[논문]삼내자 열수추출물의 항산화 및 항염 효과

진정원비너스; 이지안

doi:10.22156/cs4smb.2019.9.6.218

삼내자 열수추출물의 항산화 및 항염 효과
Anti-inflammatory and Antioxidant Effects of Hot Water Extracts from Kaempferia Galanga L 원문보기

융합정보논문지 = Journal of Convergence for Information Technology, v.9 no.6, 2019년, pp.218 - 226

진정원비너스 (서경대학교 일반대학원 미용예술학과) , 이지안 (서경대학교 일반대학원 미용예술학과)

초록
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본 연구의 목적은 삼내자(Kaempferia Galanga) 열수추출물의 항산화, 세포독성, 항염 효능을 조사하여 화장품 성분으로서 활용 가능성을 알아보고자 하였다. 항산화 활성 평가를 위해 DPPH, ABTS 라디컬 소거능 활성, FRAP 환원력, 총폴리페놀 함량을 측정하였다. 쥐의 대식세포인 RAW264.7 세포를 대상으로 MTT assay를 수행하여 세포독성을 확인하였다. 항염 효능을 알아보기 위해 LPS로 유도된 RAW264.7 세포에서 nitric oxide(NO), $TNF-{\alpha}$ 분비 및 iNOS, $TNF-{\alpha}$ mRNA 발현 수준을 조사하였다. 그 결과 DPPH와 ABTS 라디칼 소거능은 농도 의존적으로 라디칼 소거 활성이 증가하였다. FRAP 값은 5 mg/mL에서 24.5 uM로 가장 높게 나타났으며, 총폴리페놀 함량은 $1.28{\pm}0.064mg\;GAE/g$로 나타났다. KG 추출물 농도 0.625~2.5 mg/mL에서 세포독성은 보이지 않았다. 또한 RAW264.7 세포에서 LPS 유도에 의한 NO, $TNF-{\alpha}$ 분비 그리고 iNOS, $TNF-{\alpha}$의 mRNA 발현이 KG 추출물에 의해 유의하게 감소하였다. 이러한 결과는 삼내자 열수추출물이 안전하고 효과적인 화장품 원료로서의 활용 가능성이 있음을 보여준다.

Abstract ▼ AI-Helper

In this study, we investigated the possibility of Kaempferia Galanga(KG) hot water extract on the antioxidant, cytotoxic and anti-inflammatory efficacy as a cosmetic ingredient. Antioxidant effects were evaluated based on DPPH and ABTS radical scavenging activity, FRAP assay, and total polyphenol contents. The MTT assay was used to confirm the cell toxicity in mouse macrophage RAW264.7 cells. Anti-inflammatory effects were also investigated in LPS-induced RAW264.7 cells by measuring secretion of NO, $TNF-{\alpha}$ and iNOS, $TNF-{\alpha}$ mRNA expression level. As a result, DPPH and ABTS radical scavenging activities were increased in a concentration-dependent manner. The ferric reducing antioxidant power(FRAP) was the highest at 5 mg/mL as 24.5 uM. The measurements of total polyphenol content was $1.28{\pm}0.064mg\;GAE/g$. The cytotoxicity of the KG extract results showed no cytotoxicity at concentration of 0.625 to 2.5 mg/mL. In addition, the extract of KG significantly suppressed the LPS-induced nitrite, $TNF-{\alpha}$ secretion and the mRNA expression of iNOS, $TNF-{\alpha}$ in RAW264.7 cells. Taken together, these data suggest that the KG hot water extracts can be used as a safe and functional cosmetic raw material.

주제어

표/그림 (9)

그림 Fig. 1. Effect of KG extracts on the DPPH radical scavenging activity. Results are the mean±S.D. from three independent experiments. *p<0.05 compared to the negative control.
그림 Fig. 2. Effect of KG extracts on the ABTS radical scavenging activity. Results are the mean±S.D. from three independent experiments. *p<0.05; **p<0.001 compared to the negative control.
표 Table 1. TNF-α, iNOS and GAPDH primer
그림 Fig. 3. Ferric reducing antioxidant power assay of KG extracts. Results are the mean±S.D. from three independent experiments. *p<0.05 compared to the negative control.
그림 Fig. 4. Effect of KG extracts on RAW264.7 cell viability. Cells were treated with various concentration of KG for 24 h. Cell viability was evaluated using the MTT assay. Results are the mean±S.D. from three independent experiments. *p<0.05; **p<0.001 compared to the negative control.
표 Table 2. Total polyphenol contents (TPC) of KG extracts.
그림 Fig. 5. Effect of KG extracts on the NO production and iNOS protein expression in LPS-induced RAW264.7 cells. Cells were incubated with LPS in the presence or absence of KG for 24 h. The NO concentration in medium was determined by Griess reagent assay(a). The whole cell lysates were then subjected to Western blot analysis(b). Results are the mean±S.D. from three independent experiments. *p<0.05 compared to the negative control.
그림 Fig. 6. Effect of KG extracts on TNF-α secretion in LPS-induced RAW264.7 cells. Cells were incubated with LPS in the presence or absence of KG for 24 h. Results are the mean±S.D. from three independent experiments. *p<0.05 compared to the negative control.
그림 Fig. 7. Effect of KG extracts on iNOS and TNF-α gene expression in LPS-induced RAW264.7 cells. Cells were incubated with LPS in the presence or absence of KG for 12 h. iNOS(a) and TNF-α (b) mRNAlevels were determined using real-time PCR. Results are the mean±S.D. from three independent experiments. *p<0.05; **p<0.001 compared to the negative control.

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 삼내자 열수추출물을 이용하여 항산화, 세포독성, 항염 효능을 조사하여 천연식물 원료의 화장품 소재로서의 활용가능성을 확인하고자 하였다.
본 연구는 삼내자 열수추출물의 화장품 원료로서의 가능성을 조사하기 위해 삼내자 열수추출물을 이용하여 항산화 활성, 세포독성, 항염 활성을 평가하였다. DPPH 또는 ABTS 라디컬 소거능과 FRAP 환원력을 이용한 항산화 활성 연구 결과 추출물 농도 의존적으로 삼내자 열수추출물의 항산화 효능이 증가하는 것으로 나타났다.

제안 방법

05% TBST로 15분간 3회 membrane을 씻은 후, 항-rabbit IgG, HRP-linked antibody(Cell Signaling Technology, MA, USA)과 항-mouse IgG, HRP-linked antibody를 1시간 반응시켰다. 0.05% TBST로 15분간 3회 membrane을 씻은 후, Chemiluminescence detection kit(EZ-Western Lumi Pico, DoGen, Seoul, Korea)로 단백질을 검출하였다.
5% BSA 용액으로 blocking한 뒤, 1차 항체인 Rabbit 항-iNOS(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)와 Mouse 항-β-actin을 4℃에서 16시간 반응시켰다. 0.05% TBST로 15분간 3회 membrane을 씻은 후, 항-rabbit IgG, HRP-linked antibody(Cell Signaling Technology, MA, USA)과 항-mouse IgG, HRP-linked antibody를 1시간 반응시켰다. 0.
ABTS 라디컬 소거능은 Roberta 등의 실험 방법을 수정하여 수행하였다[24]. ABTS⁺ 라디컬 생성은 7.
DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디컬 소거능은 Blois 등의 실험 방법을 수정하여 수행하였다[23]. 농도별 삼내자 열수추출물과 0.
FRAP에 의한 삼내자 열수추출물의 환원력 측정은 Benzie 등의 실험 방법을 수정하여 수행하였다[25]. 표준시약으로는 Ferrous sulfate를 0.
추출물 처리 전 새로운 배지로 교체한 뒤, LPS (200 ng/mL)와 농도별 삼내자 열수추출물을 처리하여 24시간 배양하였다. 배양된 세포 배지 내 분비된 NO 양은 Griess reagent 방법을 수정하여 측정하였다[27]. 세포 배양 상등액 100 ㎕와 Griess reagent(Sigma, St.
대식세포를 그람 음성 세균의 내독소인 Lipopolysaccharide(LPS)로 자극하면 염증성 사이토카인 TNF-α, NO 등과 같은 염증 매개 물질을 생성하게 된다[34]. 삼내자 열수추출물의 NO 생성에 대한 영향을 확인하기 위하여 LPS로 RAW264.7 세포에 염증을 유도한 후, 각 농도별 추출물을 처리한 결과 Fig. 5a와 같다. LPS(200 ng/ml)만 처리한 세포에서 NO 생성량은 9.
삼내자 열수추출물의 RAW264.7세포에서 NO (nitric oxide)의 생성에 대한 영향을 조사하기 위하여 세포를 1x105 cells/well로 24 well culture plate에 넣고 16시간 배양하였다.
삼내자 열수추출물이 RAW264.7 세포에서 염증성 사이토카인 TNF-α의 생성에 미치는 영향을 조사하기 위해 세포를 1×105 cells/well로 24 well culture plate에 넣고 16시간 배양하였다.
7 세포를 1×10⁶cells/dish로 60 mm-dish에 넣고 16시간 배양하였다. 새로운 배지로 교체한 뒤, LPS(200 ng/mL)와 농도별 삼내자 열수추출물을 24시간 처리하였다. 차가운 PBS로 세포를 2회 세척하고, RIPA buffer(Thermo scientific, Rockford, IL, USA)를 첨가하여 얼음에서 30분간 세포를 용해시켰다.
세포 배지 제거 후, 5min Cell/Virus RNA isolation kit (BioFactories, USA)를 사용하여 total RNA를 분리하였다. 추출한 RNA(0.5 ㎍)는 One Step SYBR primeScript RT-PCR Kit(TaKaRa, Tokyo, Japan)를 이용하여 real-time PCR을 수행하였다. 본 실험에 사용된 primer는 Table 1과 같다[28].
폴리페놀 함량은 AOAC[26]의 실험 방법을 수정하여 Folin-Denis법으로 수행하였다. 농도별 삼내자 열수추출물과 Folin-Denis reagent 를 동일한 양으로 섞어 실온에서 5분간 용해시킨 뒤 10% Na₂CO₃ 를 첨가하여 암 조건하에서 반응시킨다.
FRAP에 의한 삼내자 열수추출물의 환원력 측정은 Benzie 등의 실험 방법을 수정하여 수행하였다[25]. 표준시약으로는 Ferrous sulfate를 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 nM의 농도로 만들어 사용하였다. FRAP 용액(300 mM acetate buffer pH3.

대상 데이터

본 실험에 사용된 삼내자의 뿌리줄기는 중국 하남성에서 재배한 것으로 2018년 10월에 서울시 약령시장에서 건조된 삼내자를 구입하여 사용하였다. 열수추출은 건조 분쇄한 삼내자 300 g에 증류수 5 L를 첨가하여 80℃에서 24 시간 추출한 후, 여과(Whatman filter paper No.
본 실험에사용한 쥐의 대식세포(RAW264.7)는한국세포주 은행(KCLB, Seoul, Korea)으로부터 분양받아 사용하였으며, 10% fetal bovine serum과 1% Penicillin-Streptomycin을 넣은 DMEM 배양액을 이용하여 5% CO₂가 공급되는 배양기에서 37℃ 조건으로 배양하였다.
삼내자 열수추출물의 RAW264.7 세포에 대한 세포독성 여부를 조사하기 위하여 세포를 3x10⁴ cells/well로 96 well culture plate에 넣고 16시간 배양하였다. 새로운 배지 100 ㎕로 교체한 뒤, LPS(200 ng/mL)와 농도별 삼내자 열수추출물을 처리하여 24시간 배양하였다.
Louis, MO, USA)용액을 30분간 반응시킨 뒤 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조물질로는 1 mg/mL의 Vitamin C(A5960, Sigma, China)를 이용하였다.

데이터처리

본 연구에 표기된 모든 결과는 평균±표준편차로 나타내었고, 평균값 사이에 대한 유의성은 student's t-test를 이용하여 p-value값을 계산하여 통계적 유의성 검증을 실시하였다.

이론/모형

차가운 PBS로 세포를 2회 세척하고, RIPA buffer(Thermo scientific, Rockford, IL, USA)를 첨가하여 얼음에서 30분간 세포를 용해시켰다. 13,000 rpm, 4℃ 조건에서 15분간 원심분리하여 얻은 상층액을 대상으로 Bradford assay를 이용하여 단백질을 정량하였다. 각 well 당 50 ㎍의 whole lysates를 SDS-PAGE에 전기영동한 후, PVDF membrane으로 transfer하였다.
Cells were treated with various concentration of KG for 24 h. Cell viability was evaluated using the MTT assay. Results are the mean±S.
삼내자 추출물의 iNOS (Inducible nitric oxide synthase) 발현에 대한 영향을 조사하기 위해 western blot을 수행하였다. RAW264.
세포 배양액 내의 TNF-α 분비량을 ELISA kit(BD Biosciences, CA, USA) 분석법을 이용하여 측정하였다.

성능/효과

본 연구는 삼내자 열수추출물의 화장품 원료로서의 가능성을 조사하기 위해 삼내자 열수추출물을 이용하여 항산화 활성, 세포독성, 항염 활성을 평가하였다. DPPH 또는 ABTS 라디컬 소거능과 FRAP 환원력을 이용한 항산화 활성 연구 결과 추출물 농도 의존적으로 삼내자 열수추출물의 항산화 효능이 증가하는 것으로 나타났다. 또한 총 폴리페놀 함량 측정 결과 1.
LPS 단독 처리시 세포 생존율은 104.4%±1.64%로 나타났으며, 삼내자 추출물 0.625, 1.25, 2.5 mg/mL 농도에 따른 세포 생존율은 각각 100.3%±3.0, 93.7%±3.83, 90.2%±3.86로 나타났다.
LPS(200 ng/ml)만 처리한 세포에서 NO 생성량은 9.08±0.11 µM로 현저히 증가하였으며, 추출물을 0.312, 0.625, 1.25 및 2.5 mg/mL 농도로 처리한 결과, 각 8.37 µM±0.23, 7.84 µM±0.59, 7.37 µM±0.38 및 5.71 µM±0.44로 삼내자 열수추출물 농도 의존적으로 NO 생성이 억제됨을 확인하였다.
LPS로 활성화된 RAW264.7 세포에 삼내자 열수추출물을 처리한 결과 LPS에 의해 유도된 NO 생성, iNOS 단백질 및 TNF-α 분비가 감소하였으며, 이러한 결과는 추출물 처리에 따른 세포 내 iNOS 또는 TNF-α mRNA 발현억제 기전을 통해 나타나는 것을 확인하였다.
5b와 같다. RAW264.7 세포 내 LPS 처리 후 증가된 iNOS의 단백질 발현 수준은 추출물 0.312, 0.625, 1.25, 2.5 mg/mL 농도로 증가할수록 현저히 감소함을 확인하였다. 따라서 삼내자 추출물에 의한 NO 생성 저해는 iNOS 단백질과 mRNA발현 억제에 의한 것으로 사료된다.
그 결과 삼내자 열수추출물 농도 증가에 따른 세포 내 TNF-α와 iNOS mRNA발현 수준이 감소되는 것을 확인하였다(Fig. 7a and 7b).
그 결과 총 폴리페놀 함량은 1.28±0.064 mg GAE/g로 확인되었다.
5로 양성대조군에 비해 다소 낮은 라디컬 소거능을 보였다. 그러나 DPPH 라디컬 소거능 결과와 동일하게 추출물 농도에 따른 라디컬 소거활성이 증가함을 알 수 있었다.
따라서 삼내자 열수추출물은 LPS에 의해 유도된 염증매개 물질인 TNF-α와 iNOS의 mRNA 합성을 감소시키고 그 결과 iNOS 단백질 발현을 억제함에 따라 NO의 생성을 저해하는 것으로 사료된다.
이러한 결과는 삼내자 추출물 내 항산화 활성을 지닌 유효 성분증가에 의한 것으로 사료된다. 따라서 이러한 결과들을 종합해 볼 때 삼내자 열수추출물은 새로운 천연 항산화제로서의 가능성이 있는 것으로 판단된다.
또한 총 폴리페놀 함량 측정 결과 1.28±0.064 mg GAE/g로 확인되었다.
삼내자 열수추출물을 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5 mg/mL 농도로 처리한 결과 10.81±0.43 ng/mL, 9.56±0.04 ng/mL, 7.97±0.14 ng/mL, 6.07±0.02 ng/mL로 TNF-α의 분비가 감소되는 것을 확인하였다.
열수추출법을 이용한 삼내자 추출물의 항산화 활성 연구는 거의 이루어진 바가 없으며, 현재까지 보고된 선행 연구에서 사용된 다양한 유기용매를 이용한 삼내자추출물과 마찬가지로 삼내자 열수추출물 또한 우수한 항산화 효능을 지닌 천연물질임을 확인하였다. 삼내자 열수추출물의 항염 효능을 평가하기 전 쥐의 대식 세포주인 RAW264.7 세포를 이용하여 세포 생존율을 측정한 결과 저농도에서는 세포 독성이 나타나지 않았으나 5 mg/mL 이상에서는 세포독성이 관찰되었다. 본 연구에서 사용된 삼내자 열수추출물은 미정제 추출물(crude extract)이므로 향후 열수추출 후 분획화에 따른 추출물의 연구가 수반되어야 할 것으로 사료된다.
세포만 배양 한 음성대조군에서 TNF-α 분비량은 3.72±0.23 ng/mL로 나타났으며, LPS(200 ng/ml) 단독 처리군에서 TNF-α의 농도는 12.9±0.48 ng/mL로 급격히 증가하였다.
양성 대조물질 Vitamin C (1 mg/mL)에서 라디컬 소거능은 95.5±0.05%로 나타났으며 삼내자 열수추출물 농도(0.625, 1.25, 2.5 및 5mg/mL)에 따른 라디컬 소거능은 7.4%±1.3, 14.9%±2.5, 27.5%±2.7, 43.9%±1.5로 양성대조군에 비해 다소 낮은 라디컬 소거능을 보였다.
064 mg GAE/g로 확인되었다. 열수추출법을 이용한 삼내자 추출물의 항산화 활성 연구는 거의 이루어진 바가 없으며, 현재까지 보고된 선행 연구에서 사용된 다양한 유기용매를 이용한 삼내자추출물과 마찬가지로 삼내자 열수추출물 또한 우수한 항산화 효능을 지닌 천연물질임을 확인하였다. 삼내자 열수추출물의 항염 효능을 평가하기 전 쥐의 대식 세포주인 RAW264.
09로 감소되는 것을 확인하였다. 피부암(흑색종)세포를 대상으로 삼내자 에탄올 또는 메탄올추출물의 세포 독성 연구결과에서 본 연구결과와 비교하여 낮은 농도에서 매우 높은 세포 독성이 확인되었다.[18,19].

후속연구

7 세포에 삼내자 열수추출물을 처리한 결과 LPS에 의해 유도된 NO 생성, iNOS 단백질 및 TNF-α 분비가 감소하였으며, 이러한 결과는 추출물 처리에 따른 세포 내 iNOS 또는 TNF-α mRNA 발현억제 기전을 통해 나타나는 것을 확인하였다. 따라서 삼내자 열수추출물은 세포 안정성과 항산화 및 항염 기능의 유효성분을 포함하여 화장품 천연 원료로서의 활용 가능성이 높을 것으로 기대된다.
7 세포를 이용하여 세포 생존율을 측정한 결과 저농도에서는 세포 독성이 나타나지 않았으나 5 mg/mL 이상에서는 세포독성이 관찰되었다. 본 연구에서 사용된 삼내자 열수추출물은 미정제 추출물(crude extract)이므로 향후 열수추출 후 분획화에 따른 추출물의 연구가 수반되어야 할 것으로 사료된다. LPS로 활성화된 RAW264.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	삼내자 (Kaempferia Galanga L.)는 무엇인가?	삼내자 (Kaempferia Galanga L.)는 생강과(Plant Zingiberaceae)에 속하는 다년생 열대초본식물로 뿌리줄기인 근경(rhizome, 根莖)부위가 주로 열대아시아 요리에 첨가 되어 식용 또는 약용으로도 널리 사용되고 있다[11,12]. 삼내자는 헥산(Hexane), 에탄올 또는 메탄올 등의 다양한 추출법을 이용한 여러 가지 미생물에 대한 항균활성[13], 항암[14-16], 미백 효능[17-19]에 관한 연구가 활발히 이루어지고 있다.
	삼내자 열수추출물이 화장품 천연 원료로서의 어떠한 기능을 포함하고 있는가?	7 세포에 삼내자 열수추출물을 처리한 결과 LPS에 의해 유도된 NO 생성, iNOS 단백질 및 TNF-α 분비가 감소하였으며, 이러한 결과는 추출물 처리에 따른 세포 내 iNOS 또는 TNF-α mRNA 발현억제 기전을 통해 나타나는 것을 확인하였다. 따라서 삼내자 열수추출물은 세포 안정성과 항산화 및 항염 기능의 유효성분을 포함하여 화장품 천연 원료로서의 활용 가능성이 높을 것으로 기대된다.
	삼내자(Kaempferia Galanga)의 항산화 활성, 항염 효능을 입증할 수 있는 근거는 무엇인가?	7 세포에서 nitric oxide(NO), $TNF-{\alpha}$ 분비 및 iNOS, $TNF-{\alpha}$ mRNA 발현 수준을 조사하였다. 그 결과 DPPH와 ABTS 라디칼 소거능은 농도 의존적으로 라디칼 소거 활성이 증가하였다. FRAP 값은 5 mg/mL에서 24.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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