[논문]무막줄기세포추출물의 H2O2에 의해 유도된 치주 세포의 염증 반응 보호 효과

허메이통; 김지현; 김영실; 박혜숙; 조은주

doi:10.5762/kais.2019.20.6.95

초록
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대표적인 치주질환인 치주염은 출혈, 통증 및 치아 손실을 초래하며, 산화적 스트레스는 치주염의 주요 원인으로 알려져 있다. 본 연구는 지방조직 유래 무막줄기세포추출물의 $H_2O_2$ 유도 산화적 손상에 대한 치주염 보호 효과를 확인하고자, 치주인대 섬유모세포(human periodontal ligament fibroblasts; HPLF)를 이용하여 세포 생존율, 염증 및 세포 사멸 관련 단백질 발현을 측정하였다. $H_2O_2$로 산화적 스트레스를 유도한 HPLF 세포에 무막줄기세포추출물 처리 시, $H_2O_2$만을 처리한 control군에 비해 유의적으로 세포 생존율이 증가함을 통해 산화적 손상에 대한 세포 보호 효과를 확인하였다. 또한, 무막줄기세포추출물은 nuclear factor kappa light chain enhancer of activated B cells, inducible nitric oxide synthase 및 interleukin-6와 같은 염증 관련 단백질 발현을 감소시켜 $H_2O_2$로 유도된 염증반응 보호 효과를 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라, 무막줄기세포추출물 처리 군은 caspase-9, -3, poly (ADP-ribose) polymerase 단백질 발현 감소와 B-cell lymphoma 2 (Bcl-2)-associated X protein/Bcl-2 비율을 저하시켜 $H_2O_2$ 유도 산화적 손상에 대한 세포사멸 보호 효과를 보였다. 따라서 지방조직 유래 무막줄기세포추출물은 $H_2O_2$ 유도 산화적 손상에 대한 HPLF 세포의 염증반응 및 세포사멸을 저해함으로써 치주염으로부터 보호 효과가 있어, 치주질환 치료용 소재로써의 활용 가능성이 있을 것으로 기대된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Periodontal inflammation, a major kind of periodontal diseases, is characterized to bleed, pain, and teeth loss, and it is resulted from oxidative stress. Membrane-free stem cell extract could avoid the immunogencity rejection by removal of cell membrane. In the present study, we investigated the pr...

Periodontal inflammation, a major kind of periodontal diseases, is characterized to bleed, pain, and teeth loss, and it is resulted from oxidative stress. Membrane-free stem cell extract could avoid the immunogencity rejection by removal of cell membrane. In the present study, we investigated the protective effect of membrane-free stem cell extract from oxidative stress-induced periodontal inflammation in human periodontal ligament fibroblasts (HPLF). In the cell viability measurement, membrane-free stem cell extract showed significant increase of cell viability, compared with the $H_2O_2$-treated control group. To further investigation of molecular mechanisms, we measured inflammation and apoptosis related protein expressions. Membrane-free stem cell extract attenuated inflammation-related protein expressions such as nuclear factor kappa light chain enhancer of activated B cells, inducible nitric oxide synthase, and interleukin-6. In addition, the treatment of membrane-free stem cell extract decreased apoptotic protein expressions such as cleaved caspase-9, -3, poly (ADP-ribose) polymerase, and B-cell lymphoma 2 (Bcl-2)-associated X protein/Bcl-2 ratio in the $H_2O_2$-treated HPLF cells. In conclusion, membrane-free stem cell extract exhibited anti-oxidative stress effects by regulation of inflammation and apoptosis in HPLF, suggesting that it could be used as the treatment agents for periodontal inflammatory disease.

주제어

표/그림 (5)

그림 Fig. 1. Effect of membrane-free stem cell extract on H₂O₂-treated HPLF cells. Values are presented as mean ± SD. The different letters (a-c) indicate significant differences (P < 0.05) by Duncan’s multiple range test.
표 Table 1. Cytotoxicity of membrane-free stem cell extract on HPLF cells
그림 Fig. 2. Effect of membrane-free stem cell extract on inflammation-related protein expression in H₂O₂-treated HPLF cells. Values are presented as mean ± SD. The different letters (a-e) indicate significant differences (P < 0.05) by Duncan’s multiple range test.
그림 Fig. 3. Effect of membrane-free stem cell extract on apoptosis-related protein expression such as caspase-9, -3, and PARP in H₂O₂-treated HPLF cells. Values are presented as mean ± SD. The different letters (a-d) indicate significant differences (P < 0.05) by Duncan’s multiple range test.
그림 Fig. 4. Effect of membrane-free stem cell extract on apoptosis-related protein expression such as Bax and Bcl-2 in H₂O₂-treated HPLF cells. Values are presented as mean ± SD. The different letters (a-d) indicate significant differences (P < 0.05) by Duncan’s multiple range test.

AI 본문요약
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문제 정의

또한, 지방 조직 유래 줄기세포의 치주염 동물 모델에서 치주 조직 재생 효능이 보고되었으나[15], 지방조직 유래 무막줄기세포추출물의 치주염 보호 효과와 관련한 연구는 부족한 실정이다. 따라서 본 연구는 사람 지방조직 유래 무막줄기세포추출물의 H₂O₂ 유도 산화적 손상에 대한 치주염 보호 효과를 확인하고자 한다. 치주 인대 섬유모세포를 이용하여 세포 생존율, 염증 및 세포사멸 관련 단백질 발현 측정하여 치주염 보호 효과 및 작용 기전을 알아보고자 한다.
H₂O₂로 인한 산화적 스트레스는 치주질환의 발병에 중요한 역할을 하며, 특히 사람의 치주 인대 섬유 모세포(HPLF: Human Periodontal Ligament Fibroblasts, 이하 HPLF)에서 염증성 cytokines 및 chemokines 등의 염증 인자를 방출하여 염증반응, 세포 형태의 파괴 및 세포사멸을 일으켜 치주염을 일으키는 것으로 알려져 있다[4,5]. 따라서 염증 반응 개선을 통한 치주염 치료 연구가 활발히 이루어지고 있으며, 본 연구에서는 줄기세포(stem cell)를 이용하여 치주염 개선 가능성을 확인하고자 한다.

제안 방법

따라서 본 연구는 사람 지방조직 유래 무막줄기세포추출물의 H₂O₂ 유도 산화적 손상에 대한 치주염 보호 효과를 확인하고자 한다. 치주 인대 섬유모세포를 이용하여 세포 생존율, 염증 및 세포사멸 관련 단백질 발현 측정하여 치주염 보호 효과 및 작용 기전을 알아보고자 한다.

대상 데이터

본 시험에 사용된 무막줄기세포추출물은 ㈜티스템으로부터 제공받았다. 무막줄기세포추출물은 줄기세포 성분 추출물로, 인체지방조직에서 줄기세포를 분리, 배양한 후 세포막을 제거하여 획득하였다.
본 실험에 사용한 human periodontal ligament fibroblasts (이하 HPLF) 세포는 ScienCell사(Carlsbad, CA, USA)에서 분양 받아 실험에 사용하였다. 배양을 위해 fetal bovine serum (FBS), fibroblast growth supplement, penicillin/streptomycin solution, fibroblast medium 배지, trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 용액은 ScienCell사 (Carlsbad, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
무막줄기세포추출물은 줄기세포 성분 추출물로, 인체지방조직에서 줄기세포를 분리, 배양한 후 세포막을 제거하여 획득하였다. 원재료인 지방조직은 혈액검사를 통해 이상이 없는 20대 여성 중 BMI 25 ~ 29.9에 해당하는 사람을 대상으로 지방공여동의서를 받고 확보하였다. 시행한 혈액검사 항목은 B형간염바이러스, C형간염바이러스, 인체면역결핍바이러스, 인체T림프 영양성바이러스, 파보바이러스B19, 사이토메가로바이러스, 앱스타인바바이러스, 매독크레포네마 등이다.

데이터처리

모든 실험 결과는 Statistical Package for the Social Sciences (SPSS, Chicago, USA) 프로그램을 통해 analysis of variance (ANOVA) test를 하였으며, 시료 간의 유의성 분석을 위해 Duncan’s multiple range test를 이용하여 P < 0.05 유의수준으로 분석하였다.

이론/모형

산화적 손상에 대한 세포 보호 효과를 확인하기 위해 세포 생존율을 MTT assay에 의해 측정하였다[16]. HPLF 세포는 5×10⁴ cells/mL로 96 well plate에 seeding 후 24시간 동안 37℃에서 배양하였다.
염증 및 세포사멸 관련 단백질 발현 확인은 western blot analysis에 의해 측정하였다. 배양한 세포에 RIPA buffer를 첨가하여 4℃, 12,000 rpm에서 30분간 원심 분리한 뒤, 상층액을 이용하여 단백질 정량을 실시하였다.

성능/효과

로 인한 산화적 스트레스 보호 효과를 확인하였다. H₂O₂로 산화적 손상을 유도한 HPLF 세포에 무막줄기세포추출물 처리 시, 세포 생존율이 증가함을 통해, 산화적 스트레스로부터 세포를 보호하는 효과가 있음을 확인하였다. 또한, 무막줄기세포추출물은 H₂O₂를 처리한 HPLF 세포에서 NF-κB, iNOS 및 IL-6 단백질 발현의 감소를 통해 NF-κB pathway 조절을 통한 염증 반응 개선 효과를 나타내었다.
H₂O₂로 산화적 손상을 유도한 HPLF 세포에 무막줄기세포추출물 처리 시, 세포 생존율이 증가함을 통해, 산화적 스트레스로부터 세포를 보호하는 효과가 있음을 확인하였다. 또한, 무막줄기세포추출물은 H₂O₂를 처리한 HPLF 세포에서 NF-κB, iNOS 및 IL-6 단백질 발현의 감소를 통해 NF-κB pathway 조절을 통한 염증 반응 개선 효과를 나타내었다. 뿐만 아니라, caspase-9, -3, PARP 활성화 감소 및 Bax/Bcl-2 비율 조절을 통해 무막줄기세포추출물의 세포 사멸 보호 작용 기전을 확인하였다.
또한, 무막줄기세포추출물은 H₂O₂를 처리한 HPLF 세포에서 NF-κB, iNOS 및 IL-6 단백질 발현의 감소를 통해 NF-κB pathway 조절을 통한 염증 반응 개선 효과를 나타내었다. 뿐만 아니라, caspase-9, -3, PARP 활성화 감소 및 Bax/Bcl-2 비율 조절을 통해 무막줄기세포추출물의 세포 사멸 보호 작용 기전을 확인하였다. 따라서 지방조직 유래 무막줄기세포추출물은 염증 반응과 세포 사멸의 조절을 통해 HPLF 세포에서 산화적 손상에 대한 보호 효과가 있는 것으로 사료되며, 치주염 등의 치주질환에서의 치료제로써 이용 가능성이 있을 것으로 기대된다.

후속연구

뿐만 아니라, caspase-9, -3, PARP 활성화 감소 및 Bax/Bcl-2 비율 조절을 통해 무막줄기세포추출물의 세포 사멸 보호 작용 기전을 확인하였다. 따라서 지방조직 유래 무막줄기세포추출물은 염증 반응과 세포 사멸의 조절을 통해 HPLF 세포에서 산화적 손상에 대한 보호 효과가 있는 것으로 사료되며, 치주염 등의 치주질환에서의 치료제로써 이용 가능성이 있을 것으로 기대된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	치주염의 발생 원인은 산화적 스트레스인데 이를 유발하는 대표적인 물질은?	이러한 치주 염증의 발생은 염증 성 세균으로 인한 산화적 스트레스가 주요 원인으로 알려져 있다[2]. H2O2는 생체 대사 과정 중 발생하는 중간 대사산물 중의 하나이지만, 과다 생성 시 세포에 산화적 스트레스를 유발하는 대표적인 물질 중의 하나이다[3]. H2O2로 인한 산화적 스트레스는 치주질환의 발병에 중요한 역할을 하며, 특히 사람의 치주 인대 섬유 모세포(HPLF: Human Periodontal Ligament Fibroblasts, 이하 HPLF)에서 염증 성 cytokines 및 chemokines 등의 염증 인자를 방출하여 염증반응, 세포 형태의 파괴 및 세포사멸을 일으켜 치주염을 일으키는 것으로 알려져 있다[4,5].
	무막줄기세포추출물은 무엇인가?	따라서 이러한 줄기세포 치료제의 단점을 보완 하기 위해, 최근 무막줄기세포추출물에 대한 관심이 높다. 무막줄기세포추출물(membrane-free stem cell extract)은 면역 항체가 존재하는 줄기세포의 세포막을 제거한 뒤 각종 펩타이드와 성장인자들만을 함유한 추출물로써, 골프로 인한 손상에 대해 관절, 인대, 힘줄 및 근육 조직의 염증 개선 효능을 확인하였다[14]. 또한, 지방 조직 유래 줄기세포의 치주염 동물 모델에서 치주 조직 재생 효능이 보고되었으나[15], 지방조직 유래무막줄기 세포추출물의 치주염 보호 효과와 관련한 연구는 부족한 실정이다.
	무막줄기세포추출물은 어떤 효과가 있는가?	뿐만 아니라, 무막줄기세포추출물 처리 군은 caspase-9, -3, poly (ADP-ribose) polymerase 단백질 발현 감소와 B-cell lymphoma 2 (Bcl-2)-associated X protein/Bcl-2 비율을 저하시켜 $H_2O_2$ 유도 산화적 손상에 대한 세포사멸 보호 효과를 보였다. 따라서 지방조직 유래 무막줄기세포추출물은 $H_2O_2$ 유도 산화적 손상에 대한 HPLF 세포의 염증반응 및 세포사멸을 저해함으로써 치주염으로부터 보호 효과가 있어, 치주질환 치료용 소재로써의 활용 가능성이 있을 것으로 기대된다.

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