본 연구는 농산물 중 잔류허용기준 신설 예정 농약인 가스가마이신의 안전 관리를 위한 공정 시험법을 개발하기 위하여 수행되었다. 가스가마이신은 단백질 합성과정 중 번역 개시 단계를 저해하여 균의 증식을 억제하는 작용기작을 가지고 있으며 특히 사상균인 Piricularia oryzae에 의해 발병하는 도열병을 예방하는 데 효과적이다. 현재 우리나라에는 농산물 중 가스가마이신의 잔류물의 정의가 설정되어 있지 않고 모화합물 만을 잔류물의 정의로 예정하고 있다. 또한 잔류허용기준이 설정된 농산물이 없기 때문에 모든 국내 재배 농산물 또는 수입 농산물 유통 시 실시하는 잔류농약 검사에서 농약 허용물질목록관리제도(Positive List System; PLS)에 의하여 잔류량이 0.01 mg/kg 이하가 되어야 한다. 이에 농산물 중 잔류농약 분석 및 검사를 위한 공정 시험법 마련이 시급하여 본 연구에서는 대표농산물 5종(현미, 감자, 대두, 감귤, 고추)을 대상으로 시험법을 개발하고자 하였다. 따라서 수용성 유기용매인 메탄올의 적용과 수산화나트륨을 이용한 pH 조절을 통한 추출법 및 HLB 카트리지를 이용한 정제법을 최적화하여 LC-MS/MS에 의한 분석법을 확립하였다. 가스가 마이신의 시험법 정량한계는 0.01 mg/kg이며 5종의 농산물에 0.01, 0.1 및 0.5 mg/kg의 처리농도로 회수율 실험을 한 결과 평균 회수율은 71.2~95.4%이었고, 상대표준 편차는 12.1% 이하로 조사되었다. 이러한 검증 결과는 국제식품규격위원회 가이드라인(CAC/GL 40-1993, 2003)의 잔류농약 분석 기준 및 식품의약품안전평가원의 '식품등 시험법 마련 표준절차에 관한 가이드라인(2016)'에 적합한 수준임을 확인하였다. 따라서 본 연구에서 개발한 시험법은 국내 및 수입 농산물 중 가스가마이신의 안전 관리를 위한 공정시험법으로 활용될 수 있으며 잔류물의 정의 및 잔류허용기준을 설정하는 데 기초자료로써 활용 가능할 것이다.
본 연구는 농산물 중 잔류허용기준 신설 예정 농약인 가스가마이신의 안전 관리를 위한 공정 시험법을 개발하기 위하여 수행되었다. 가스가마이신은 단백질 합성과정 중 번역 개시 단계를 저해하여 균의 증식을 억제하는 작용기작을 가지고 있으며 특히 사상균인 Piricularia oryzae에 의해 발병하는 도열병을 예방하는 데 효과적이다. 현재 우리나라에는 농산물 중 가스가마이신의 잔류물의 정의가 설정되어 있지 않고 모화합물 만을 잔류물의 정의로 예정하고 있다. 또한 잔류허용기준이 설정된 농산물이 없기 때문에 모든 국내 재배 농산물 또는 수입 농산물 유통 시 실시하는 잔류농약 검사에서 농약 허용물질목록관리제도(Positive List System; PLS)에 의하여 잔류량이 0.01 mg/kg 이하가 되어야 한다. 이에 농산물 중 잔류농약 분석 및 검사를 위한 공정 시험법 마련이 시급하여 본 연구에서는 대표농산물 5종(현미, 감자, 대두, 감귤, 고추)을 대상으로 시험법을 개발하고자 하였다. 따라서 수용성 유기용매인 메탄올의 적용과 수산화나트륨을 이용한 pH 조절을 통한 추출법 및 HLB 카트리지를 이용한 정제법을 최적화하여 LC-MS/MS에 의한 분석법을 확립하였다. 가스가 마이신의 시험법 정량한계는 0.01 mg/kg이며 5종의 농산물에 0.01, 0.1 및 0.5 mg/kg의 처리농도로 회수율 실험을 한 결과 평균 회수율은 71.2~95.4%이었고, 상대표준 편차는 12.1% 이하로 조사되었다. 이러한 검증 결과는 국제식품규격위원회 가이드라인(CAC/GL 40-1993, 2003)의 잔류농약 분석 기준 및 식품의약품안전평가원의 '식품등 시험법 마련 표준절차에 관한 가이드라인(2016)'에 적합한 수준임을 확인하였다. 따라서 본 연구에서 개발한 시험법은 국내 및 수입 농산물 중 가스가마이신의 안전 관리를 위한 공정시험법으로 활용될 수 있으며 잔류물의 정의 및 잔류허용기준을 설정하는 데 기초자료로써 활용 가능할 것이다.
An analytical method was developed for the determination of an antibiotic fungicide, kasugamycin, in agricultural products (hulled rice, potato, soybean, mandarin and green pepper) using liquid chromatographytandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Samples were extracted with methanol adjusted to pH 13 ...
An analytical method was developed for the determination of an antibiotic fungicide, kasugamycin, in agricultural products (hulled rice, potato, soybean, mandarin and green pepper) using liquid chromatographytandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Samples were extracted with methanol adjusted to pH 13 using 1 N sodium hydroxide, and purified with a HLB (hydrophilic lipophilic balance) cartridge. Linearity of a matrix-matched calibration curve using seven concentration levels, from 0.001 to 0.1 mg/kg, was excellent with a correlation coefficient ($R^2$) of more than 0.9998. The limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) of instrument were 0.0005 and $0.001{\mu}g/mL$, respectively, and the LOQ of analytical method calculated as 0.01 mg/kg. The average recoveries at three spiking levels (LOQ, $LOQ{\times}10$, $LOQ{\times}50$, n=5) were in the range of 71.2~95.4% with relative standard deviation of less than 12.1%. The developed method was simple and all optimized results was satisfied with the criteria ranges requested in the Codex guidelines and Food Safety Evaluation Department guidelines. The present study could be served as a reference for the establishment of maximum residue limits (MRL) of kasugamycin and be used as basic data for safety management relative to kasugamycin residues in imported and domestic agricultural products.
An analytical method was developed for the determination of an antibiotic fungicide, kasugamycin, in agricultural products (hulled rice, potato, soybean, mandarin and green pepper) using liquid chromatographytandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Samples were extracted with methanol adjusted to pH 13 using 1 N sodium hydroxide, and purified with a HLB (hydrophilic lipophilic balance) cartridge. Linearity of a matrix-matched calibration curve using seven concentration levels, from 0.001 to 0.1 mg/kg, was excellent with a correlation coefficient ($R^2$) of more than 0.9998. The limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) of instrument were 0.0005 and $0.001{\mu}g/mL$, respectively, and the LOQ of analytical method calculated as 0.01 mg/kg. The average recoveries at three spiking levels (LOQ, $LOQ{\times}10$, $LOQ{\times}50$, n=5) were in the range of 71.2~95.4% with relative standard deviation of less than 12.1%. The developed method was simple and all optimized results was satisfied with the criteria ranges requested in the Codex guidelines and Food Safety Evaluation Department guidelines. The present study could be served as a reference for the establishment of maximum residue limits (MRL) of kasugamycin and be used as basic data for safety management relative to kasugamycin residues in imported and domestic agricultural products.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 곡류(현미), 서류(감자), 두류(대두), 과일류(감귤), 채소류(고추)를 대상으로 한 가스가마이신의 분석법을 개발하여 국내 및 수입 농산물 유통 시 다양한 작물에서의 잔류허용기준 적부 판정을 할 수 있는 공정 시험법을 개발하고자 하였다.
제안 방법
pH를 조절한 후 10분간 진탕 및 원심분리(7,000×g, 10 min)하여 상등액 전량을 취한 뒤 메탄올을 이용하여 부피를 25 mL로 맞추고 분석하였다.
이동상에 사용한 포름산은 protonation enhancer로서 가스가마이신 분자의 [M+H]+ 이온 생성에 용이하게 작용하였다. 대상성분의 이온화법으로는 ESI법의 positive-ion mode를 사용하였고 total ion chromatogram (TIC)과 mass spectrum을 통해 selectedion monitoring (SIM) 분석을 위한 최적 특성이온을 선정하였다. 최적 기기분석 확립 조건은 Table 3과 같다.
농약 성분은 검체 입자 표면이나 내부에 존재하고, 검체 주위가 수분으로 수화되어 있기 때문에 물과 섞이지 않는 비극성 유기용매를 직접 사용할 경우 검체 내부로의 침투성이 낮아 충분한 추출 효율을 얻을 수 없다17). 따라서 검체 내부로의 침투성을 용이하게 하고자 수용성 유기용매이면서 용해도가 비교적 높은 메탄올을 추출용매로 선택하여 가스가마이신의 추출 효율을 확인하였다. 먼저 감귤 시료 5g에 메탄올 20 mL를 가하여 pH를 측정한 후 각 시험구에 포름산 및 수산화나트륨 용액을 첨가하여 추출 용액의 pH를 조절하였다.
또한 아미노글리코사이드계 농약의 경우 극성이 크기 때문에 잔류분석에 많이 사용되는 C18 칼럼으로 분석을 하면 칼럼 내 머무름이 저하되는 것으로 알려져 있다19). 따라서 극성물질 분석에 흔히 사용하는 amide 컬럼을 선택하였고, 용리 방식은 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴과 0.1% 포름산 함유 증류수를 이동상으로 하는 기울기 용리 방식을 선택하였다. 이동상에 사용한 포름산은 protonation enhancer로서 가스가마이신 분자의 [M+H]+ 이온 생성에 용이하게 작용하였다.
일반적으로 잔류농약분석 정제 시 사용하는 카트리지는 플로리실(Florisil)이나 실리카(Silica) 카트리지이나, 추출 용액의 높은 pH와 수산화나트륨 용액의 첨가로 인해 유기용매와 수용액이 혼합된 점을 감안하여 높은 pH 범위에서도 안정적이며 친수성과 습윤성의 특성을 갖는 흡착제의 카트리지를 사용하는 것이 정제효율이 높다고 판단되었다. 따라서 상기의 조건을 만족하는 HLB 카트리지를 이용하여 가스가마이신의 용출 특성을 확인하였다. 먼저 메탄올 3 mL와 증류수 3 mL로 미리 활성화된 카트리지에 메탄올에 용해된 0.
분석법은 검체를 산이 함유된 인산완충용액으로 추출하고 HLB (Hydrophilic-Lipophilic Balance) 및 WCX (Weak Cation Exchange) SPE (Solid Phase Extraction) 카트리지로 정제한 후 LC-MS/MS (Liquid chromatography-tandem mass spectrometry)를 이용하게 규정되어 있다. 또한 구조상 아미노 그룹의 존재로 C18과 같은 역상 칼럼에 머무름이 저하되는 문제를 해결하기 위하여 이동상에 이온쌍시약인 HFBA(Heptafluorobutyric acid)를 첨가한다. 하지만 위 분석법은 적용범위가 축산물에만 한정되어 있어 국내 및 수입 농산물에서의 잔류농약 검사에 활용될 수 없으므로 분석대상 품목을 농산물에 적용한 시험법의 개발이 필요하다.
시험법의 선택성은 표준용액을 첨가한 회수율 시료와 현미, 감자, 대두, 감귤, 고추 5종의 무처리 시료 크로마토그램을 서로 비교함으로써 평가하였고, 직선성은 7 point의 matrixmatched 표준용액을 분석하여 얻어진 각 피크 면적으로 검량선을 작성하고 결정계수(Correlation of determination, R2)를 구하여 평가하였다. 또한 기기상 검출한계와 정량한계는 크로마토그램상에서 검출된 피크의 신호 대 잡음비(Signal-to-noise ratio, S/N)가 각각 3 이상과 10 이상을 나타내는 성분의 농도를 의미하며, 시험법 정량한계는 최소검출농도와 분석과정 중의 희석배율을 이용하여 산출하였다. 시험법의 정확성 및 반복성은 5종의 농산물에 시험법 정량한계 수준과 정량한계 10배 및 50배의 수준에 해당하는 표준용액 200 μL를 첨가한 후 분석하여 5반복 실험의 회수율(Recovery) 평균과 상대표준편차(Relative standard deviation, RSD)를 구하여 평가하였다.
따라서 상기의 조건을 만족하는 HLB 카트리지를 이용하여 가스가마이신의 용출 특성을 확인하였다. 먼저 메탄올 3 mL와 증류수 3 mL로 미리 활성화된 카트리지에 메탄올에 용해된 0.1 ppm 표준용액 5 mL를 가하여 유출시켜 받고, 고정상 상단이 노출되기 전에 메탄올 5 mL 씩 3개의 분획을 받아 분석하였다. 각 분획의 회수율을 비교 검토한 결과 분 획1과 2에서 받은 용출액의 회수율 합이 약 100%로 우수한 결과를 보였다(Table 2).
20 m/z 값을 확인하였다. 분석의 선택성과 검출강도를 극대화시키기 위하여 MS/MS 분석 시 MRM (multiple reaction monitoring) mode로 분석하였으며, collision cell에서 collision energy를 조절하여 최적의 precursor/product ion pair를 선정하였고, 가장 좋은 감도를 보이는 product ion을 정량이온(quantification ion)으로, 다음으로 크게 검출되는 product ion을 정성이온(qualification ion)으로 설정하여 확인하였다. 100~400 m/z의 범위로 daughter scan을 수행한 결과, 가장 좋은 감도를 보이는 선구 이온 112.
시험법의 정확성 및 반복성은 5종의 농산물에 시험법 정량한계 수준과 정량한계 10배 및 50배의 수준에 해당하는 표준용액 200 μL를 첨가한 후 분석하여 5반복 실험의 회수율(Recovery) 평균과 상대표준편차(Relative standard deviation, RSD)를 구하여 평가하였다.
정량을 위한 matrix-matched 검량선은 메탄올에 용해된 7 point 각각의 표준용액 100 µL에 농산물 검체 무처리 추출액 900 μL를 첨가하여 90% 이상의 matrix를 포함하도록 하였다.
정제된 용액은 최종 부피가 10 mL가 되게 한 뒤 실린지 필터(Nylon, 0.2 μm × 13 mm, Teknokroma, Barcelona, Spain)로 여과하고 2 μL를 LC-MS/MS에 주입하여 최적화된 기기 조건에 따라 분석하였다.
균질화된 각각의 검체 5 g을 정밀히 달아 50 mL 원심분리관에 넣고 메탄올 20 mL(곡류 및 두류의 경우 25 mL)를 가하여 강하게 흔든 후 1 N 수산화나트륨 용액을 이용하여 추출용액의 pH를 13으로 조절하였다. 추출액의 pH를 조절한 뒤 강하게 흔들고 교반진탕기(Eyela MMV-1000W, Tokyo Rikakikai Co. Ltd., Tokyo, Japan)를 사용하여 10분간 진탕하였다. 시료는 원심분리기(Heraeus Megafuge 16R Centrifuge, Thermo Fisher Scientific, Dreieich, Germany)를 사용하여 4℃, 7,000×G에서 10분간 원심분리하고 상등액 전량을 취한 후 메탄올을 이용하여 부피를 25 mL로 맞추었다.
칼럼은 XBridge Amide(2.1 mm I.D. × 100 mm L., 3.5 µm)를 선택하고, 이동상은 0.1% formic acid가 함유된 아세토니트릴과 0.1% formic acid가 함유된 증류수를 사용하여 최적화된 기울기 용리 방식으로 대상성분을 분리하였고, 정량 분석을 위해 LC-MS/MS의 ESI(Electro-Spray Ionization) positive mode로 최적의 정량이온과 정성이온을 선택한 후 collision energy 값을 선정하였다.
확립된 가스가마이신 시험법의 선택성(Selectivity), 직선성(Linearity), 기기상 검출한계(Limit of detection, LOD)와 정량한계(Limit of quantification, LOQ), 시험법 정량한계, 정확성(Accuracy) 및 반복성(Repeatability)을 검증하였다. 시험법의 선택성은 표준용액을 첨가한 회수율 시료와 현미, 감자, 대두, 감귤, 고추 5종의 무처리 시료 크로마토그램을 서로 비교함으로써 평가하였고, 직선성은 7 point의 matrixmatched 표준용액을 분석하여 얻어진 각 피크 면적으로 검량선을 작성하고 결정계수(Correlation of determination, R2)를 구하여 평가하였다.
대상 데이터
가스가마이신(Kasugamycin hydrochloride, 98.2%) 표준품은 Sigma-Aldrich (Buchs, Switzerland)에서 구입하여 사용하였고, 메탄올(Methanol) 및 아세토니트릴(Acetonitrile)은 Merck (Darmstadt, Germany)사에서 HPLC용을 구입하여 사용하였다. 포름산(Formic acid)과 1 N 수산화나트륨(1N Sodium hydroxide)은 Sigma-Aldrich로 부터 구입하였고 HLB SPE 카트리지(6 cc, 500 mg)는 Waters (Milford, MA, USA)에서 구입하였다.
가스가마이신을 분석하기 위하여 Shimadzu(Kyoto, Japan)사의 액체크로마토그래프(Nexera X2 UPLC)와 질량분석기(LCMS-8060)를 이용하였다. 칼럼은 XBridge Amide(2.
포름산(Formic acid)과 1 N 수산화나트륨(1N Sodium hydroxide)은 Sigma-Aldrich로 부터 구입하였고 HLB SPE 카트리지(6 cc, 500 mg)는 Waters (Milford, MA, USA)에서 구입하였다. 검체는 식품의약품안전처에서 정한 대표농산물인 현미(곡류), 감자(서류), 대두(두류), 감귤(과일류) 및 고추(채소류) 5종을 선택한 후, 모두 무농약 농산물을 구입하였다. 곡류 및 두류는 약 1 kg을 혼합하여 표준체 420 μm를 통과하도록 분쇄하고 서류, 과일류 및 채소류는 약 1 kg을 분쇄하여 균질화한 후 폴리에틸렌 지퍼백에 담아 -50℃에서 냉동보관 하고 실험에 사용하였다.
아미노글리코사이드계 항생물질은 흔히 유도체화 후 형광검출기를 이용한 액체크로마토그래프 형광검출기(Fluorescence detector, FLD)분석법이 많이 이용되었다. 그러나 시험법이 오래 걸리고 복잡한 단점이 있어 비교적 선택성이 높고, 낮은 농도 수준에서도 분석 감도를 확보하며 PLS 제도 도입에 따른 정량한계 0.01 mg/kg 수준을 확보할 수 있는 액체크로마토그래프-질량분석기를 분석기기로 선정하였다. 또한 아미노글리코사이드계 농약의 경우 극성이 크기 때문에 잔류분석에 많이 사용되는 C18 칼럼으로 분석을 하면 칼럼 내 머무름이 저하되는 것으로 알려져 있다19).
표준용액은 실험 시 즉시 만들어 사용하였으며, 표준원액과 표준용액은 4℃에 보관하여 실험에 사용하였다. 또한 아미노글리코사이드계 항생제는 유리 흡착성이 있으므로 실험에 사용된 모든 용기는 폴리프로필렌 재질을 사용하였다16).
2%) 표준품은 Sigma-Aldrich (Buchs, Switzerland)에서 구입하여 사용하였고, 메탄올(Methanol) 및 아세토니트릴(Acetonitrile)은 Merck (Darmstadt, Germany)사에서 HPLC용을 구입하여 사용하였다. 포름산(Formic acid)과 1 N 수산화나트륨(1N Sodium hydroxide)은 Sigma-Aldrich로 부터 구입하였고 HLB SPE 카트리지(6 cc, 500 mg)는 Waters (Milford, MA, USA)에서 구입하였다. 검체는 식품의약품안전처에서 정한 대표농산물인 현미(곡류), 감자(서류), 대두(두류), 감귤(과일류) 및 고추(채소류) 5종을 선택한 후, 모두 무농약 농산물을 구입하였다.
데이터처리
확립된 가스가마이신 시험법의 선택성(Selectivity), 직선성(Linearity), 기기상 검출한계(Limit of detection, LOD)와 정량한계(Limit of quantification, LOQ), 시험법 정량한계, 정확성(Accuracy) 및 반복성(Repeatability)을 검증하였다. 시험법의 선택성은 표준용액을 첨가한 회수율 시료와 현미, 감자, 대두, 감귤, 고추 5종의 무처리 시료 크로마토그램을 서로 비교함으로써 평가하였고, 직선성은 7 point의 matrixmatched 표준용액을 분석하여 얻어진 각 피크 면적으로 검량선을 작성하고 결정계수(Correlation of determination, R2)를 구하여 평가하였다. 또한 기기상 검출한계와 정량한계는 크로마토그램상에서 검출된 피크의 신호 대 잡음비(Signal-to-noise ratio, S/N)가 각각 3 이상과 10 이상을 나타내는 성분의 농도를 의미하며, 시험법 정량한계는 최소검출농도와 분석과정 중의 희석배율을 이용하여 산출하였다.
성능/효과
분석의 선택성과 검출강도를 극대화시키기 위하여 MS/MS 분석 시 MRM (multiple reaction monitoring) mode로 분석하였으며, collision cell에서 collision energy를 조절하여 최적의 precursor/product ion pair를 선정하였고, 가장 좋은 감도를 보이는 product ion을 정량이온(quantification ion)으로, 다음으로 크게 검출되는 product ion을 정성이온(qualification ion)으로 설정하여 확인하였다. 100~400 m/z의 범위로 daughter scan을 수행한 결과, 가장 좋은 감도를 보이는 선구 이온 112.10 m/z을 정량이온으로, 다음으로 크게 검출되는 두 개의 선구 이온 156.20, 200.10 m/z을 정성이온으로 설정하였고 collision cell에서의 5~50 eV의 collision energy 변화에 따른 정량이온의 세기는 21 eV에서 최대를 나타내었다. 질량분석기 최적의 분석조건은 Table 4에 나타내었다.
1 ppm 표준용액 5 mL를 가하여 유출시켜 받고, 고정상 상단이 노출되기 전에 메탄올 5 mL 씩 3개의 분획을 받아 분석하였다. 각 분획의 회수율을 비교 검토한 결과 분 획1과 2에서 받은 용출액의 회수율 합이 약 100%로 우수한 결과를 보였다(Table 2). 따라서 본 시험법에서는 HLB 카트리지를 이용하여 다양한 매트릭스 간섭물질로부터 가스가마이신을 효과적으로 정제할 수 있었다.
pH를 조절한 후 10분간 진탕 및 원심분리(7,000×g, 10 min)하여 상등액 전량을 취한 뒤 메탄올을 이용하여 부피를 25 mL로 맞추고 분석하였다. 각 시험구의 회수율을 비교 검토한 결과 pH 2에서 평균 회수율은 77.9%, pH 13에서 평균 회수율은 74.4%를 나타내었다(Fig. 1). 가스가마이신은 넓은 pH 범위에서 이온화되어 있으며18) 유기용매로 인한 추출효율을 높이기 위해서는 이온 억압 조건을 성립하여야 한다.
관측질량이 379.16 g/mol인 가스가마이신 표준용액(1 μg/mL)을 일정한 속도(10 μL/min)로 질량검출기에 직접 주입한 결과 질량이 [M+H]+형태인 380.20 m/z 값을 확인하였다.
“Matrix effect”는 LC-MS/MS 분석 시 검체의 추출성분에 의한 간섭 현상으로 이온 억압 또는 증강 현상을 초래한다. 대상 성분인 가스가마이신의 matrix effect를 조사한 결과 5종의 작물에서 -15.4~-28.1%의 이온 억압 현상을 나타내었다(Table 5). 따라서 정량을 위한 검량선은 5종의 농산물 무처리 추출액으로 희석한 표준용액 0.
각 분획의 회수율을 비교 검토한 결과 분 획1과 2에서 받은 용출액의 회수율 합이 약 100%로 우수한 결과를 보였다(Table 2). 따라서 본 시험법에서는 HLB 카트리지를 이용하여 다양한 매트릭스 간섭물질로부터 가스가마이신을 효과적으로 정제할 수 있었다.
따라서 본 시험법은 Codex 가이드라인의 잔류농약 분석 기준(CAC/GL 40-1993, 2003)14) 및 식품의약품안전평가원의 식품 등 시험법 마련 표준절차에 관한 가이드라인(2016)15)에서 제시한 기준 처리농도 >1 μg/kg와 ≤ 10 μg/kg의 60~120%, > 10 μg/kg와 ≤ 100 μg/kg의 70~120%, >100 μg/kg와 ≤ 1000 μg/kg의 70~110% 회수율 범위에 적합함을 확인할 수 있었다.
가스가마이신은 넓은 pH 범위에서 이온화되어 있으며18) 유기용매로 인한 추출효율을 높이기 위해서는 이온 억압 조건을 성립하여야 한다. 따라서 상대적으로 이온이 억압되는 pH를 찾기 위하여 pH를 조절하였으며 본 시험법에서는 회수율 표준편차 및 기기상 감도를 고려하여 수산화나트륨 용액을 이용해 pH를 13으로 조절한 후 화합물을 추출하는 것이 좋을 것으로 판단되었다.
1%의 이온 억압 현상을 나타내었다(Table 5). 따라서 정량을 위한 검량선은 5종의 농산물 무처리 추출액으로 희석한 표준용액 0.001~0.1 mg/kg의 농도로 작성하였으며 matrix-matched 검량선의 결정계수는 0.9998 이상으로 높은 직선성을 나타내었다(Fig. 3). 기기상 검출한계와 정량한계는 각각 0.
시험법의 선택성을 평가한 결과 5종의 농산물 무처리 시료 중 가스가마이신의 머무름 시간과 질량 대 전하비(m/z)가 같은 어떠한 방해물질도 검출되지 않아 본 시험법이 높은 분리능과 선택성을 가짐을 확인할 수 있었다(Fig. 2). “Matrix effect”는 LC-MS/MS 분석 시 검체의 추출성분에 의한 간섭 현상으로 이온 억압 또는 증강 현상을 초래한다.
시험법의 정확성 및 반복성을 평가하기 위하여 5종의 농산물에 0.01, 0.1 및 0.5 mg/kg의 처리농도로 5반복 회수율 실험을 한 결과 평균 회수율은 71.2~95.4%이었고, 상대표준편차는 12.1% 이하로 조사되었다(Table 5). 따라서 본 시험법은 Codex 가이드라인의 잔류농약 분석 기준(CAC/GL 40-1993, 2003)14) 및 식품의약품안전평가원의 식품 등 시험법 마련 표준절차에 관한 가이드라인(2016)15)에서 제시한 기준 처리농도 >1 μg/kg와 ≤ 10 μg/kg의 60~120%, > 10 μg/kg와 ≤ 100 μg/kg의 70~120%, >100 μg/kg와 ≤ 1000 μg/kg의 70~110% 회수율 범위에 적합함을 확인할 수 있었다.
일반적으로 잔류농약분석 정제 시 사용하는 카트리지는 플로리실(Florisil)이나 실리카(Silica) 카트리지이나, 추출 용액의 높은 pH와 수산화나트륨 용액의 첨가로 인해 유기용매와 수용액이 혼합된 점을 감안하여 높은 pH 범위에서도 안정적이며 친수성과 습윤성의 특성을 갖는 흡착제의 카트리지를 사용하는 것이 정제효율이 높다고 판단되었다. 따라서 상기의 조건을 만족하는 HLB 카트리지를 이용하여 가스가마이신의 용출 특성을 확인하였다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
국제식품규격위원회 가이드라인에 따른 가스가마이신의 검증 결과는?
따라서 수용성 유기용매인 메탄올의 적용과 수산화나트륨을 이용한 pH 조절을 통한 추출법 및 HLB 카트리지를 이용한 정제법을 최적화하여 LC-MS/MS에 의한 분석법을 확립하였다. 가스가 마이신의 시험법 정량한계는 0.01 mg/kg이며 5종의 농산물에 0.01, 0.1 및 0.5 mg/kg의 처리농도로 회수율 실험을 한 결과 평균 회수율은 71.2~95.4%이었고, 상대표준 편차는 12.1% 이하로 조사되었다. 이러한 검증 결과는 국제식품규격위원회 가이드라인(CAC/GL 40-1993, 2003)의 잔류농약 분석 기준 및 식품의약품안전평가원의 '식품등 시험법 마련 표준절차에 관한 가이드라인(2016)'에 적합한 수준임을 확인하였다.
가스가마이신의 효능은?
가스가마이신(Kasugamycin)은 아미노글리코사이드계 항생물질로서 1965년 Streptomyces속 박테리아인 Streptomyces kasugaensis로부터 최초 분리되었다1). 가스가마이신은 단백질 합성과정 중 번역 개시 단계를 저해하여 균의 증식을 억제하는 작용기작을 가지고 있으며 특히 사상균인 Piricularia oryzae에 의해 발병하는 도열병을 예방하는 데 효과적이다2-3). 현재 국내에 가스가마이신을 유효성분으로 하여 등록된 농약은 총 14품목이며, 단제로 사용되거나 살균효과를 가진 다양한 유효성분과 합제로 사용되어 과수 및 채소의 무름병, 노균병 등을 방제하고 있다4).
가스가마이신이란 무엇인가?
가스가마이신(Kasugamycin)은 아미노글리코사이드계 항생물질로서 1965년 Streptomyces속 박테리아인 Streptomyces kasugaensis로부터 최초 분리되었다1). 가스가마이신은 단백질 합성과정 중 번역 개시 단계를 저해하여 균의 증식을 억제하는 작용기작을 가지고 있으며 특히 사상균인 Piricularia oryzae에 의해 발병하는 도열병을 예방하는 데 효과적이다2-3).
참고문헌 (19)
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