[논문]무막줄기세포추출물의 LLC-PK1 세포에서의 산화적 스트레스 개선 효과

김민정; 김지현; 박혜숙; 김영실; 조은주

doi:10.5762/kais.2019.20.8.303

무막줄기세포추출물의 LLC-PK1 세포에서의 산화적 스트레스 개선 효과
Protective Effect of Membrane-Free Stem Cell Extract against Oxidative Stress in LLC-PK1 Cells 원문보기

한국산학기술학회논문지 = Journal of the Korea Academia-Industrial cooperation Society, v.20 no.8, 2019년, pp.303 - 312

김민정 (부산대학교 식품영양학과 및 김치연구소) , 김지현 (부산대학교 식품영양학과 및 김치연구소) , 박혜숙 ((주)티스템) , 김영실 ((주)티스템) , 조은주 (부산대학교 식품영양학과 및 김치연구소)

초록
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신장에서 발생한 산화적 스트레스는 조직을 손상시키고 이는 만성신장질환으로 이어질 수 있다. 본 연구에서는 LLC-$PK_1$ 신장세포를 이용하여 산화적 스트레스 개선 효과를 살펴보았다. LLC-$PK_1$ 세포에 무막줄기세포추출물을 처리했을 때 체내 항산화 단백질인 heme-oxygenase-1, thioredoxin reductase 1, 및 NADPH quinine oxidoreductase-1의 발현이 증가함을 확인하였다. LLC-$PK_1$에 산화적 스트레스를 유도하기 위하여 3-morpholinosydnonimine (SIN-1)을 처리한 결과 세포생존율이 감소하여 산화적 스트레스로 인해 세포가 손상됨을 확인하였다. 그러나 무막줄기세포추출물을 처리하였을 때 세포생존율이 증가하였으며, $2.5{\mu}g/mL$에서 세포생존율이 58.84%에서 64.43%까지 증가하였다. 또한 무막줄기세포추출물은 LLC-$PK_1$ 세포에서 SIN-1으로 유도된 염증 및 세포사멸을 조절하였다. 염증 관련 단백질인 inducible nitric oxide synthase와 cyclooxygenase-2는 무막줄기세포 추출물을 처리했을 때 단백질 발현이 감소하였고, 세포사멸과 관련된 B-cell lymphoma-2-associated X protein/B-cell lymphoma-2 비율과 cleaved caspase-3, cleaved-poly (ADP-ribose) polymeras의 단백질 발현이 감소함을 확인하였다. 결과적으로 무막줄기세포출물은 SIN-1을 처리한 LLC-$PK_1$ 세포에서 산화적 스트레스에 대한 보호 효과가 있음을 알 수 있었으며, 이들 결과를 바탕으로 무막줄기세포추출물의 항산화 기능성 소재로서의 활용 가능성을 확인하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

Oxidative stress in kidneys can precede the development of chronic renal injury. We investigated the antioxidative effect of membrane-free stem cell extract (MFSCE) from adipose tissue in LLC-$PK_1$ renal proximal tubule cells. Treatment of LLC-$PK_1$ cells with MFSCE showed the up-regulation of heme-oxygenase-1, thioredoxin reductase 1, and NADPH quinine oxidoreductase-1 protein expressions, which are proteins related with antioxidative activities. When oxidative stress was induced by 3-morpholinosydnonimine (SIN-1), cell viability was decreased, indicating that LLC-$PK_1$ cells were damaged by SIN-1. However, MFSCE significantly elevated cell viability from 58.84% to 64.43% at the concentration of $2.5{\mu}g/mL$ in oxidative stress-induced LLC-$PK_1$ cells. Furthermore, MFSCE ameliorated inflammation and apoptosis in SIN-1-treated LLC-$PK_1$ cells by modulating protein expressions. Inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 protein expressions were down-regulated when LLC-$PK_1$ cells were treated with MFSCE. Apoptosis-related proteins, including B-cell lymphoma-2-associated X protein/B-cell lymphoma-2 ratio, cleaved caspase-3, and cleaved-poly (ADP-ribose) polymerase, were also down-regulated. It indicated that MFSCE protected apoptosis against oxidative stress in LLC-$PK_1$ cells. Taken together, these results suggested that MFSCE had a protective effect against SIN-1-induced oxidative stress in LLC-$PK_1$ cells. Therefore, MFSCE could be a promising therapeutic agent for oxidative stress-induced renal injury.

주제어

표/그림 (5)

그림 Fig. 1. Effect of membrane-free stem cell extract from adipose tissue on antioxidant activity-related protein expressions in LLC-PK₁ cells.
그림 Fig. 2. Effect of membrane-free stem cell extract from adipose tissue on cell viability in LLC-PK₁ cells treated with SIN-1.
그림 Fig. 3. Effect of membrane-free stem cell extract from adipose tissue on inflammation-related protein expressions in LLC-PK₁ cells.
그림 Fig. 4. Effect of membrane-free stem cell extract from adipose tissue on Bax/Bcl-2 protein expressions in LLC-PK₁ cells.
그림 Fig. 5. Effect of membrane-free stem cell extract from adipose tissue on apoptosis-related protein expressions in LLC-PK₁ cells.

AI 본문요약
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문제 정의

LLC-PK₁ 세포에서 hydroxyl radical을 비롯한 산소 대사물은 endonuclease를 활성화시켜 DNA를 분절하여 세포사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다[19]. 따라서 산화적 스트레스에 의한 세포 손상 연구에 널리 이용되는 세포주인 LLC-PK₁ 세포에 SIN-1으로 산화적 스트레스를 유도한 후 무막줄기세포추출물의 세포 보호 효과를 확인하여 항산화제로서 무막줄기세포추출물의 이용 가능성을 알아보고자 하였다.
따라서 무막줄기세포추출물 (MFSCE; membrane-free stem cell extract)을 이용함으로써 유효성분을 효과적으로 추출할 뿐만 아니라 불순물로 인한 부작용을 방지하여 그 효과가 증대될 것으로 기대된다. 무막줄기세포추출물을 이용하여 신장 근위 세뇨관 세포에서 산화적 스트레스 개선 효과를 확인한 연구는 거의 전무한 실정이므로 본 연구에서는 LLC-PK₁ 세포를 이용하여 무막줄기세포추출물의 산화적 스트레스 개선 효과를 검토하였다.
본 연구에서는 LLC-PK₁ 세포를 이용하여 무막줄기세포추출물의 산화적 스트레스 개선 효과를 살펴보았다. 무막줄기세포추출물은 LLC-PK₁ 세포에서 항산화 단백질인 HO-1, TrxR1 및 NQO1의 발현을 촉진시켰으며, SIN-1에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대하여 세포생존율을 58.

제안 방법

LLC-PK1 세포에 300 μM SIN-1을 24시간 동안 처리하여 ONOO-의 생성을 유도한 후, 무막줄기세포추출물을 처리하여 신장 근위 세뇨관 세포에서 산화적 스트레스에 대한 무막줄기세포추출물의 효과를 확인하였다.
위의 과정을 거쳐 획득한 지방조직에서 지방 줄기세포를 분리하여 정제한 후, 37℃, 5% CO₂ 조건의 incubator에서 초기배양을 실시하였으며, 세포가 자란 정도를 확인한 후 계대배양을 6~10회 반복하였다. 배지를 제거하고 줄기세포를 일정량 수득하여 초음파 등의 물리적 방법을 사용하여 세포막을 벗기고, 필터 등의 방법을 이용하여 세포막 조각을 제거하여 무막줄기세포추출물을 획득하였다. 수용액 상태의 무막줄기세포추출물은 동결건조하여 파우더 제형으로 만든 후 5 ± 2℃에서 보관하였다.
최종제인 무막줄기세포는 Good Laboratory Practice 인정기관에서 안전성 검사를 완료하여 독성이 없는 물질임을 확인하였다. 위의 과정을 거쳐 획득한 지방조직에서 지방 줄기세포를 분리하여 정제한 후, 37℃, 5% CO₂ 조건의 incubator에서 초기배양을 실시하였으며, 세포가 자란 정도를 확인한 후 계대배양을 6~10회 반복하였다. 배지를 제거하고 줄기세포를 일정량 수득하여 초음파 등의 물리적 방법을 사용하여 세포막을 벗기고, 필터 등의 방법을 이용하여 세포막 조각을 제거하여 무막줄기세포추출물을 획득하였다.
단백질이 부착된 membrane은 5% skim milk로 상온에서 50분 blocking 한 다음, 1차 항체를 4℃에서 overnight하며 반응시킨 후, PBS-T로 세척하고 2차 항체와 상온에서 1시간 반응시켰다. 이후 PBS-T로 세척 후 ECL solution과 반응시켜 chemilium inescence image system (Davinch-ChemiTM)을 이용하여 단백질 발현을 확인하였다.

대상 데이터

3-Morpholinosydnonimine (SIN-1)은 Santa Cruz Biotech. (Santa Cruz, CA), 3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-2,3-diphenyl tetrazolium bromide (MTT), dimethyl sulfoxide (DMSO)는 Sigma Chemical Co. (St Louis, MO, USA)사 제품을 구매하여 사용하였다. 1차 항체와 2차 항체는 Cell Signaling Tech.
(Beverly, MA, USA)와 Santa Cruz Biotech. (Santa Cruz, CA)에서 구매하였다. Enhanced chemiluminescence (ECL) solution는 BioRad (Hercules, CA, USA)에서 구입하였다.
Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin streptomycin, trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)는 WelGENE (Gyeongsan, Korea)에서 구입하였다.
본 시험에 사용된 무막줄기세포추출물은 ㈜티스템으로부터 제공받았다. 무막줄기세포추출물은 줄기세포 성분 추출물로, 인체지방조직에서 줄기세포를 분리, 배양한 후 세포막을 제거하여 획득하였다.
9에 해당하는 사람을 대상으로 지방공여동의서를 받고 확보하였다. 시행한 혈액검사 항목은 B형간염바이러스, C형간염바이러스, 인체면역결핍바이러스, 인체T림프영양성바이러스, 파보바이러스B19, 사이토메가로바이러스, 앱스타인바바이러스, 매독크레포네마 등이다. 최종제인 무막줄기세포는 Good Laboratory Practice 인정기관에서 안전성 검사를 완료하여 독성이 없는 물질임을 확인하였다.
실험에 사용된 LLC-PK₁ 세포는 ATCC (Manassas, USA)사에서 구매하여 실험에 사용하였다. LLC-PK₁ 세포는 5% FBS, 100 units/mL penicillin streptomycin가 함유된 DMEM을 사용하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다.
무막줄기세포추출물은 줄기세포 성분 추출물로, 인체지방조직에서 줄기세포를 분리, 배양한 후 세포막을 제거하여 획득하였다. 원재료인 지방조직은 혈액검사를 통해 이상이 없는 20대 여성 중 BMI 25 ~ 29.9에 해당하는 사람을 대상으로 지방공여동의서를 받고 확보하였다. 시행한 혈액검사 항목은 B형간염바이러스, C형간염바이러스, 인체면역결핍바이러스, 인체T림프영양성바이러스, 파보바이러스B19, 사이토메가로바이러스, 앱스타인바바이러스, 매독크레포네마 등이다.

데이터처리

The letters (a-c) represent significant differences (P < 0.05) by Duncan’s multiple range test.
The letters (a-d) represent significant differences (P < 0.05) by Duncan’s multiple range test.
The letters (a-e) represent significant differences (P < 0.05) by Duncan’s multiple range test.
통계 프로그램은 Statistical Package for the Social Sciences (SPSS)를 이용하여 분석하였으며, analysis of variance (ANOVA) test 및 Duncan’s multiple range test를 이용하여 P < 0.05 수준에서 각 군의 유의성을 검정하였다.

성능/효과

LLC-PK1 세포에 300 μM SIN-1으로 산화적 스트레스를 유도한 후 무막줄기세포추출물을 처리하여 세포사멸 관련 단백질 발현을 측정한 결과, normal군에 비해 control군에서 cleaved caspase-9, cleaved caspase-3, cleaved PARP의 단백질 발현이 유의적으로 증가한 것을 확인하였다 (Fig. 5).
LLC-PK1 세포에 300 μM SIN-1을 처리하여 ONOO-의 발생을 유도한 후 무막줄기세포추출물을 처리하여 염증 관련 단백질 발현을 측정한 결과, normal군과 비교하여 control군에서 iNOS, COX-2, IL-1β, IL-6의 단백질 발현이 유의적으로 증가한 것을 확인하였다 (Fig. 3).
TrxR1와 NQO1은 산화환원 반응을 통해 산화적 스트레스로부터 세포를 보호하는 것으로 알려져 있다[23,25,26]. LLC-PK₁ 세포에 무막줄기세포추출물을 농도별로 처리하여 HO-1, TrxR1 및 NQO1의 단백질 발현을 측정한 결과, 무막줄기세포추출물을 처리하였을 때 이들 단백질 발현이 증가하였으며, HO-1과 TrxR1의 단백질 발현이 농도유의적으로 증가함을 확인하였다 (Fig. 1). 이러한 결과를 통해 무막줄기세포추출물은 항산화 효과가 있는 단백질의 발현을 증가시킴으로써, free radical로 유도되는 세포의 산화적 스트레스를 보호할 것으로 사료된다.
Normal군과 비교하여 300 μM SIN-1을 처리한 control 군에서 Bax/Bcl-2의 단백질 발현이 증가한 것을 확인한 한편, 무막줄기세포추출물을 처리하였을 경우, Bax/Bcl-2의 단백질 발현이 유의적으로 감소하였다 (Fig. 4).
LLC-PK₁ 세포에 300 μM SIN-1을 24시간 동안 처리하여 ONOO^-의 생성을 유도한 후, 무막줄기세포추출물을 처리하여 신장 근위 세뇨관 세포에서 산화적 스트레스에 대한 무막줄기세포추출물의 효과를 확인하였다. 그 결과, normal군 100% 대비 SIN-1을 단독으로 처리한 control군에서 58.84%로 세포 생존율이 감소하였다 (Fig. 2). 반면 무막줄기세포추출물을 처리하였을 때, 2.
이러한 무막줄기세포추출물의 보호 효과에 대한 메커니즘을 살펴본 결과, 염증매개인자인 COX-2, iNOS와 세포사멸 관련 단백질인 Bax, Bcl-2, cleaved caspase 3, cleaved PARP의 발현을 조절함으로써 나타나는 것으로 사료된다. 따라서 무막줄기세포추출물은 항산화, 염증 및 세포사멸 단백질을 조절함으로써 산화적 스트레스에 대한 보호 효과를 가지는 것으로 사료된다.
세포를 이용하여 무막줄기세포추출물의 산화적 스트레스 개선 효과를 살펴보았다. 무막줄기세포추출물은 LLC-PK₁ 세포에서 항산화 단백질인 HO-1, TrxR1 및 NQO1의 발현을 촉진시켰으며, SIN-1에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대하여 세포생존율을 58.84%에서 64.43%까지 증가시켰다. 이러한 무막줄기세포추출물의 보호 효과에 대한 메커니즘을 살펴본 결과, 염증매개인자인 COX-2, iNOS와 세포사멸 관련 단백질인 Bax, Bcl-2, cleaved caspase 3, cleaved PARP의 발현을 조절함으로써 나타나는 것으로 사료된다.
무막줄기세포추출물을 처리하였을 때 cleaved caspase-9의 단백질 발현에서는 유의미한 효과를 확인하지 못하였으나 cleaved caspase-3의 단백질 발현을 유의적으로 감소시켰으며, control 군과 비교하여 0.5와 1 μg/mL 농도에서 cleaved PARP의 단백질 발현을 유의적으로 감소시켰다.
반면 무막줄기세포추출물을 처리하였을 때, 2.5 μg/mL의 농도에서 64.43%로 세포 생존율이 증가하였으며 control군에 비해 통계적으로 유의미한 차이를 나타내었으므로 ONOO-로 인한 산화적 손상에 대한 무막줄기세포추출물의 보호 효과를 확인하였다.
또한 지방 유래 줄기세포에서 분비되는 insulin-like growth factor (IGF)를 unilateral ureteral obstruction 마우스 모델에 경구투여 했을 때, IGF가 ERK/MAPK pathway를 활성화시켜 신장 세뇨관 상피 세포를 보호하였다[44]. 이들 결과를 바탕으로 산화적 스트레스를 유도한 신장 세뇨관 상피세포에서 인체지방 유래 줄기세포로부터 유효성분을 추출한 무막줄기세포추출물의 보호 효과는 줄기세포에서 분비된 paracrine factor에 의한 것으로 사료된다.
1). 이러한 결과를 통해 무막줄기세포추출물은 항산화 효과가 있는 단백질의 발현을 증가시킴으로써, free radical로 유도되는 세포의 산화적 스트레스를 보호할 것으로 사료된다.
43%까지 증가시켰다. 이러한 무막줄기세포추출물의 보호 효과에 대한 메커니즘을 살펴본 결과, 염증매개인자인 COX-2, iNOS와 세포사멸 관련 단백질인 Bax, Bcl-2, cleaved caspase 3, cleaved PARP의 발현을 조절함으로써 나타나는 것으로 사료된다. 따라서 무막줄기세포추출물은 항산화, 염증 및 세포사멸 단백질을 조절함으로써 산화적 스트레스에 대한 보호 효과를 가지는 것으로 사료된다.
시행한 혈액검사 항목은 B형간염바이러스, C형간염바이러스, 인체면역결핍바이러스, 인체T림프영양성바이러스, 파보바이러스B19, 사이토메가로바이러스, 앱스타인바바이러스, 매독크레포네마 등이다. 최종제인 무막줄기세포는 Good Laboratory Practice 인정기관에서 안전성 검사를 완료하여 독성이 없는 물질임을 확인하였다. 위의 과정을 거쳐 획득한 지방조직에서 지방 줄기세포를 분리하여 정제한 후, 37℃, 5% CO₂ 조건의 incubator에서 초기배양을 실시하였으며, 세포가 자란 정도를 확인한 후 계대배양을 6~10회 반복하였다.

후속연구

따라서 줄기세포를 주입하는 대신 줄기세포 배양액을 사용하기도 하나, 이러한 배양액은 소혈청 및 항생제와 같이 세포 배양 시 필요한 기타 첨가제가 함유되어 있어 유효성분의 함유량이 적고, 이러한 성분들이 주입될 경우 원하는 기능이나 효능 이외에 원하지 않는 부정적인 효과가 나타날 수 있다[14]. 따라서 무막줄기세포추출물 (MFSCE; membrane-free stem cell extract)을 이용함으로써 유효성분을 효과적으로 추출할 뿐만 아니라 불순물로 인한 부작용을 방지하여 그 효과가 증대될 것으로 기대된다. 무막줄기세포추출물을 이용하여 신장 근위 세뇨관 세포에서 산화적 스트레스 개선 효과를 확인한 연구는 거의 전무한 실정이므로 본 연구에서는 LLC-PK₁ 세포를 이용하여 무막줄기세포추출물의 산화적 스트레스 개선 효과를 검토하였다.
이러한 결과는 무막줄기세포추출물이 염증매개인자인 COX-2와 iNOS의 조절을 통해 염증반응을 감소시킬 수 있을 것으로 기대되지만, COX-2의 활성화를 유도하여 염증반응을 일으키거나 COX-2가 활성화됨으로써 생성되는 전염증성 사이토카인인 IL-1β과 IL-6에 대한 무막줄기세포추출물의 조절 메커니즘에 대해서는 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	신장에서 발생한 산화적 스트레스가 인체에 미치는 영향은 무엇인가?	신장에서 발생한 산화적 스트레스는 조직을 손상시키고 이는 만성신장질환으로 이어질 수 있다. 본 연구에서는 LLC-$PK_1$ 신장세포를 이용하여 산화적 스트레스 개선 효과를 살펴보았다.
	항산화 효소 체계가 free radical을 반응성이 적은 물질로 환원하는 이유는 무엇인가?	Nitric oxide (NO)로부터 파생된 질소화합물을 통칭하는 활성질소종 (reactive nitrogen species, RNS)은 염증반응 시 발생하며, 유인된 대식세포와 호중구의 면역반응의 일환으로 NO synthase에 의해 다량 생성된다[2]. ROS와 RNS를 포함하는 free radical은 분자구조적으로 매우 불안정하기 때문에 지질, 단백질, DNA와 같은 고분자의 세포성분과 반응하여 지질 산화, 단백질 분해, DNA 변성 등을 일으켜 세포의 손상을 초래한다[3]. 인체는 이러한 free radical로부터 정상 세포를 보호하기 위해 항산화 효소 체계를 통해 free radical을 반응성이 작은 물질로 환원하지만, free radical이 과다하게 생성되거나 생체 내 항산화 효소 체계의 활성이 저해되어 이들 간의 균형이 깨어질 경우 산화적 스트레스가 발생하여 세포의 손상 및 손실을 초래하며, 노화를 비롯한 고혈압, 동맥경화와 같은 다양한 질환의 발병으로 이어질 수 있다[4,5].
	활성질소종이란 무엇인가?	인체는 생명을 유지하는데 필요한 에너지를 얻기 위하여 호흡과정을 통해 끊임없이 산소를 대사하며, 이 과정에서 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS)을 생산한다[1]. Nitric oxide (NO)로부터 파생된 질소화합물을 통칭하는 활성질소종 (reactive nitrogen species, RNS)은 염증반응 시 발생하며, 유인된 대식세포와 호중구의 면역반응의 일환으로 NO synthase에 의해 다량 생성된다[2]. ROS와 RNS를 포함하는 free radical은 분자구조적으로 매우 불안정하기 때문에 지질, 단백질, DNA와 같은 고분자의 세포성분과 반응하여 지질 산화, 단백질 분해, DNA 변성 등을 일으켜 세포의 손상을 초래한다[3].

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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