This study was conducted to find out the effect that ${\kappa}-Carrageenan$ has on the properties of dog sperm when it was added to the cryoprotectant. Extender basically was contained 1.21 g Trizma base, 0.67 g citric acid, 0.4 g glucose, 0.03 g penicillin G, 0.05 g streptomycin sulfate....
This study was conducted to find out the effect that ${\kappa}-Carrageenan$ has on the properties of dog sperm when it was added to the cryoprotectant. Extender basically was contained 1.21 g Trizma base, 0.67 g citric acid, 0.4 g glucose, 0.03 g penicillin G, 0.05 g streptomycin sulfate. Extender1 was added with 0.1%, 0.2%, 0.3%, and 0.5% carrageenan, while extender2 was supplemented with glycerol. After freezing-thawing, the motility, viability, acrosome integrity, apoptosis, and ROS (reactive oxygen specifications) of sperm were measured to analyze the effects of the supplementation of carrageenan. Total Motile (TM), Rapid Progressive Motile (RPM), Medium Progressive Motile (MPM), and Immotile were measured through the CASA system after thawing in 37 degree water. Extender with 0.2% ${\kappa}-carrageenan$ ($64.26{\pm}0.49$) was significantly higher than control ($40.24{\pm}8.27$) (p < 0.05). RPMs of extender with 0.1%, 0.2% ${\kappa}-carrageenan$ ($57.64{\pm}6.34$, $56.47{\pm}1.35$) were significantly higher than the other groups (p < 0.05). Acrosome integrity was measured by dyeing to PSA-FITC with an epifluorescence microscope. Normal acrosome ratio of extender with 0.5% ${\kappa}-carrageenan$ ($61{\pm}8.03$) was higher than the other groups (p < 0.05). Apoptosis was measured with a FACSCalibur flow cytometer using FITC (FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit). Treated groups of ${\kappa}-carrageenan$ of 0.1% ($0.81{\pm}0.05$), 0.2% ($0.85{\pm}0.05$) were significantly higer (p < 0.05) than control. Modified SYBR/PI staining was used for determination of viability and DCF staining was used for evaluation of ROS. Viability and ROS were not significantly different from other groups. In conclusion, adding a certain concentration of carrageenan to the extender of cryopreservation, carrageenan contributes to the improvement of the sperm motility, acrosome integrity and prevention of apoptosis.
This study was conducted to find out the effect that ${\kappa}-Carrageenan$ has on the properties of dog sperm when it was added to the cryoprotectant. Extender basically was contained 1.21 g Trizma base, 0.67 g citric acid, 0.4 g glucose, 0.03 g penicillin G, 0.05 g streptomycin sulfate. Extender1 was added with 0.1%, 0.2%, 0.3%, and 0.5% carrageenan, while extender2 was supplemented with glycerol. After freezing-thawing, the motility, viability, acrosome integrity, apoptosis, and ROS (reactive oxygen specifications) of sperm were measured to analyze the effects of the supplementation of carrageenan. Total Motile (TM), Rapid Progressive Motile (RPM), Medium Progressive Motile (MPM), and Immotile were measured through the CASA system after thawing in 37 degree water. Extender with 0.2% ${\kappa}-carrageenan$ ($64.26{\pm}0.49$) was significantly higher than control ($40.24{\pm}8.27$) (p < 0.05). RPMs of extender with 0.1%, 0.2% ${\kappa}-carrageenan$ ($57.64{\pm}6.34$, $56.47{\pm}1.35$) were significantly higher than the other groups (p < 0.05). Acrosome integrity was measured by dyeing to PSA-FITC with an epifluorescence microscope. Normal acrosome ratio of extender with 0.5% ${\kappa}-carrageenan$ ($61{\pm}8.03$) was higher than the other groups (p < 0.05). Apoptosis was measured with a FACSCalibur flow cytometer using FITC (FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit). Treated groups of ${\kappa}-carrageenan$ of 0.1% ($0.81{\pm}0.05$), 0.2% ($0.85{\pm}0.05$) were significantly higer (p < 0.05) than control. Modified SYBR/PI staining was used for determination of viability and DCF staining was used for evaluation of ROS. Viability and ROS were not significantly different from other groups. In conclusion, adding a certain concentration of carrageenan to the extender of cryopreservation, carrageenan contributes to the improvement of the sperm motility, acrosome integrity and prevention of apoptosis.
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문제 정의
본 연구는 개의 정액을 동결-융해 시 동결보존액에 κ-carrageenan 을 첨가하여 동결 보존 효율을 향상하고자 하였다.
하지만 신선한 정액에 비해 동결-융해 후의 정자는 여러 측면에서 저급한 면이 있어 이를 보완하기 위해 현재 연구가 활발이 진행되고 있다. 본 연구에서 개의 동결정액의 성상 개선을 위하여 carrageenan을 다양한 농도로 처리하였을 때 정자의 운동성, 생존율, 첨체반응도, 세포자가사멸율, 활성산소율을 평가하였다. 이번 연구에서 정액을 동결할 때 정액과 동결보존액의 혼합액을 4℃와 액체질소의 증기, 액체질소를 이용하여 3단계로 온도의 차이를 두어 동결정액을 만들었다.
제안 방법
30μL PSA-FITC를 3번에 걸쳐 드롭을 만들어준 후, Parafilm (Bemis) 으로 덮어 슬라이드글라스에 부착시켜주었다.
정자의 운동성 평가는 CASA (Computer-assisted sperm analysis, SCA, Spain)를 사용하여 평가하였다. Chamber slide (Standard count 8 chamber slide, Leja, Netherlands)에 각 농도별로 주입하여 TM (total motility), PRM (Progressive rapid motility), MM (Medium motility), Immotile을 측정하였다.
개의 정자를 동결-융해 직후 CASA system을 이용하여 정자의 운동성을 비교하였으며 결과는 Fig. 1의 그래프와 같다. 농도별로 carrageenan을 첨가한 냉동정액을 융해 직후 직진운동성의 이동속도에 따라 구별하여 측정을 한 경우, Total motile (TM)이 0.
6℃/분으로 나타났다. 그 후 각농도별 스트로우를 하나씩 모아 하나의 고블릿에 넣어 액체질소에서 보관하였고, 융해 시 37℃의 물에서 25초간 침지 후 정자의 성상을 분석하였다.
모든 실험견의 정액채취 직후 5분 이내 실험실로 운반하여 각각의 정액을 100x의 배율로 광학현미경을 이용하여 정자의 운동성을 평가하였다. 운동성이 80% 이상이 되는 정액만 골라 300×g에서 12분 원심분리하여 seminal plasma 및 부유액을 제거하고 하층의 펠렛을 회수하였다.
세포자가사멸율 측정방법과 같이 펠렛희석액을 만들어 17.6 μL를 따서 980 μL DPBS, 2 μL 20mM DCF (2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate, Invitrogen, Oregon, USA), 1 mL PI (Propidium iodide)와 혼합시켜 1시간동안 실온에서 염색시켰다.
염색된 정자는 현미경을 이용하여 각 κ-carrageenan 농도별로 200개 이상의 정자를 관찰하여 생존율을 평가하였다.
본 연구는 개의 정액을 동결-융해 시 동결보존액에 κ-carrageenan 을 첨가하여 동결 보존 효율을 향상하고자 하였다. 이를 위해 다양한 농도로 carrageenan을 동결보존액에 첨가하였으며, 평가를 위해 정자의 운동성, 생존율, 첨단체 손상률, 활성산소 함유율, 세포자살률을 비교 및 분석을 실시하였다.
본 연구에서 개의 동결정액의 성상 개선을 위하여 carrageenan을 다양한 농도로 처리하였을 때 정자의 운동성, 생존율, 첨체반응도, 세포자가사멸율, 활성산소율을 평가하였다. 이번 연구에서 정액을 동결할 때 정액과 동결보존액의 혼합액을 4℃와 액체질소의 증기, 액체질소를 이용하여 3단계로 온도의 차이를 두어 동결정액을 만들었다. 동결정액을 액체질소로 동결하기 전, 4℃에서 50-70분 냉각시킨 후 액체질소를 이용하여 동결하는 것이 정자의 운동성과 생존율을 증가시킨다고 보고되어있다(Ataur Rahman, 2018).
펠렛 희석액 20.9 μL와 980 μL 1x Annexin V binding buffer (10 Mm HEPES/NaOH [pH 7.4], 140 Mm NaCl, 2.5Mm CaCl2)를 혼합한 뒤, 100 μL를 옮겨서 5 μL FITC (FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit 1, BD Biosciences, San Diego, USA)와 5 μL PI (Propidium iodide)를 혼합 시켜둔 상태로 15분간 실온에서 염색하였다.
20분간 실온에서 기다린 후, 증류수에서 Parafilm을 탈착 시켜주기 위해 15분간 담갔다. 필름이 제거가 된 후 스미어를 건조시켜 형광현미경을 이용하여 첨체를 관찰하였다.
대상 데이터
5마리의 실험견은 오전 9시-오후3시 사이에 정액채취가 이루어졌으며, 1번 채취 시 5마리의 정액을 모두 채취하였다. 채취주기는 2일에 1번 실시하였다.
본 연구의 공시견은 전북대학교(CBNU, 2013-0055)에서 사육, 보유하고 있는 믹스견 2마리, 진돗개 1마리, 푸들 1마리, 닥스훈트 1마리에 대해 2018년 3월부터 2018년 12월까지 공시하였다. 공시견의 연령은 2-4세 사이로 정액채취에 다경험이 있는 개체를 공시하였다. 각 공시견 별 거주공간은 독립적으로 구분되어있으며 사료(진도, 퓨리나)와 물은 자유 채식이 가능하도록 2일에 1번 충분히 공급하였다.
본 연구의 공시견은 전북대학교(CBNU, 2013-0055)에서 사육, 보유하고 있는 믹스견 2마리, 진돗개 1마리, 푸들 1마리, 닥스훈트 1마리에 대해 2018년 3월부터 2018년 12월까지 공시하였다. 공시견의 연령은 2-4세 사이로 정액채취에 다경험이 있는 개체를 공시하였다.
채취주기는 2일에 1번 실시하였다. 실험견의 생식기를 마사지하여 흥분을 유도한 후, 38℃를 유지한 깔때기와 15 mL 플라스틱 일회용 튜브(SPL, Pocheon, Korea)를 이용하여 뇨를 제외한 정액을 채취하였다. 채취 후 38도의 온수에 넣어 정액의 온도가 유지될 수 있도록 하였다.
데이터처리
모든 결과는 평균값 ± 표준오차(SEM)으로 나타내었다.
실험 데이터는 일원분산분석(one-way ANOVA)검정과 Ducan의 다중범위사후검정(Duncan’s multiple range tests)를 통하여 검정하였다.
이론/모형
6 μL를 따서 980 μL DPBS, 2 μL 20mM DCF (2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate, Invitrogen, Oregon, USA), 1 mL PI (Propidium iodide)와 혼합시켜 1시간동안 실온에서 염색시켰다. FACSalibur flow cytometer (Becton Dickinson, USA)을 이용하여 활성산소율을 평가하였다.
정자의 생존율 평가는 LIVE/DEAD sperm viability kit (ThermoFisher)를 이용하였다. 해동시킨 스토로우 내 정자희석액 50 μL를 1.
정자의 운동성 평가는 CASA (Computer-assisted sperm analysis, SCA, Spain)를 사용하여 평가하였다. Chamber slide (Standard count 8 chamber slide, Leja, Netherlands)에 각 농도별로 주입하여 TM (total motility), PRM (Progressive rapid motility), MM (Medium motility), Immotile을 측정하였다.
성능/효과
5% 처리군에 비해 유의적으로 운동성이 높게 나타났고 세포자가사멸율은 낮게 나타났다. carrageenan 0.5% 처리군이 유의적으로 첨체 반응도를 유지하는데 기여한다는 것으로 나타났다. 따라서 carrageenan을 함유한 동결보존액은 동결-융해 후 정자의 운동성과 세포자가사멸율 등 정자의 성상을 개선한다고 판단된다.
농도별로 carrageenan을 첨가한 냉동정액을 융해 직후 직진운동성의 이동속도에 따라 구별하여 측정을 한 경우, Total motile (TM)이 0.2% carrageenan처리군에서 64.7 ± 0.45%로 대조군인 40.2 ± 8.3%보다 유의적으로 높게 나타났으며 (p < 0.05), carrageenan 0.1% 처리군과 0.2% 처리군에서 Progressive rapid motile (PRM)이 57.6 ± 6.3%와 56.5 ± 1.4%로 대조군인 30.3 ± 4.1%보다 유의적으로 높게 나타났다(p < 0.05).
5% 처리군이 유의적으로 첨체 반응도를 유지하는데 기여한다는 것으로 나타났다. 따라서 carrageenan을 함유한 동결보존액은 동결-융해 후 정자의 운동성과 세포자가사멸율 등 정자의 성상을 개선한다고 판단된다.
냉동보존액에 carrageenan을 첨가하는 것은 점성을 높여 세포를 고정시키는 효과를 유도하여 동결하는 동안 세포를 보호하는 효과가 있다고 보고하였다(Jen-Horng Tsen, 2007). 본 실험에서 0.5%의 carrageenan 처리군에서 가장 높은 첨단체의 온전성을 나타내는 것은 가장 높은 농도로 carrageenan을 처리하였기 때문인 것으로 판단되며, 따라서 일정 농도이상의 carrageenan을 첨가하는 것은 첨단체의 온전성을 유지하는데 기여한다고 보여진다.
05). 본 연구에서 carrageenan을 0.2%까지 첨가하였을 때 활발한 정자의 운동성을 향상시킬 수 있을 것으로 사료되며, 그 이상의 carrageenan을 처리하였을 경우에 정자의 운동성을 오히려 저하시키는 것으로 확인된다. 또한 정자의 Immotile을 측정하였을 때 0.
세포자가사멸율은 0.1%와 0.2% carrageenan을 첨가하였을 때 세포자가사멸율이 상대적으로 낮게 나타나는 것으로 보아 정자가 생존할 수 있게 영향을 미친다는 것을 알 수 있다. Glycerol은 침투성을 가진 물질로 동결보존액에 동결 시 정자의 체내로 투과하여 물의 결정으로부터 정자를 보호할 수 있다.
이상 결과를 종합해 볼 때 0.1%와 0.2%의 농도로 carrageenan을 처리하였을 때 대조군와 0.3%, 0.5% 처리군에 비해 유의적으로 운동성이 높게 나타났고 세포자가사멸율은 낮게 나타났다. carrageenan 0.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
침투성을 가진 동결보존액은 어떻게 정자를 보호하는가?
침투성을 가진 동결보존액은 정자의 동결보존이 성공적으로 이루어질 수 있게 한다. 그 예로 glycerol을 동결보존액에 첨가 시 정자가 보존액에 노출될 경우, 정자내의 수용액은 보존액으로 방출되고, glycerol은 정자내로 침투함으로써 동결이 되었을 때 물의 결정으로부터 보호를 해준다. 동결보존방법은 비용을 절감하고, 인공수정을 간단하게 하는 장점을 가진다(Sieme H와 Oldenhof H, 2015).
정자의 냉동 보존의 의의는?
장기간 정자를 동결보존하는 것은 매우 흥미로운 연구분야 중하나이다. 정자의 냉동 보존은 농업, 동물과 인간의 생식, 육종환경, 실험동물의 생산, 의학에 많은 영향을 미친다. 특히 정자를 얼리는 것은 인공수정 시에 정액을 간편히 사용할 수 있게 해주고, 양질의 정자이용이 가능하게 해주기에 각광받는 실험기술이다.
동결보존방법의 장점은?
그 예로 glycerol을 동결보존액에 첨가 시 정자가 보존액에 노출될 경우, 정자내의 수용액은 보존액으로 방출되고, glycerol은 정자내로 침투함으로써 동결이 되었을 때 물의 결정으로부터 보호를 해준다. 동결보존방법은 비용을 절감하고, 인공수정을 간단하게 하는 장점을 가진다(Sieme H와 Oldenhof H, 2015).
참고문헌 (11)
10.1002/j.1939-4640.1988.tb01067.x AitkenRJ and ClarksonJS . 1988. Significance of reactive oxygen species and antioxidants in defining the efficacy of sperm preparation techniques. Andrology 9:No.6.
10.1089/15204559950019898 FooteRH . 1999. Development of reproductive biotechnologies in domestic animals from artificial insemination to cloning: a perspective. Cloning 1:133-142.
10.1016/S0015-0282(98)00349-5 HaraldT , KathleenT , Christine Y, Norbert K, Randall B and Meacham RB. 1998. Effect of storage temperature on sperm cryopreservation. Fertility and Sterility 1162-1164.
10.1002/0471141755.ph0504s70 McCarsonKE . 2015. Models of Inflammation: Carrageenan-or Complete Freund’s Adjuvant (CFA)-Induced Edema and Hypersensitivity in the Rat. Curr Protoc Pharmacol 70. 4 1-9.
RahmanA . 2018. Cryopreservation of dog spermatozoa in monosaccharides, disaccharides, and trisaccharides supplemented glycerol-free Tris. Chonbuk National University Ph.D degree thesis.
10.1007/978-1-4939-2193-5_10 SiemeH and OldenhofH . 2015. Cryopreservation of semen from domestic livestock. Methods Mol Biol 1257:277-287.
10.1016/j.mimet.2007.06.004 TsenJH , HuangHY , Lin YP and King VA. 2007. Freezing resistance improvement of Lactobacillus reuteri by using cell immobilization. J Microbiol Methods 70:561-564.
10.1071/BI9730927 WatsonPF and MartinIC . 1973. The response of ram spermatozoa to preparations of egg yolk in semen diluents during storage at 5 or -196 degrees C. Aust J Biol Sci 26:927-935.
10.3109/10408444.2013.861798 WeinerML . 2014. Food additive carrageenan: Part II: A critical review of carrageenan in vivo safety studies. Crit Rev Toxicol 44:244-269.
10.1016/S0093-691X(01)00711-7 YuI , and LeiboSP . 2002. Recovery of motile, membrane-intact spermatozoa from canine epididymides stored for 8 days at 4ºC>. Theriogenology 57:1179-1190.
10.1016/j.cryobiol.2014.03.008 ZengC , TangK , He L, Peng W, Ding L, Fang D, and Zhang Y. 2014. Effects of glycerol on apoptotic signaling pathways during boar spermatozoa cryopreservation. Cryobiology 68:395-404.
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