 전자를 전달하여 ROS를 생성하는 활성을 공유한다[15]. 이러한 NOX 효소는 숙주 방어 및 세포 신호 전달과 같은 생리와 면역 억제, 갑상선 기능 저하증 등의 병리에도 기여한다[16]. 여러 NOX family 중 DUOX1과 DUOX2는 maturation factor인 DUOXA1과 DUOXA2를 필요로 한다[17,18].

저자의 다른 논문 :

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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