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문제 정의
- 따라서 부작용으로부터 자유로우면서도 효과가 탁월한 당뇨병 치료용 소재를 찾기 위한 연구가 계속해서 진행되고 있다. 본 연구에서는 무막줄기세포추출물의 포도당 흡수 효과와 그 기전을 살펴봄으로써 무막줄기세 포추출물의 항당뇨 소재로써의 가능성을 평가하였다.
- 지방 유래 줄기세포 추출물과 배양액의 활성으로는 상처치유, 섬유조직 증식 등의 효과가 보고되고 있으며, 이는 세포로 부터 분비된 물질들에 의한 것으로 알려져 있다 11,12) . 본 연구에서는 세포막 잔여물과 배지 성분을 제거한 무막줄 기세포추출물(membrane-free stem cell extract)을 사용함으로써 소혈청 및 항생제와 같은 첨가제 성분을 제거하고 유효성분의 함유량을 높여 단순 추출물 또는 배양액을 사용함에 따라 발생할 수 있는 부정적인 효과를 감소시킬 수 있을 것으로 생각된다. 지방 유래 줄기세포 추출물 또는 배양액, 특히 무막줄기세포추출물을 이용하여 지방 세포에서 포도당 흡수 촉진 효과를 확인한 연구는 전무한 실정이므로, 본 연구에서는 마우스 유래 지방전구세포인 3T3-L1 세포를 이용하여 지방 세포에서의 포도당 흡수 효과와 그 메커니즘을 규명하고자 한다.
- 본 연구에서는 세포막 잔여물과 배지 성분을 제거한 무막줄 기세포추출물(membrane-free stem cell extract)을 사용함으로써 소혈청 및 항생제와 같은 첨가제 성분을 제거하고 유효성분의 함유량을 높여 단순 추출물 또는 배양액을 사용함에 따라 발생할 수 있는 부정적인 효과를 감소시킬 수 있을 것으로 생각된다. 지방 유래 줄기세포 추출물 또는 배양액, 특히 무막줄기세포추출물을 이용하여 지방 세포에서 포도당 흡수 촉진 효과를 확인한 연구는 전무한 실정이므로, 본 연구에서는 마우스 유래 지방전구세포인 3T3-L1 세포를 이용하여 지방 세포에서의 포도당 흡수 효과와 그 메커니즘을 규명하고자 한다.
제안 방법
- 18) , 3T3-L1 preadipocyte에서 무막줄기세포추출물의 세포독성을 확인하기 위하여 0.5-5 μg/mL 농도에서 MTT asssy를 실시한 결과, 2.5 μg/mL의 농도까지 세포 생존에 영향을 미치지 않음을 확인하여 무막줄기세포추출물 0.5,1, 2.5 μg/mL를 실험 농도로 설정하였다.
- 2일 뒤 10% FBS, 10 μg/mL insulin을포함한 배지로 2일간 배양한 후 adipocyte로 분화할 때까지 2일마다 10% FBS가 포함된 배지로 교체해주었다.
- 3T3-L1 preadipocyte를 adipocyte로 분화유도하기 위하여 100% confluent된 상태에서 2일 후 0.5 mM IBMX, 1 μM Dex,및 10 μg/mL insulin (MDI)와 10% FBS가 함유된 분화유도 배지로 교체하였다.
- Confluence 후 2일 뒤 분화유도배지로 교체하여 adipocyte로의 분화를 유도하였고, 유도 후 2일 뒤 10% FBS, 10 μg/mL insulin을 포함한 배지로 2일간 배양한 후 adipocyte로 분화할 때까지 2일마다 10% FBS가 포함된 배지로 교체해주었다.
- 단백질이 부착된 membrane을 5% skim milk로 처리하여 blocking한 후, 1차 항체를 4℃에서 overnight 반응시켰다. PBS-T로 세척한 다음 2차 항체를 상온에서 1시간 반응시키고 다시 PBS-T로 세척한 후 ECL solution과 반응시켜 DavinchChemi TM Chemiluminescence image system (Core Bio, Seoul, Korea)을 이용하여 단백질 발현을 확인하였다.
- 무막줄기세포 추출물(0.5, 1, 2.5 μg/mL) 또는 1 μM insulin을 처리하여 30분간 배양한 뒤, 10 mM 2-deoxyglucose를 처리하여 20분간 배양하여 sample preparation하였다.
- 따라서 3T3-L1 adipocyte는 인슐린 신호전달 작용을 통해 항당뇨 소재를 스크리닝하기 위한 효과적인 모델로서 널리이용되고 있다 20) . 무막줄기세포추출물의 포도당 흡수 촉진 효과를 알아보기 위해 3T3-L1 adipocyte에 무막줄기세 포추출물을 처리한 뒤 glucose uptake assay를 실시하였다.그 결과, 무막줄기세포추출물을 처리하였을 때 농도가 증가함에 따라 2-DG6P의 흡수가 증가한 것을 확인하여, 지방세포에서 포도당 흡수를 촉진하여 혈당 강하 효과를 나타낼 것으로 생각한다.
- 위와 같이 정제된 지방 유래 줄기세포는 37℃, 5% CO2 incubator에서 초기배양을 실시하였으며, 계대배양을 6-10회 반복하였다. 배지를 제거하고 줄기세포를 일정량 수득하여 초음파 등의 물리적 방법을 사용하여 세포막을 벗기고, 필터 등의 방법을 이용하여 세포막 조각을 제거 하여 무막줄기세포추출물을 획득하였다. 최종제인 무막줄 기세포추출물은 Good Laboratory Practice 인정 기관인 ㈜ 켐온에서 물질에 대한 비임상 독성시험과 한국화학연구원 부설 안전성평가연구소에서 총 9회의 독성시험을 진행 하여 독성이 없는 안전한 물질임을 확인하였다.
- 지방조직 유래 줄기세포 배양액은 PC12 세포에서 AMPK pathway를 활성화하여 신경보호 작용을 나타냈다 27) . 이에더하여 본 연구에서는 지방조직 유래 무막줄기세포추출물이 AMPK pathway와 인슐린 신호전달 경로를 통해 3T3-L1 adipocyte에서 포도당 흡수를 촉진함을 확인하였다. 이와 같은 결과는 지방 유래 줄기세포는 다양한 치료법을 통해 당뇨병 개선을 위한 물질로 이용될 수 있음을 시사한다.
- IRS는 ser 307과 tyr 612 phosphorylation을 조절하여 phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), AKT, GLUT4 pathway에 관여함으로써, 항당뇨 활성 평가에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이전 연구에 의하면, 3T3-L1 세포에서 시료의 항당뇨 활성 평가 시 IRS ser 307 phosphorylation만으로 PI3K, AKT, GLUT4 pathway 조절을 설명한 것을 확인하여 본 연구에서도 IRS ser 307 phosphorylation 을 이용하여 결과를 서술하였다 22) . Protein tyrosine kinase 에 의해 tyrosine 인산화된 IRS-1는 차례로 PI3K, Akt, GLUT4를 활성화하며, 이 과정에서 GLUT4는 세포질에서 세포막으로 이동하여 포도당을 세포 내로 운반한다 23) .
- Louis, MO, USA) 에서 배양한 뒤, 원심 분리 및 세척하여 phosphate-buffered saline (PBS)에 재현탁시켜 지방 유래 줄기세포 수집에 사용 하였다. 지방 조직으로부터 지방 유래 줄기세포를 정제하기 위해, 고정된 세포에 각 표면 marker에 대한 monoclonal antibody와 2차 항체인 rabbit fluorescein isothiocyanate-labeled anti-mouse immunoglobulin G 등을 부착하였으며, 이를 fluorescence microscope를 이용하여 시각화하여 positive maker인 CD105, CD29를 확인하여 지방 유래 줄기세포를 정제 하였다. 위와 같이 정제된 지방 유래 줄기세포는 37℃, 5% CO2 incubator에서 초기배양을 실시하였으며, 계대배양을 6-10회 반복하였다.
대상 데이터
- Bovine serum albumin (BSA)는 Bioworld Technology (Bloomington, MN, USA)사제품을 구입하였다. 1차 항체와 2차 항체는 Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA)사 제품을 사용하였다. Enhanced chemiluminescence (ECL) solution은 Bio-Rad Laboratories, Inc.
- Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM), bovine calf serum (BCS), fetal bovine serum (FBS), penicillinstreptomycin, trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 는 WelGENE (Gyeongsan, Korea)에서 구입하였다. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,3-diphenyl tetrazolium bromide (MTT), dimethyl sulfoxide (DMSO), 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), dexamethasone, insulin은 Sigma Chemical Co. (St.Louis, M O, USA) 제품을 구매하여 사용하였다. KrebsRinger-phosphate-HEPES (KRPH) buffer는 Biosolution Co.
- (Seoul, Korea)에서 구입하였다. Bovine serum albumin (BSA)는 Bioworld Technology (Bloomington, MN, USA)사제품을 구입하였다. 1차 항체와 2차 항체는 Cell Signaling Technology, Inc.
- Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM), bovine calf serum (BCS), fetal bovine serum (FBS), penicillinstreptomycin, trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 는 WelGENE (Gyeongsan, Korea)에서 구입하였다.
- 본 연구에 사용한 무막줄기세포추출물은 ㈜티스템의 특허기술로 제조되었으며 줄기세포의 세포막을 제거한 뒤 각종 펩타이드와 성장인자 등을 함유한 추출물이다. 무막 줄기세포추출물을 nano-liquid chromatography-mass spectrometry analysis에 의해 분석하였을 때 대사과정, 생리활성, 세포증식 등을 조절하는 252개의 단백질을 확인하였다(data not shown). 이들 중 integrin alpha-5, integrin beta-1, -3 등을 포함한 19개 단백질은 세포 부착에 관여하며, 36개 단백질은 상처 치료에 관여하는 재생인자인 것으로 보고되었다.
- 무막줄기세포추출물은 ㈜티스템(Changwon, Korea)으로부터 제공받아 실험에 사용하였다. 혈액검사와 의사의 진단 결과에 따라 다른 질병이 없는 건강한 20대 비만 여성(BMI 25-29.
- 이와 같은 결과는 지방 유래 줄기세포는 다양한 치료법을 통해 당뇨병 개선을 위한 물질로 이용될 수 있음을 시사한다.본 연구에 사용한 무막줄기세포추출물은 ㈜티스템의 특허기술로 제조되었으며 줄기세포의 세포막을 제거한 뒤 각종 펩타이드와 성장인자 등을 함유한 추출물이다. 무막 줄기세포추출물을 nano-liquid chromatography-mass spectrometry analysis에 의해 분석하였을 때 대사과정, 생리활성, 세포증식 등을 조절하는 252개의 단백질을 확인하였다(data not shown).
- 9)의 미용을 목적으로 외과적 지방흡입 시술을 통해 버려지는 체지방 조직을 시료 제조에 사용하였다. 시행한 혈액검사 항목은 B형간염바이러스, C형간염 바이러스, 인체면역결핍바이러스, 인체T림프영양성 바이러스, 파보바이러스B19, 사이토메가로바이러스, 앱스타인바바이러스, 매독크레포네마 등이다. 지방흡입 시술 전 식약처에서 고시한 공여자 관리 절차에 따라 공여자에게 체지방 조직이 연구 목적으로 활용된다는 서면동의를 받았으며, 생명윤리위원회의 임상시험 승인을 받은 protocol 에 따라 체지방 조직을 획득하였다.
- 실험에 사용된 마우스 지방전구세포 3T3-L1 preadipocyte는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) 사에서 구매하였다. 3T3-L1 preadipocyte는 100 units/mL penicillin streptomycin, 10% BCS가 함유된 DMEM을 이용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
- 무막줄기세포추출물은 ㈜티스템(Changwon, Korea)으로부터 제공받아 실험에 사용하였다. 혈액검사와 의사의 진단 결과에 따라 다른 질병이 없는 건강한 20대 비만 여성(BMI 25-29.9)의 미용을 목적으로 외과적 지방흡입 시술을 통해 버려지는 체지방 조직을 시료 제조에 사용하였다. 시행한 혈액검사 항목은 B형간염바이러스, C형간염 바이러스, 인체면역결핍바이러스, 인체T림프영양성 바이러스, 파보바이러스B19, 사이토메가로바이러스, 앱스타인바바이러스, 매독크레포네마 등이다.
데이터처리
- Analysis of variance test 및 Duncan’s multiple range test를 실시하여 P<0.05에서 시료의 평균값 간 유의차를 검정하였다.
- The letters (a-c) represent significant differences (P<0.05) by Duncan’s multiple range test.
- The letters (a-d) represent significant differences (P<0.05) by Duncan’s multiple range test.
- 모든 실험 결과는 3회 반복 실험하여 평균±표준편차로 나타내었으며, 각 실험 결과 간 유의성을 검토하기 위하여 Statistical Package for the Social Sciences (SPSS; IBM Corp., Armonk, NY, USA)를 이용하였다.
이론/모형
- Protein tyrosine kinase 에 의해 tyrosine 인산화된 IRS-1는 차례로 PI3K, Akt, GLUT4를 활성화하며, 이 과정에서 GLUT4는 세포질에서 세포막으로 이동하여 포도당을 세포 내로 운반한다 23) . Glucose uptake assay 결과를 바탕으로 3T3-L1 adipocyte에서 무막줄기세포추출물이 인슐린 신호전달 과정에 미치는 영향을 알아보기 위해 Western blot analysis를 실시하였다. 분화가 유도된 3T3-L1 adipocyte에 무막줄기세포 추출물을 처리했을 때, p-IRS-1/IRS의 단백질 발현이 감소하고 p-Akt/Akt 및 GLUT4 단백질 발현이 증가하였다.
성능/효과
- 3T3-L1 preadipocyte에서 무막줄기세포추출물의 세포독 성을 확인하기 위하여 0.5-5 μg/mL 농도에서 MTT asssy를실시한 결과, 2.5 μg/mL의 농도까지 세포 생존에 영향을미치지 않았다(Table 1).
- 3T3-L1세포에 무막줄기세포추출물을 0.5, 1, 2.5 μg/mL의 농도로 처리하였을 때 농도가 증가함에 따라 2-deoxyglucose-6-phosphate (2-DG6P)의 흡수가 농도의존적으로 증가한 것을 확인하였다.
- 무막줄기세포추출물의 포도당 흡수 촉진 효과를 알아보기 위해 3T3-L1 adipocyte에 무막줄기세 포추출물을 처리한 뒤 glucose uptake assay를 실시하였다.그 결과, 무막줄기세포추출물을 처리하였을 때 농도가 증가함에 따라 2-DG6P의 흡수가 증가한 것을 확인하여, 지방세포에서 포도당 흡수를 촉진하여 혈당 강하 효과를 나타낼 것으로 생각한다.
- 무막줄기세포 추출물에 의한 AMPK의 활성화를 확인하기 위해 Western blot analysis를 통해 단백질 발현을 측정한 결과, 무막줄 기세포추출물 처리 시 p-AMPK/AMPK 및 p-ACC/ACC 단백질 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 따라서 무막줄 기세포추출물이 3T3-L1 adipocyte에서 AMPK pathway를 활성화하는 것으로 나타났으며, 이는 인슐린 신호전달 경로와 함께 포도당 흡수능에 영향을 미칠 것으로 생각된다. 줄기세포를 이용한 치료법에는 대표적으로 줄기세포를 주입하는 방법과 줄기세포 추출물 또는 배양액 내의 유효 성분을 이용하는 방법이 있다.
- ACC는 AMPK의 substrate로, AMPK가 이를 인산화하여 세포 내 지방산 합성을 조절함으로써 에너지 균형을 조절한다. 무막줄기세포 추출물에 의한 AMPK의 활성화를 확인하기 위해 Western blot analysis를 통해 단백질 발현을 측정한 결과, 무막줄 기세포추출물 처리 시 p-AMPK/AMPK 및 p-ACC/ACC 단백질 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 따라서 무막줄 기세포추출물이 3T3-L1 adipocyte에서 AMPK pathway를 활성화하는 것으로 나타났으며, 이는 인슐린 신호전달 경로와 함께 포도당 흡수능에 영향을 미칠 것으로 생각된다.
- 무막줄기세포추출물에 의한 AMPK의 활성화를 확인하기 위해 Western blot analysis를 통해 단백질 발현을 측정한 결과, control군과 비교하여 p-AMPK/AMPK의 단백질 발현이 농도의존적으로 증가하였고, p-acetyl-CoA carboxylase (ACC)/ACC의 단백질 발현 또한 증가함을 확인 하였다(Fig. 3). 특히 무막줄기세포추출물을 처리하지 않은 control군과 비교하여 2.
- 당뇨병은 인슐린 분비 또는 작용의 결함으로 인해 체내 혈당조절이 정상적으로 이루어지지 않아 만성적인 고혈당과 이에 수반되는 대사 장애가 지속되는 질환이다. 무막줄기세포추출물이 3T3-L1 지방세포에서 세포 내 포도당 흡수에 미치는 영향을 확인한 결과, 무막줄기세포추 출물을 처리했을 때 glucose uptake assay에서 2-DG6P 흡수가 증가하여 포도당 흡수 촉진 작용을 확인하였다. 또한 p-IRS-1 (ser 307)의 단백질 발현을 감소시키고, p-Akt, p-AMPK, p-ACC 및 GLUT4의 단백질 발현을 증가시켜 포도당 수송을 조절하는 것으로 생각된다.
- 분화가 유도된 3T3-L1 adipocyte에 무막줄기세포추출물을 처리한 후 인슐린 신호전달 관련 단백질인 insulin receptor substrate-1 (IRS-1), Akt의 단백질 발현을 측정한 결과, 무막줄기세포추출물 처리 농도가 증가함에 따라 p-IRS-1/IRS의 단백질 발현이 감소하고 p-Akt/Akt의 단백질 발현이 증가하였다(Fig. 2). 이어서 무막줄기세포추출 물을 처리한 3T3-L1 adipocyte에서 GLUT4 단백질 발현을 확인한 결과, control군과 비교하여 무막줄기세포추출물을 처리했을 때 GLUT4의 단백질 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
- 2). 이어서 무막줄기세포추출 물을 처리한 3T3-L1 adipocyte에서 GLUT4 단백질 발현을 확인한 결과, control군과 비교하여 무막줄기세포추출물을 처리했을 때 GLUT4의 단백질 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
- 배지를 제거하고 줄기세포를 일정량 수득하여 초음파 등의 물리적 방법을 사용하여 세포막을 벗기고, 필터 등의 방법을 이용하여 세포막 조각을 제거 하여 무막줄기세포추출물을 획득하였다. 최종제인 무막줄 기세포추출물은 Good Laboratory Practice 인정 기관인 ㈜ 켐온에서 물질에 대한 비임상 독성시험과 한국화학연구원 부설 안전성평가연구소에서 총 9회의 독성시험을 진행 하여 독성이 없는 안전한 물질임을 확인하였다. 수용액상태의 무막줄기세포추출물은 동결건조하여 파우더 제형으로 만든 후 5±2℃에서 보관하였다.
- 특히 무막줄기세포추출물을 처리하지 않은 control군과 비교하여 2.5 μg/mL의 농도에서 가장 높은 p-AMPK/AMPK 및 p-ACC/ACC 단백질 발현 증가를 나타내었다.
- 특히, 무막줄기세포추출물을 처리하지 않은 control군과 비교하여 2.5 μg/mL의 농도에서약 1.8배 높은 2-DG6P 흡수율을 나타내어 포도당 흡수가 증가함을 확인하였다(Fig. 1).
후속연구
- 이러한 결과들을 종합해 볼 때, 무막줄기세포추출물의 펩타이드와 단백질 성분이 염증반응을 억제하고 세포 대사 과정을 조절하는 것으로 여겨지며, 본 연구와 관련하여 당흡수를 개선시킬 수 있는 성분들에 관한 추가적인 연구가 필요한 것으로 생각된다. 또한, 무막줄기세포추출물은 기존 줄기세포의 1:1 환자 맞춤 제한 시술을 극복하고자 개발된 물질로 줄기세포 세포막에 붙어있는 면역원성을 제거하여 1:다수의 치료가 가능하고 산업화가 가능한 물질로써 기대된다.
- 또한 p-IRS-1 (ser 307)의 단백질 발현을 감소시키고, p-Akt, p-AMPK, p-ACC 및 GLUT4의 단백질 발현을 증가시켜 포도당 수송을 조절하는 것으로 생각된다. 이러한 결과들은 무막줄기세포추출물이 당뇨병 예방 및 치료를 위한 기능성 소재로 이용될 수 있음을 시사한다.
- 또한 9개의 단백질은 NF-κB signaling, toll-like receptor 4-dependent signaling 등을 조절하여 항염증 활성을 나타내며, SOD1, CD36 등을 포함하는 17개 단백질은 세포 해독작용에 관여하는 것으로 보고되었다(data not shown).이러한 결과들을 종합해 볼 때, 무막줄기세포추출물의 펩타이드와 단백질 성분이 염증반응을 억제하고 세포 대사 과정을 조절하는 것으로 여겨지며, 본 연구와 관련하여 당흡수를 개선시킬 수 있는 성분들에 관한 추가적인 연구가 필요한 것으로 생각된다. 또한, 무막줄기세포추출물은 기존 줄기세포의 1:1 환자 맞춤 제한 시술을 극복하고자 개발된 물질로 줄기세포 세포막에 붙어있는 면역원성을 제거하여 1:다수의 치료가 가능하고 산업화가 가능한 물질로써 기대된다.
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