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문제 정의
- 본 실험에서는 DPPH radical scavenging activity를 측정하여 항산화효능을 평가하였다. DPPH는 화학적으로 안정된 free radical을 가지고 있는 수용성 물질로 ascorbic acid, tocopherol, polyhydroxy 방향족 화합물 등에 의해 환원되어 짙은 자색이 탈색되는데, 다양한 천연 소재로부터 항산화 물질을 검색하는데 많이 이용되고 있다30).
제안 방법
- 0.05% 3,3'-diaminobenzidine과 0.01% HCl이 포함된 0.05 M tris-HCl 완충용액(pH 7.4)에서 발색시킨 후, hematoxylin으로 대조염색하였다.
- 우선 50~60℃ Bouin 용액에서 1시간 동안 매염 처리한 다음 70% 에탄올에서 picric acid를 제거하였다. Weigert iron hematoxylin에서 10분 동안 반응시켜 핵 염색하고, Biebrich scalet-acid fuchsin와 phosphomolybdic-phosphotungstic acid에서 각각 15분간, aniline blue에 5분간 처리한 후 관찰하였다. 식도내 점막(mucosa)내 염증성 변화는 비만세포의 분포 변화를 통해서 이루어졌다.
- vascular rinse와 10% 중성 포르말린용액(neutral buffered formalin : NBF)으로 심장관류고정을 실시하였다. 위 몸통(gastric body)과 하부 식도(esophagus)가 포함된 위식도연결부(gastroesophageal junction; GEJ)를 적출한 후 실온에서 24시간 동안 10% NBF에 고정하였다.
- 半夏, 生薑, 小半夏湯의 역류성 식도염 발병억제효과를 비교연구하기 위해 본 연구에서는 각 추출물의 DPPH 소거능을 측정하여 항산화효능을 평가하였으며, 14일간 각 약물의 추출물과 비교약물인 esomeprazole을 생쥐에 투여한 후 위 기저부와 유문부 결찰로 역류성 식도염을 유발시켜 점막의 표면점액세포 분포 및 점막손상정도, 비만세포와 염증세포의 분포변화를 관찰하고, 조직면역화학 실험으로는 항산화효소인 hemo oxygenase(HO)-1과 위 운동 및 분비 기능관련 호르몬인 ghrelin과 gastrin, 염증관련 신경전달물질인 substance P 등을 관찰하였다. 이상의 결과에서 半夏는 점막손상방지와 염증억제효과가, 生薑은 항산화작용 및 위 운동 증진효과가 우수하여 역류성 식도염에 대한 억제 효과가 있는 것으로 보이며, 小半夏湯은 두 약물의 장점을 가지며 독성을 완화시켜 효과적으로 쓰일 수 있을 것으로 생각된다.
- 生薑 추출물(11㎎/㎏), 半夏 추출물(73㎎/㎏), 小半夏湯 추출물(96㎎/㎏) 그리고 esomeprazole(40㎎/㎏)을 14일 동안 oral injection needle을 사용하여 1일 1회 경구투여 하였으며, 수술 1시간 전에 마지막 약물투여를 시행했다. Nakamura 등20)의 방법을 이용한 역류성 식도염을 유발하였는데, 24시간 전부터 절식시킨 실험쥐를 sodium pentobarbital로 마취시킨 후 복강을 열고 위의 위저부와 유문부를 실크실로 결찰시켰다.
- 生薑(Zingiber officinale), 半夏(Pinellia ternata), 小半夏湯(Sobanhatang) 100g을 증류수 500㎖에 넣고 2시간 동안 전탕한 후 여과하였다. 본 실험에 사용된 약제는 제일약업사(원주, 한국)에서 구입하였다.
- 면역조직화학의 결과는 image Pro Plus(Media cybernetics, USA)를 이용한 영상분석을 통해 수치화(means ± standard deviation) 했다. 각 군의 표본에서 임의로 선정된 점막을 x400배율에서 촬영한 다음 positive pixels/20,000,000 pixels로 영상분석하였다. 본 실험의 통계는 SPSS software(SPSS 24, SPSS Inc.
- 위 몸통(gastric body)과 하부 식도(esophagus)가 포함된 위식도연결부(gastroesophageal junction; GEJ)를 적출한 후 실온에서 24시간 동안 10% NBF에 고정하였다. 고정된 조직은 통상적인 방법으로 paraffin에 포매한 후 5㎛ 두께의 연속절편으로 제작되었다.
- 그런 다음 Weigert's iron hematoxylin과 methyl orange 용액에 각 각 1분, 5분 동안 대조염색한 후 관찰하였다.
- 위산에 의한 자가분해(autolysis) 방벽작용을 하는 중성점액질(neutral mucin)을 분비하는 표면점액세포의 몸통내 변화를 조사하기 위해서 periodic acid-schiff reaction(PAS) stain을 실시하였는데, 우선 periodic acid에서 5분간 반응시킨 후 Schiff reagent에서 15분 동안 처리하였다. 그런 다음 sulfurous rinse에서 각 2분씩 3회 세척한 후 Hematoxylin에서 1분 동안 대조염색하여 관찰하였다. 위식도연결부내 근육조직과 결합조직의 변화는 Masson trichrome 염색을 통해 조사되었다.
- 위 몸통 조직을 proteinase K(20㎍/㎖)에 5분 동안 proteolysis 과정을 거친 후 blocking serum인 10% normal goat serum에 4시간 동안 실온에서 반응시켰다. 그리고 1차 항체인 goat anti-HO-1(1:100, Santa Cruz Biotec, USA), goat anti-ghrelin(1:200, Santa Cruz Biotec), goat anti-gastrin(1:50, Santa Cruz Biotec) 그리고 goat anti-SP(1:200, Santa Cruz Biotec)에 4℃ humidified chamber에서 72시간 동안 반응시켰다. 그런 다음 2차 항체인 biotinylated rabbit anti-goat IgG(1:100,Santa Cruz Biotec)에 실온에서 24시간 동안 반응하였고, 그런 다음 avidin biotin complex kit(Vector Lab, USA)를 이용하여 1시간 동안 실온에서 반응시켰다.
- 동통과 염증 관련 신경전달물질인 substance P의 위 점막하층 내 생성 변화를 조사하기 위해 면역조직화학검사를 실시하였다. GE군에서는 높은 substance P 양성반응을 보였으며, 영상분석 결과 대조군에 비해 양성반응이 1027% 증가한 것으로 측정되었다.
- 조직화학에서는 표면점액세포의 변화와 위식도 연결부 내 근육조직과 결합조직의 변화를 관찰하고, 비만세포 분포변화를 통해 식도 점막의 염증성 변화를 관찰하였다. 또한 면역조직화학검사에서는 항산화 평가를 위해 hemo oxygenase(HO)-1을, 위 꿈틀운동의 평가를 위해 ghrelin을, 위산분비조절 평가를 위해 gastrin을, 그리고 염증유발조절 평가를 위해 substance P의 변화를 관찰하여 비교평가하였다.
- 면역조직화학의 결과는 image Pro Plus(Media cybernetics, USA)를 이용한 영상분석을 통해 수치화(means ± standard deviation) 했다.
- . 본 실험에서는 중성점액질을 분비하는 표면점액세포의 변화를 조사하기 위해 PAS stain을 실시하여 관찰하였고, 역류성식도염 유발군에서는 PAS 양성반응을 보이는 표면점액세포가 대조군에 비해 감소한데 반해 약물 투여군에서는 역류성식도염 유발군에 비해 높은 분포를 보였고, 半夏 투여군, 小半夏湯 투여군, 生薑 투여군 그리고 esomeprazole 투여군 순으로 관찰되었다. 半夏 투여군의 점액세포의 분포가 높게 관찰된 것은 항산화 성분으로 알려진 benzaldehyde34)와 관련이 있을 것으로 생각된다.
- 본 연구에서는 小半夏湯과 半夏, 生薑의 역류성 식도염 치료효과를 알아보기 위하여 약재들을 증류수에 전탕하여 얻은 추출물을 GC/MS을 이용하여 분석하고 항산화효능을 측정하였으며 14일간 小半夏湯, 生薑, 半夏 각각의 추출물과 비교약인 esomeprazole을 생쥐에 사전투여 후 위저부와 유문부 결찰로 역류성 식도염을 유발시키고 봉합 24시간 후 식도와 위부위를 절취하여 실험에 이용하였다. 조직화학에서는 표면점액세포의 변화와 위식도 연결부 내 근육조직과 결합조직의 변화를 관찰하고, 비만세포 분포변화를 통해 식도 점막의 염증성 변화를 관찰하였다.
- 을 적용하였다. 시료 용액(1.0~0.125㎎) 100㎕에 0.1mM 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 200 ㎕를 혼합하여 실온에서 30분간 반응시킨 후 micro-plate reader(Bio-Rad)를 사용하여 525㎚에서 흡광도 변화를 측정하였다. 시료처리군과 시료무처리군의 값을 비교하여 free radical 소거활성능을 계산하였으며, 7번 반복 시행하여 평균값을 구했다.
- 0㎖/min으로 흘려주었다. 시료 주입구의 온도, 연결부분의 온도, 이온 원의 온도는 각각 280℃, 230℃ 및 150℃로 맞추었다. 질량분석범위 50∼800m/z를 가지는 이온들을 순차적으로 반복 검출하는 방법(scan monitoring)을 사용하였다.
- 1mM 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 200 ㎕를 혼합하여 실온에서 30분간 반응시킨 후 micro-plate reader(Bio-Rad)를 사용하여 525㎚에서 흡광도 변화를 측정하였다. 시료처리군과 시료무처리군의 값을 비교하여 free radical 소거활성능을 계산하였으며, 7번 반복 시행하여 평균값을 구했다. 한편 양성대조군으로는 Ascorbic acid(Sigma, USA)를 사용하였다.
- 정상 대조군(Ctrl군), 역류성식도염 유발군(GE군), esomeprazole(한국아스트라제네카, 한국) 투여 후 역류성식도염 유발군(ET군), 生薑(Zingiber officinale) 추출물 투여 후 역류성식도염 유발군(ZT군), 半夏(Pinellia ternata) 추출물 투여 후 역류성식도염 유발군(PT군) 그리고 小半夏湯(Sobanhatang) 추출물 투여 후 역류성식도염 유발군(SBT군)으로 나누었으며, 각 군에 각 10마리씩 배정하였다. 실험기간 동안 고지방식이(fat, 60%; carbohydrate, 20%; protein, 20%; DIO DIET, USA)를 자유 섭식하게 하였다. 본 연구 과정은 동국대학교 동물실험윤리위원회(Institutional animal care and use committee; IACUC)의 승인을 받아 시행되었으며(IACUC number: 2015-005), 실험실 동물의 관리와 사용에 대해서는 NIH 가이드라인에 따라 시행되었다.
- 역류성 식도염을 유발시킨 동물실험모델의 조직화학에서는 위식도 점막 손상에 대한 보호효과를 평가하기 위해 표면점액세포와 목점액세포의 분포, 위식도 점막 손상 정도 및 점막 내 비만세포의 분포변화를 관찰하였다.
- 위 꿈틀운동에 관여하는 호르몬인 ghrelin의 위 점막내 생성 변화를 조사하기 위해 면역조직화학검사를 실시하였다. GE군에서는 낮은 ghrelin 양성반응을 보였으며, 영상분석 결과 대조군에 비해 양성반응이 18% 감소한 것으로 측정되었다.
- vascular rinse와 10% 중성 포르말린용액(neutral buffered formalin : NBF)으로 심장관류고정을 실시하였다. 위 몸통(gastric body)과 하부 식도(esophagus)가 포함된 위식도연결부(gastroesophageal junction; GEJ)를 적출한 후 실온에서 24시간 동안 10% NBF에 고정하였다. 고정된 조직은 통상적인 방법으로 paraffin에 포매한 후 5㎛ 두께의 연속절편으로 제작되었다.
- 위산 분비에 관여하는 호르몬인 gastrin의 위 점막 내 생성 변화를 조사하기 위해 면역조직화학검사를 실시하였다. GE군에서는 높은 gastrin 양성반응을 보였으며, 영상분석 결과 대조군에 비해 양성반응이 60% 증가한 것으로 측정되었다.
- 위산에 의한 자가분해(autolysis) 방벽작용을 하는 중성점액질(neutral mucin)을 분비하는 표면점액세포의 몸통내 변화를 조사하기 위해서 periodic acid-schiff reaction(PAS) stain을 실시하였는데, 우선 periodic acid에서 5분간 반응시킨 후 Schiff reagent에서 15분 동안 처리하였다. 그런 다음 sulfurous rinse에서 각 2분씩 3회 세척한 후 Hematoxylin에서 1분 동안 대조염색하여 관찰하였다.
- 위점막내 항산화 평가를 위해 hemo oxygenase(HO)-1을, 위꿈틀운동의 평가를 위해 ghrelin을, 위산 분비조절 평가를 위해 gastrin을, 그리고 동통유발 조절평가를 위해 substance P 등의 변화를 면역조직화학법을 통해 관찰하였다. 위 몸통 조직을 proteinase K(20㎍/㎖)에 5분 동안 proteolysis 과정을 거친 후 blocking serum인 10% normal goat serum에 4시간 동안 실온에서 반응시켰다.
- 이에 본 연구에서는 半夏, 生薑 단미제와 小半夏湯의 역류성 식도염에 대한 효과를 밝히고 비교하기 위해 추출물의 항산화효능을 측정하였고, 14일간 실험 약재와 비교약물인 esomeprazol을 사전투여한 생쥐에서 위저부와 유문부 결찰로 위산 역류를 유발시킨 위식도 연결부 조직절편을 제작하여 항산화효소인 hemo oxygenase(HO)-1과 위장관 펩티드 호르몬으로 위장의 운동과 분비 등에 관여하는 ghrelin과 gastrin, 동통과 염증 관련 신경전달물질인 substance P의 위 점막 내 생성변화와 표면점액세포 및 근육조직과 결합조직의 변화를 관찰하였으며, 비만세포의 분포 변화를 통해 식도 점막의 염증성 변화를 관찰하였다.
- 오리엔트(한국)에서 분양 받은 태령 7주된 Balb/C 수컷 생쥐를 무균사육장치내에서 2주일동안 적응시킨 후 체중 20 ± 2g의 생쥐를 선별하여 사용하였다. 정상 대조군(Ctrl군), 역류성식도염 유발군(GE군), esomeprazole(한국아스트라제네카, 한국) 투여 후 역류성식도염 유발군(ET군), 生薑(Zingiber officinale) 추출물 투여 후 역류성식도염 유발군(ZT군), 半夏(Pinellia ternata) 추출물 투여 후 역류성식도염 유발군(PT군) 그리고 小半夏湯(Sobanhatang) 추출물 투여 후 역류성식도염 유발군(SBT군)으로 나누었으며, 각 군에 각 10마리씩 배정하였다. 실험기간 동안 고지방식이(fat, 60%; carbohydrate, 20%; protein, 20%; DIO DIET, USA)를 자유 섭식하게 하였다.
- 본 연구에서는 小半夏湯과 半夏, 生薑의 역류성 식도염 치료효과를 알아보기 위하여 약재들을 증류수에 전탕하여 얻은 추출물을 GC/MS을 이용하여 분석하고 항산화효능을 측정하였으며 14일간 小半夏湯, 生薑, 半夏 각각의 추출물과 비교약인 esomeprazole을 생쥐에 사전투여 후 위저부와 유문부 결찰로 역류성 식도염을 유발시키고 봉합 24시간 후 식도와 위부위를 절취하여 실험에 이용하였다. 조직화학에서는 표면점액세포의 변화와 위식도 연결부 내 근육조직과 결합조직의 변화를 관찰하고, 비만세포 분포변화를 통해 식도 점막의 염증성 변화를 관찰하였다. 또한 면역조직화학검사에서는 항산화 평가를 위해 hemo oxygenase(HO)-1을, 위 꿈틀운동의 평가를 위해 ghrelin을, 위산분비조절 평가를 위해 gastrin을, 그리고 염증유발조절 평가를 위해 substance P의 변화를 관찰하여 비교평가하였다.
- 항산화효소인 hemo oxygenase(HO)-1의 위 점막 내 생성 변화를 조사하기 위해 면역조직화학검사를 실시하였다. GE군에서는 낮은 HO-1 양성반응을 보였으며, 영상분석 결과 대조군에 비해 양성반응이 62% 감소한 것으로 측정되었다.
대상 데이터
- 半夏, 生薑 그리고 小半夏湯의 생리활성 성분을 분석하기 위한 GC/MS로는 6890N GC/ 5975i MS(Agilent, USA)를 사용하였다. GC/MS 분석을 위한 컬럼은 DB-5MS UI(30m, 0.
- 生薑(Zingiber officinale), 半夏(Pinellia ternata), 小半夏湯(Sobanhatang) 100g을 증류수 500㎖에 넣고 2시간 동안 전탕한 후 여과하였다. 본 실험에 사용된 약제는 제일약업사(원주, 한국)에서 구입하였다. 小半夏湯의 조성은 ≪傷寒論譯詮≫18)에 근거하였으며 한 첩 분량은 Table 1과 같다.
- 오리엔트(한국)에서 분양 받은 태령 7주된 Balb/C 수컷 생쥐를 무균사육장치내에서 2주일동안 적응시킨 후 체중 20 ± 2g의 생쥐를 선별하여 사용하였다.
데이터처리
- 각 군의 표본에서 임의로 선정된 점막을 x400배율에서 촬영한 다음 positive pixels/20,000,000 pixels로 영상분석하였다. 본 실험의 통계는 SPSS software(SPSS 24, SPSS Inc., USA)를 이루어졌으며, Kruskal-Wallis test 시행을 통해 유의성(유의수준 0.05)을 검정하고 Bonferroni Correction Method로 사후 검정하였다.
이론/모형
- DPPH radical scavenging activity (%)을 측정하기 위해 변형된 Blois법19)을 적용하였다. 시료 용액(1.
- 비만세포의 관찰을 위해 Luna's method를 실시하였다.
- 오븐 온도는 처음 80℃에서 2분 동안 머물게 한 후 1분당 10℃씩 올려 300℃까지 올리고 5분 동안 유지하였다. 시료 2㎕를 분할(split) 주입법을 사용하여 주입하였으며, 유속은 1.0㎖/min으로 흘려주었다. 시료 주입구의 온도, 연결부분의 온도, 이온 원의 온도는 각각 280℃, 230℃ 및 150℃로 맞추었다.
- 질량분석범위 50∼800m/z를 가지는 이온들을 순차적으로 반복 검출하는 방법(scan monitoring)을 사용하였다.
성능/효과
- DPPH radical scavenging activity는 生薑 추출물에서 가장 높게 측정되었으며, 小半夏湯추출물, 半夏 추출물 순으로 나타났으며 0.125~1.0㎎에서 모두 농도 의존적으로 증가를 보였다. 半夏, 小半夏湯, 生薑의 추출물 모두 양성대조약물인 ascorbic acid에 비해 free radical 소거활성능이 낮은 것으로 측정되었다(Fig.
- DPPH radical scavenging activity실험에서는 모든 약물이 0.125, 0.25, 0.5, 1.0 ㎎/102)㎕에서 농도 의존적으로 증가하였다. 生薑, 小半夏湯, 半夏 추출물 순으로 높게 나타났는데 生薑은 모든 농도에서 半夏에비해 유의하게 높았다.
- 항산화효소인 hemo oxygenase(HO)-1의 위 점막 내 생성 변화를 조사하기 위해 면역조직화학검사를 실시하였다. GE군에서는 낮은 HO-1 양성반응을 보였으며, 영상분석 결과 대조군에 비해 양성반응이 62% 감소한 것으로 측정되었다. 약물 투여군에서는 GE군에 비해 높은 양성반응을 보였는데, ZT군(947%), SBT군(494%), PT군(218%)에서 유의성있게 증가되었다(Fig.
- 위 꿈틀운동에 관여하는 호르몬인 ghrelin의 위 점막내 생성 변화를 조사하기 위해 면역조직화학검사를 실시하였다. GE군에서는 낮은 ghrelin 양성반응을 보였으며, 영상분석 결과 대조군에 비해 양성반응이 18% 감소한 것으로 측정되었다. 약물 투여군에서는 GE군에 비해 높은 양성반응을 보였는데, ZT군(332%), ET군(313%), SBT군(263%)에서 유의성있는 증가를보였다(Fig.
- 위산 분비에 관여하는 호르몬인 gastrin의 위 점막 내 생성 변화를 조사하기 위해 면역조직화학검사를 실시하였다. GE군에서는 높은 gastrin 양성반응을 보였으며, 영상분석 결과 대조군에 비해 양성반응이 60% 증가한 것으로 측정되었다. 약물 투여군에서는 GE군에 비해 낮은 양성반응을 보였는데, PT군(41%), SBT군(32%)에서 유의하게 감소되었다(Fig.
- 동통과 염증 관련 신경전달물질인 substance P의 위 점막하층 내 생성 변화를 조사하기 위해 면역조직화학검사를 실시하였다. GE군에서는 높은 substance P 양성반응을 보였으며, 영상분석 결과 대조군에 비해 양성반응이 1027% 증가한 것으로 측정되었다. 약물 투여군에서는 GE군에 비해 낮은 양성반응을 보였는데, PT군(79%), SBT군(60%)에서 유의하게 감소하였다(Fig.
- GE군의 위식도 접합부에서 하부식도괄약근의 일부가 유실되었고, 식도 점막의 첨단부(apical surface)에서 식도 각질과 점막세포사이 이음 손상에 따른 세포사이 간극이 확인되었다. 약물 투여군에서는 이러한 손상이 적었다(Fig.
- GE군의 위식도 접합부와 하부식도 내 점막고유층에서는 비만세포의 분포 증가와 염증관여세포의 이주 증가가 관찰된 반면 약물 투여군에서는 GE군에 비해 낮은 분포를 보였는데, ZT군, SBT군, PT군 그리고 ET군 순으로 관찰되었다(Fig. 9-b).
- 小半夏湯과 半夏 투여군은 대조군과는 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다. HO-1 측정에서도 역시 生薑 추출물이 다른 실험군에 비해 우수한 항산화효과가 있음을 보였다.
- 이러한 손상으로부터의 보호를 위해 세포방어체계가 유도되는데, 항산화효소인 HO-1은 이것의 기질인 heme과 그 외에 자외선, 저산소증, 염증, 과산화수소화 산화질소 등의 다양한 자극들에 의해 유도되며, heme을 일산화탄소(carbonmonoxide; CO), biliverdin과 free heme iron으로 산화적으로 분해시키는데 이 생성물들은 산화적 스트레스로 인한 손상에 대한 방어작용과 함께 항염증 효과가 있어 조직 손상과 관련된 다양한 질병들에 대해 보호작용을 갖는다42-44). HO-1의 생성변화 조사에서는 역류성식도염 유발군 대비 生薑 투여군에서 947%, 小半夏湯 투여군 494%, 半夏 투여군 218%의 높은 양성반응으로 esomeprazole 투여군의 189%에 비해 많은 증가를 보였고 특히 生薑 추출물 투여군의 반응이 현저하게 높게 나타났다. esomeprazled 투여군을 제외한 실험 약물 투여군에서는 모두 역류성식도염유발군에 비해 유의하게 증가하였고 그 중 生薑 투여군은 다른 모든 실험군에 비해 유의하게 높았으며,小半夏湯 투여군은 esomeprazole 투여군에 비해 유의하게 높았고 半夏 투여군은 esomeprazole 투여군과 유의한 차이를 보이지 않았다.
- 또한 substance P를 흰 쥐에 정맥 주사하는 실험에서 위산 분비를 촉진시킨다는 보고가 있다56). Substance P 양성반응 측정에서 모든 실험군은 대조군보다 유의하게 높은 양성반응이 나타났으며, 역류성식도염 유발군에서 가장 높은 양성반응을 보였는데, 대조군에 비해 1027% 증가한 것으로 측정되었다. 모든 실험약물 투여군에서 역류성식도염 유발군에 비해 낮은 양성반응으로, 半夏 투여군 79%, 小半夏湯 투여군 60%, 生薑 투여군 32%, esomeprazole 투여군 28%순으로 감소되었다.
- HO-1의 생성변화 조사에서는 역류성식도염 유발군 대비 生薑 투여군에서 947%, 小半夏湯 투여군 494%, 半夏 투여군 218%의 높은 양성반응으로 esomeprazole 투여군의 189%에 비해 많은 증가를 보였고 특히 生薑 추출물 투여군의 반응이 현저하게 높게 나타났다. esomeprazled 투여군을 제외한 실험 약물 투여군에서는 모두 역류성식도염유발군에 비해 유의하게 증가하였고 그 중 生薑 투여군은 다른 모든 실험군에 비해 유의하게 높았으며,小半夏湯 투여군은 esomeprazole 투여군에 비해 유의하게 높았고 半夏 투여군은 esomeprazole 투여군과 유의한 차이를 보이지 않았다. 小半夏湯과 半夏 투여군은 대조군과는 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다.
- 모든 실험약물 투여군에서 역류성식도염 유발군에 비해 낮은 양성반응으로, 半夏 투여군 79%, 小半夏湯 투여군 60%, 生薑 투여군 32%, esomeprazole 투여군 28%순으로 감소되었다. 半夏 투여군과 小半夏湯 투여군에서는 대조군과 유의한 차이가 없으며 半夏 투여군은 역류성식도염 유발군과 esomeprazole 투여군에 비해 유의하게 낮게 나타났고, 小半夏湯 투여군은 esomeprazole 투여군과 유의한 차이가 나타나지 않았으나 역류성 식도염 유발군에 비해서는 유의하게 낮은 양성반응이 나타났다. 生薑 투여군에서는 대조군에 비해 유의하게 높은 양성반응이 나타났으며 다른 약물 투여군 및 역류성식도염 유발군과는 유의한 차이가 나지 않았다.
- 0㎎에서 모두 농도 의존적으로 증가를 보였다. 半夏, 小半夏湯, 生薑의 추출물 모두 양성대조약물인 ascorbic acid에 비해 free radical 소거활성능이 낮은 것으로 측정되었다(Fig. 3, Table 5).
- 半夏의 GC/MS 분석 결과 정유성분인 epoxyethane이 다수를 차지하였고, 항산화효능이 있는 benzaldehyde도 검출되었다(Fig. 2-b, Table 3).
- 小半夏湯의 GC/MS 분석 결과 zingerone이 다수를 차지하였고, benzaldehyde, cyclopentasiloxane 그리고 isobutylamin이 검출되었다(Fig. 2-c, Table 4).
- 점막 내 ghrelin 생성변화에서는 GE군에 비하여 ZT군 332%, ET군 313%, SBT군 263%, PT군 185%순으로 生薑 투여군에서 가장 많은 증가율을 보였다. 生薑 투여군에서 esomeprazole을 제외한 모든 실험군에 비해 유의하게 높은 수치를 나타내었고, 小半夏湯 투여군은 역류성식도염 유발군에 비해서는 높았으나 半夏와 esomeprazole 투여군에 비해서는 유의한 차이를 보이지 않았으며, 半夏 투여군에서는 生薑에 비해 유의하게 낮았고 나머지 실험군들과는 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다. 위 꿈틀운동은 하부식도괄약근의 압력과 식도 청소율 및 위 배출기능과 관련하여 위식도 역류질환치료에 있어 중요한 부분으로, 위 운동을 증진시키고 항염증작용과 점막보호작용이 있다고 알려진 ghrelin의 증가로 치료효과를 나타낼 수 있을 것으로 생각된다.
- 본 실험에서 역류성식도염 유발군에서 가장 높은 gastrin 양성 반응을 보였고 이는 유문부 결찰로 인한 위 팽창에 따른 G세포 자극으로 분비가 촉진된 것으로 보이며54), 실험약물 투여군에서는 모두 이에 비해 낮은 양성반응이었는데, 역류성식도염 유발군에 비해서 半夏투여군에서 41%, 小半夏湯 투여군에서 32%, 生薑 투여군에서 19%, esomeprazole 투여군에서 10%가 낮게 측정되었다. 生薑 투여군에서는 정상대조군을 제외한다른 투여군과 유의한 차이를 보이지 않았고, 小半夏湯 투여군에서는 역류성식도염 유발군에 비해서는 유의하게 낮게 나타났고 半夏 투여군에서는 역류성식도염 유발군 및 esomeprazole 투여군보다 유의하게 낮은 양성반응을 나타내었다. 생쥐에 生薑 추출물을 투여 후 위염을 유발시킨 실험에서 투여 용량의 증가에 따라 유의적으로 높은 위 손상 억제와 위액분비감소 및 유리산도의 감소를 보였다는 이전의 보고에 비추어볼 때33), 모든 실험 약물군에서 역류성식도염 유발 군보다 낮은 수치를 보인 것은 위 손상에 대한 보호 작용으로 G세포 자극을 완화시켜 gastrin 수치가 비교적 낮게 나타난 것으로 보이며, 그 중 半夏 추출물이 가장 효과적으로 나타났다.
- 0 ㎎/102)㎕에서 농도 의존적으로 증가하였다. 生薑, 小半夏湯, 半夏 추출물 순으로 높게 나타났는데 生薑은 모든 농도에서 半夏에비해 유의하게 높았다. 세 약물들 중 生薑의 DPPH소거능이 가장 높게 나타나 우수한 항산화효능을 보였는데, DPPH에 대한 라디칼 소거활성은 페놀성 화합물에 의해 기인된다고 하여30), 生薑 추출물의 gingerol류나 shogaol류 같은 페놀성 화합물이 DPPH소거능에 밀접하게 관여했을 것으로 보이며 이에 대한 연구보고가 있다31).
- Substance P 양성반응 측정에서 모든 실험군은 대조군보다 유의하게 높은 양성반응이 나타났으며, 역류성식도염 유발군에서 가장 높은 양성반응을 보였는데, 대조군에 비해 1027% 증가한 것으로 측정되었다. 모든 실험약물 투여군에서 역류성식도염 유발군에 비해 낮은 양성반응으로, 半夏 투여군 79%, 小半夏湯 투여군 60%, 生薑 투여군 32%, esomeprazole 투여군 28%순으로 감소되었다. 半夏 투여군과 小半夏湯 투여군에서는 대조군과 유의한 차이가 없으며 半夏 투여군은 역류성식도염 유발군과 esomeprazole 투여군에 비해 유의하게 낮게 나타났고, 小半夏湯 투여군은 esomeprazole 투여군과 유의한 차이가 나타나지 않았으나 역류성 식도염 유발군에 비해서는 유의하게 낮은 양성반응이 나타났다.
- gastrin 분비를 항진시키는 가장 중요한 인자는 주로티로신이나 페닐알라닌 같은 아미노산이며 미주신경 자극으로 유리되는 acetylcholine이나 위벽의 신전도 gastrin 촉진 인자로 작용하며, 유문부의 산과 이로 인해 형성된 아민들에 의한 음성되먹임기전이나 secretin 등은 gastrin 분비를 억제한다3). 본 실험에서 역류성식도염 유발군에서 가장 높은 gastrin 양성 반응을 보였고 이는 유문부 결찰로 인한 위 팽창에 따른 G세포 자극으로 분비가 촉진된 것으로 보이며54), 실험약물 투여군에서는 모두 이에 비해 낮은 양성반응이었는데, 역류성식도염 유발군에 비해서 半夏투여군에서 41%, 小半夏湯 투여군에서 32%, 生薑 투여군에서 19%, esomeprazole 투여군에서 10%가 낮게 측정되었다. 生薑 투여군에서는 정상대조군을 제외한다른 투여군과 유의한 차이를 보이지 않았고, 小半夏湯 투여군에서는 역류성식도염 유발군에 비해서는 유의하게 낮게 나타났고 半夏 투여군에서는 역류성식도염 유발군 및 esomeprazole 투여군보다 유의하게 낮은 양성반응을 나타내었다.
- 최근 PPI 치료로 세포사이 간극이 먼저 호전되면서 점막 손상이 회복되었고 가슴쓰림 등의 증상이 호전되었다는 보고가 있다36). 본 실험에서는 역류성식도염 유발군의 위식도연결부에서 하부식도괄약근 일부가 유실되었고, 식도 점막의 첨단부에서 식도각질과 점막세포사이 이음손상에 따른 세포사이 간극이 확인되었으나, 약물 투여군에서는 이러한 손상이 적게나타나 점막손상에 대한 보호효과가 있음을 보였다.
- 이상의 결과로 半夏, 生薑, 小半夏湯추출물은 위저부 및 유문부 결찰로 유발된 생쥐의 역류성 식도염에 억제효과를 나타내는 것으로 관찰되었으며, 세 가지 실험약물이 비교약물인 esomeprazole 투여군에 비해 항산화효과와 염증억제, 점막손상방지 면에서 우수한 효과를 보였다. 실험 약물들은 위산분비의 조절과 주로 항산화효과 및 항염증작용으로 방어체계를 강화시키는 역할을 통해 역류성 식도염에 효과를 나타내는 것으로 보인다. 항산화효과와 위 운동증진, 비만세포 및 염증세포의 분포에서는 生薑 추출물이, 표면점액세포 분포와 substance P 수치에서는 半夏 추출물의 치료효과가 우수한 것으로 나타났다.
- 生薑 투여군에서는 대조군에 비해 유의하게 높은 양성반응이 나타났으며 다른 약물 투여군 및 역류성식도염 유발군과는 유의한 차이가 나지 않았다. 약물 투여군에서 낮은 양성반응이 나타난 것은 역류성식도염 유발군에 비해 염증반응이 적게 일어나 점막 손상의 억제효과가 있는 것으로 보이며 半夏 추출물의 효과가 우수한 것으로 나타났다.
- GE군에서는 높은 gastrin 양성반응을 보였으며, 영상분석 결과 대조군에 비해 양성반응이 60% 증가한 것으로 측정되었다. 약물 투여군에서는 GE군에 비해 낮은 양성반응을 보였는데, PT군(41%), SBT군(32%)에서 유의하게 감소되었다(Fig. 6, Table 8).
- GE군에서는 높은 substance P 양성반응을 보였으며, 영상분석 결과 대조군에 비해 양성반응이 1027% 증가한 것으로 측정되었다. 약물 투여군에서는 GE군에 비해 낮은 양성반응을 보였는데, PT군(79%), SBT군(60%)에서 유의하게 감소하였다(Fig. 7, Table 9).
- GE군에서는 낮은 ghrelin 양성반응을 보였으며, 영상분석 결과 대조군에 비해 양성반응이 18% 감소한 것으로 측정되었다. 약물 투여군에서는 GE군에 비해 높은 양성반응을 보였는데, ZT군(332%), ET군(313%), SBT군(263%)에서 유의성있는 증가를보였다(Fig. 5, Table 7).
- GE군에서는 낮은 HO-1 양성반응을 보였으며, 영상분석 결과 대조군에 비해 양성반응이 62% 감소한 것으로 측정되었다. 약물 투여군에서는 GE군에 비해 높은 양성반응을 보였는데, ZT군(947%), SBT군(494%), PT군(218%)에서 유의성있게 증가되었다(Fig. 4, Table 6).
- . 역류성식도염 유발군은 비만세포의 분포 증가와 염증세포의 증가가 관찰된 반면 치료 약물 투여군에서는 역류성식도염 유발군에 비해 낮은 분포를 보였고, 生薑 투여군, 小半夏湯투여군, 半夏 투여군, esomeprazole 투여군 순으로 염증반응이 적었음을 보였다.
- 이상의 결과로 半夏, 生薑, 小半夏湯추출물은 위저부 및 유문부 결찰로 유발된 생쥐의 역류성 식도염에 억제효과를 나타내는 것으로 관찰되었으며, 세 가지 실험약물이 비교약물인 esomeprazole 투여군에 비해 항산화효과와 염증억제, 점막손상방지 면에서 우수한 효과를 보였다. 실험 약물들은 위산분비의 조절과 주로 항산화효과 및 항염증작용으로 방어체계를 강화시키는 역할을 통해 역류성 식도염에 효과를 나타내는 것으로 보인다.
- 半夏, 生薑, 小半夏湯의 역류성 식도염 발병억제효과를 비교연구하기 위해 본 연구에서는 각 추출물의 DPPH 소거능을 측정하여 항산화효능을 평가하였으며, 14일간 각 약물의 추출물과 비교약물인 esomeprazole을 생쥐에 투여한 후 위 기저부와 유문부 결찰로 역류성 식도염을 유발시켜 점막의 표면점액세포 분포 및 점막손상정도, 비만세포와 염증세포의 분포변화를 관찰하고, 조직면역화학 실험으로는 항산화효소인 hemo oxygenase(HO)-1과 위 운동 및 분비 기능관련 호르몬인 ghrelin과 gastrin, 염증관련 신경전달물질인 substance P 등을 관찰하였다. 이상의 결과에서 半夏는 점막손상방지와 염증억제효과가, 生薑은 항산화작용 및 위 운동 증진효과가 우수하여 역류성 식도염에 대한 억제 효과가 있는 것으로 보이며, 小半夏湯은 두 약물의 장점을 가지며 독성을 완화시켜 효과적으로 쓰일 수 있을 것으로 생각된다.
- 한편 ghrelin이 위산분비를 촉진한다고 알려져 있으나, PPI를 장기간 투여하였을때 혈청 ghrelin의 농도가 증가하지 않았고 혈청 gastrin과의 상관관계가 없으며 ghrelin은 전혀 다른 경로를 통하여 위산분비에 영향을 주고 있음을 시사한 보고가 있다52). 점막 내 ghrelin 생성변화에서는 GE군에 비하여 ZT군 332%, ET군 313%, SBT군 263%, PT군 185%순으로 生薑 투여군에서 가장 많은 증가율을 보였다. 生薑 투여군에서 esomeprazole을 제외한 모든 실험군에 비해 유의하게 높은 수치를 나타내었고, 小半夏湯 투여군은 역류성식도염 유발군에 비해서는 높았으나 半夏와 esomeprazole 투여군에 비해서는 유의한 차이를 보이지 않았으며, 半夏 투여군에서는 生薑에 비해 유의하게 낮았고 나머지 실험군들과는 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다.
- 실험 약물들은 위산분비의 조절과 주로 항산화효과 및 항염증작용으로 방어체계를 강화시키는 역할을 통해 역류성 식도염에 효과를 나타내는 것으로 보인다. 항산화효과와 위 운동증진, 비만세포 및 염증세포의 분포에서는 生薑 추출물이, 표면점액세포 분포와 substance P 수치에서는 半夏 추출물의 치료효과가 우수한 것으로 나타났다. 生薑, 半夏, 小半夏湯 추출물들의 비교에서 生薑과 半夏 추출물이 각기 다른 부분에서 더 효과를 나타내었고 小半夏湯은 그 사이의 값으로 측정되었는데, 한편으로는 小半夏湯이 두 가지 약재의 장점을 취하면서 生薑이 半夏의 독성을 완화시킨다고 알려져 있어 더 안전하며 효율적으로 쓰일 수 있을 것으로 기대되며, 生薑과 半夏를 배합함으로 생기는 성분의 변화와 그것이 작용하는 기전에 대해서는 더 많은 연구가 필요할 것이다.
후속연구
- 항산화효과와 위 운동증진, 비만세포 및 염증세포의 분포에서는 生薑 추출물이, 표면점액세포 분포와 substance P 수치에서는 半夏 추출물의 치료효과가 우수한 것으로 나타났다. 生薑, 半夏, 小半夏湯 추출물들의 비교에서 生薑과 半夏 추출물이 각기 다른 부분에서 더 효과를 나타내었고 小半夏湯은 그 사이의 값으로 측정되었는데, 한편으로는 小半夏湯이 두 가지 약재의 장점을 취하면서 生薑이 半夏의 독성을 완화시킨다고 알려져 있어 더 안전하며 효율적으로 쓰일 수 있을 것으로 기대되며, 生薑과 半夏를 배합함으로 생기는 성분의 변화와 그것이 작용하는 기전에 대해서는 더 많은 연구가 필요할 것이다. 본 실험에서는 사람에 대한 투여용량으로 환산하여 단일용량으로 실험을 하였으나 향후 약물들의 투여용량과 투여기간의 변동에 따른 효과 및 위산분비조절에 대한 추가적인 연구와 실제 환자의 임상례를 통한 다방면의 연구가 이루어져야 할 것으로 보인다.
- 生薑, 半夏, 小半夏湯 추출물들의 비교에서 生薑과 半夏 추출물이 각기 다른 부분에서 더 효과를 나타내었고 小半夏湯은 그 사이의 값으로 측정되었는데, 한편으로는 小半夏湯이 두 가지 약재의 장점을 취하면서 生薑이 半夏의 독성을 완화시킨다고 알려져 있어 더 안전하며 효율적으로 쓰일 수 있을 것으로 기대되며, 生薑과 半夏를 배합함으로 생기는 성분의 변화와 그것이 작용하는 기전에 대해서는 더 많은 연구가 필요할 것이다. 본 실험에서는 사람에 대한 투여용량으로 환산하여 단일용량으로 실험을 하였으나 향후 약물들의 투여용량과 투여기간의 변동에 따른 효과 및 위산분비조절에 대한 추가적인 연구와 실제 환자의 임상례를 통한 다방면의 연구가 이루어져야 할 것으로 보인다.
- 위 꿈틀운동은 하부식도괄약근의 압력과 식도 청소율 및 위 배출기능과 관련하여 위식도 역류질환치료에 있어 중요한 부분으로, 위 운동을 증진시키고 항염증작용과 점막보호작용이 있다고 알려진 ghrelin의 증가로 치료효과를 나타낼 수 있을 것으로 생각된다. 향후 ghrelin이 위 기능에 작용하는 기전에 대한 폭넓고 다양한 연구가 필요할 것으로 보인다.
- 생쥐에 生薑 추출물을 투여 후 위염을 유발시킨 실험에서 투여 용량의 증가에 따라 유의적으로 높은 위 손상 억제와 위액분비감소 및 유리산도의 감소를 보였다는 이전의 보고에 비추어볼 때33), 모든 실험 약물군에서 역류성식도염 유발 군보다 낮은 수치를 보인 것은 위 손상에 대한 보호 작용으로 G세포 자극을 완화시켜 gastrin 수치가 비교적 낮게 나타난 것으로 보이며, 그 중 半夏 추출물이 가장 효과적으로 나타났다. 향후 이 약물들의 투여기간과 용량에 따른 위산과 gastrin의 변화에 대한 연구가 다양하게 이루어져야 할 것으로 보인다.
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