[국내논문]황기, 지치 복합물의 연골세포에서의 Matrix Metalloproteinases 저해 효과 및 유효성분의 분석 Inhibitory Effect of Mixed Extracts Obtained from Astragali Radix and Lithospermi Radix on Matrix Metalloproteinases in IL-1β-induced SW1353 Cells and Quantitative Analysis of Active Compounds원문보기
Background: Astragali radix (A) and Lithospermi radix (L) have long been used as traditional medicines due to their known anti-inflammatory effects. This study aimed at evaluating, their optimal mixing ratio and their functional compounds by investigating the inhibitory effects of mixed extracts of ...
Background: Astragali radix (A) and Lithospermi radix (L) have long been used as traditional medicines due to their known anti-inflammatory effects. This study aimed at evaluating, their optimal mixing ratio and their functional compounds by investigating the inhibitory effects of mixed extracts of A and L and their active compounds on matrix metalloproteinases (MMPs). Methods and Results: A and L extracts were obtained by extraction at $80^{\circ}C$ using 50% and 70% fermented alcohol, respectively, and then mixed at a ratio of 5 : 5, 6 : 4, 7 : 3 and 8 : 2 (w/w). The activities of MMP-1, MMP-3, and MMP-13 were evaluated in interleukin-1beta ($IL-1{\beta}$)-induced SW1353 cells. The extract mixtures showed synergistic inhibitory effects on MMP-3 and MMP-13, higher than the effects of the individual A and L extracts. The 7 : 3 mixture (ALM16) showed the most effective MMPs inhibitory activity, while among the active ingredients, calycosin-7-O-${\beta}$-D-glucoside and lithospermic acid exhibited excellent MMPs inhibitory activity. Additionally, an HPLC method was established for simultaneous quantification of the effective components of the extract mixtures, and validated by measuring the linearity, precision and accuracy of the limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ). Conclusions: ALM16 showed the most effective MMPs inhibitory activity. Calycosin-O-${\beta}$-D-glucoside, calycosin and lithospermic acid were identified as useful candidates, as they were the major functional compounds in the MMP inhibitory activity. Summarily, ALM16 might be a highly effective in osteoarthritis management, owing to its because it exhibits a protective effect on cartilage via excellent inhibition of MMPs.
Background: Astragali radix (A) and Lithospermi radix (L) have long been used as traditional medicines due to their known anti-inflammatory effects. This study aimed at evaluating, their optimal mixing ratio and their functional compounds by investigating the inhibitory effects of mixed extracts of A and L and their active compounds on matrix metalloproteinases (MMPs). Methods and Results: A and L extracts were obtained by extraction at $80^{\circ}C$ using 50% and 70% fermented alcohol, respectively, and then mixed at a ratio of 5 : 5, 6 : 4, 7 : 3 and 8 : 2 (w/w). The activities of MMP-1, MMP-3, and MMP-13 were evaluated in interleukin-1beta ($IL-1{\beta}$)-induced SW1353 cells. The extract mixtures showed synergistic inhibitory effects on MMP-3 and MMP-13, higher than the effects of the individual A and L extracts. The 7 : 3 mixture (ALM16) showed the most effective MMPs inhibitory activity, while among the active ingredients, calycosin-7-O-${\beta}$-D-glucoside and lithospermic acid exhibited excellent MMPs inhibitory activity. Additionally, an HPLC method was established for simultaneous quantification of the effective components of the extract mixtures, and validated by measuring the linearity, precision and accuracy of the limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ). Conclusions: ALM16 showed the most effective MMPs inhibitory activity. Calycosin-O-${\beta}$-D-glucoside, calycosin and lithospermic acid were identified as useful candidates, as they were the major functional compounds in the MMP inhibitory activity. Summarily, ALM16 might be a highly effective in osteoarthritis management, owing to its because it exhibits a protective effect on cartilage via excellent inhibition of MMPs.
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문제 정의
하지만, 현재까지 황기 또는 지치 단일 추출물 및 단일 성분의 골관절염에 대한 효과 연구는 진행되었지만, 황기 및 지치 추출물을 혼합한 복합물의 골관절염에 대한 효과에 대해서는 아직 알려진 것이 없다. 따라서 본 연구에서는 선행연구 결과를 바탕으로 황기 및 지치 추출물을 혼합하였을 때 골관절염에 대한 시너지 효과 (synergistic effects)를 나타낼 수 있는지를 알아보고자 하였으며, SW1353 사람 연골세포주를 이용하여 MMPs 저해 효과를 평가함으로써 최적의 황기, 지치 혼합비를 도출하고자 하였다.
제안 방법
황기 (Astragali Radix; Astragalus membranaceus Bunge) 및 지치 유효성분의 분석을 위해 YMC (Kyoto, Japan)의 YMC ODS-AM (4.6 × 250 ㎜, 5 ㎛) 컬럼과 Waters e2695 series HPLC system (Waters Co., Milford, MA, USA)을사용하였다.
황기 및 지치 건재 시료를 추말로 직경 0.5 ㎝ 이하의 크기로 조분쇄한 후, 황기 및 지치 분쇄 시료는 유효성분 함량 및수율 등 선행연구를 바탕으로 각각 50% 주정과 70% 주정을 이용하여 시료 중량의 15 배 용량에서 80℃, 4 시간, 총 2 회 환류추출 하였다.
황기, 지치 추출물및 혼합 비율별 복합물은 50 - 400 ㎍/㎖, 단일 성분은 표준품을 이용하여 5 - 80 μM 농도로 각각 세포에 처리한 후, 24 시간 배양하였다.
이때 황기 추출물, 지치 추출물의 brix는 각각 50 ± 1 brix, 66 ± 1 brix 이었다. 황기 및 지치 추출물은 80 - 90℃에서 1 시간 살균한 후 건조하여 각각 황기 추출물 분말 (A extract powder, yield 24%)과 지치 추출물 분말 (L extract powder, yield 42%)을 얻었다 (Fig. 1). 기능성 식품으로서의 산업적 활용성을 고려할 때 단가와 원료수 급면에서 훨씬 유리한 작물인 황기의 비율이 높은 혼합물을 연구대상으로 하고, A extract powder와 L extract powder의 최적 혼합비를 설정하기 위해 대표적으로 5 : 5, 6 : 4, 7 : 3, 8 : 2의 4 종의 중량비 (w/w)로 혼합한 복합물을 MMPs 저해능 평가 시료로 사용하였다.
1). 기능성 식품으로서의 산업적 활용성을 고려할 때 단가와 원료수 급면에서 훨씬 유리한 작물인 황기의 비율이 높은 혼합물을 연구대상으로 하고, A extract powder와 L extract powder의 최적 혼합비를 설정하기 위해 대표적으로 5 : 5, 6 : 4, 7 : 3, 8 : 2의 4 종의 중량비 (w/w)로 혼합한 복합물을 MMPs 저해능 평가 시료로 사용하였다.
SW1353세포에 대한 각 시료의 세포 독성 (cytotoxicity)을 조사하기 위해 각 농도의 시료를 세포에 처리한 후 MTT assay를 실시하였다. SW1353 (8 × 106 cells/well) 세포를 96 well plate에 분주하여 24시간 배양하였다.
세포독성 평가에 사용한 각 시료를 농도별로 30 분간 전처리한 후, IL-1β를 20 ng/㎖ 로 처리 하고 24 시간 동안 반응시켰다.
표준정량곡선 작성을 위해 표준물질 calycosin, calycosin-7-O-β-D-glucoside 및 lithospermic acid를 methanol에 녹여 표준용액을 제조하였다.
HPLC 분석은 YMC의 ODS-AM (4.6 × 250 ㎜, 5 ㎛) 컬럼을 사용하여 30℃에서 실시하였다.
MMP 활성 측정은 형광 ELISA 키트 (SensoLyte® 520 MMPs assay kit, AnaSpec Inc., Fremont, CA, USA)를 이용하여 정량 분석하였다.
, Fremont, CA, USA)를 이용하여 정량 분석하였다. 형광 ELISA 정량 분석은 세포 배양액에 MMP-1 (71150, AnaSpec Inc., Fremont, CA, USA), MMP-3 (71152, AnaSpec Inc., Fremont, CA, USA)와 MMP-13 (71156, AnaSpec Inc., Fremont, CA, USA) 기질을 처리하여 30 분간 효소반응 후, excitation/emission 490/520 ㎚ 에서 측정하였다.
표준정량곡선 작성을 위해 표준물질 calycosin, calycosin-7-O-β-D-glucoside 및 lithospermic acid를 methanol에 녹여 표준용액을 제조하였다. 분석법을 검증하기 위해 직선성 (linearity), 검출한계 (limit of detection, LOD) 및 정량한계 (limit of quantitaion, LOQ)를 분석하였다. 각 성분에 대한 LOD, LOQ는 표준정량곡선을 작성한 후, 시그널 (S) 대비노이즈 (N) 값인 S/N 값이 각각 3, 10 일 때의 농도로서 구하였다.
분석법을 검증하기 위해 직선성 (linearity), 검출한계 (limit of detection, LOD) 및 정량한계 (limit of quantitaion, LOQ)를 분석하였다. 각 성분에 대한 LOD, LOQ는 표준정량곡선을 작성한 후, 시그널 (S) 대비노이즈 (N) 값인 S/N 값이 각각 3, 10 일 때의 농도로서 구하였다. 또한 각 성분에 대하여 3 종의 농도 조건을 5 일동안 반복 분석하여 inter-day precision을 평가하고, 연속으로 5 회 분석하여 intra-day precision를 평가하여 정밀도 (precision) 및 정확도 (accuracy)를 측정하고 분석법의 재현성 (reproducibility)을 검증하였다.
각 성분에 대한 LOD, LOQ는 표준정량곡선을 작성한 후, 시그널 (S) 대비노이즈 (N) 값인 S/N 값이 각각 3, 10 일 때의 농도로서 구하였다. 또한 각 성분에 대하여 3 종의 농도 조건을 5 일동안 반복 분석하여 inter-day precision을 평가하고, 연속으로 5 회 분석하여 intra-day precision를 평가하여 정밀도 (precision) 및 정확도 (accuracy)를 측정하고 분석법의 재현성 (reproducibility)을 검증하였다.
SW1353 세포에 대한 세포독성을 평가하기 위해, SW1353 세포에 황기 (Astragali Radix; Astragalus membranaceus Bunge), 지치 추출물 및 혼합 비율별 복합물을 농도별로 처리한 후, 세포 생존율 (cell viability)을 측정하였다. 모든 시료 처리군에서 아무것도 처리하지 않은 정상군 (Con)과 비교하여 최고 농도 400 ㎍/㎖ 수준까지 세포 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다 (Fig.
각각의 황기 또는 지치 추출물과 혼합 비율별 복합물 처리가 연골세포주에서 IL-1β에 의해 유도된 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13의 생성량 증가에 대한 억제 효과를 나타내는지 평가하였다.
2). 이후 효능검정 시료의 세포 처리농도는 보다 안전한 100과 200 ㎍/㎖ 수준에서 MMPs 억제 효과를 검정하였다.
황기는 주요 flavonoid 성분인 calycosin 및 calycosin-7-O-β-D-glucoside를 선정하여 활성을 평가하였다.
황기 복합물의 MMPs 생성 억제 효과에 대한 유효성분을 확인하고자 황기 또는 지치 유래 단일 성분을 선정하여 세포 독성 및 MMPs 생성 억제능을 평가하였다. 황기는 주요 flavonoid 성분인 calycosin 및 calycosin-7-O-β-D-glucoside를 선정하여 활성을 평가하였다.
, 2016). 하지만 shikonin 계 색소성분은 비극성 naphthoquinone 계열의 성분인 반면 본 실험의 지치 추출물은 70% 주정 추출물이기 때문에 lithospermic acid 를 유효성분으로 선정하여 활성을 평가하였다. Lithospermic acid는 지치에서 발견되는 주요 phenylpropanoid oligomer 성분이며 (Murata et al.
황기, 지치 복합물의 유효성분으로 선정하여 MMPs 저해능을 평가한 calycosin, calycosin-7-O-β-D-glucoside와 lithospermic acid에 대하여 황기 복합물에서의 함량을 정량하기 위해, 이들 3 종의 성분을 동시 분석할 수 있는 HPLC 분석법을 검토하 였다.
이 HPLC 분석법을 사용하여 황기, 지치 추출물 및 이들 추출물을 5 : 5, 6 : 4, 7 : 3, 8 : 2의 혼합비로 제조한 복합물 에서 유효성분 3 종의 함량을 정량 분석하였다. Table 3에서와 같이 황기 단독 추출물의 calycosin과 calycosin-7-O-β-D-glucoside 함량은 각각 0.
선행연구에서 황기 단독 추출물의 기능성 원료 개발을 위한 지표성분 분석법 제시를 위해 황기 지표성분에 대한 분석법검증을 실시한 바 있으나 (Kim et al., 2013b), 이번 연구는 황기, 지치 복합물의 기능성분을 동시에 분석하는 다성분 동시 분석법으로서 보다 정밀하고 진보된 분석법 검토가 필요하였다. 최종적으로, YMC의 ODS-AM 역상 컬럼을 사용하고, H2O와 acetonitrile의 혼합용매로 기울기 용리하여 254 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정한 결과, calycosin, calycosin-7-O-β-Dglucoside, lithospermic acid 각각의 성분이 양호한 분리능을 나타내는 HPLC 동시 분석법을 확립하였다 (Fig.
6). 이러한 HPLC 분석법을 검증하기 위해, 0.78 - 100 ng/㎕ 농도 범위내에서 분석하여 얻은 피크면적을 이용하여 회귀식과 상관계 수를 각각 구하였다.
HPLC 분석법의 재현성 검정과 유효성분의 회수율 분석은다음과 같이 실시하였다. 각각의 유효성분에 대해 10, 25, 50 ng/㎕의 3 가지 농도에서 하루 동안의 분석 재현성 (5 회 반복, intra-day)과 연속 5 일 동안의 분석 재현성 (5 회 반복, inter-day)을 실시하고, 정밀도 (precision) 및 정확도 (accuracy) 는 각각 상대표준오차 값과 회수율로서 나타내었다 (Table 2).
대상 데이터
연골세포 배양을 위해 사용된 Dubecco's Modified Eagle Medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin and streptomycin, trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 는 Gibco BRL (Gaithersburg, MD, USA)에서 구입하였으며, IL-1β와 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
표준품인 calycosin, calycosin-7-O-β-D-glucoside 과 lithospermic acid는 Chem Faces (Hubei, China)로부터 구입하여 사용하였고, 아세토니트릴, 메탄올 및 증류수는 HPLC급 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)이었으며, 그 외 시약 및 용매는 모두 일급 이상으로 구입하였다.
SW1353 인간 연골세포주는 American Type Culture Collection (ATCC HTB-94, Rockville, MD, USA)으로부터 구입하였으며, 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin이 함유된 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 0.
데이터처리
Data were analyzed by One-way ANOVA Dunnett’s test to compare all of the tested groups.
모든 분석 자료는 평균 ± 표준오차 (means ± SD)로 나타내었으며, 실험결과는 GraphPad Prism® Version 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) 프로그램을 이용하여 분산 분석 (ANOVA)으로 Dunnett’s test 방법을 이용하여 유의성을 검정하였다 (p < 0.05).
이론/모형
The cells were treated with samples (50 - 400 ㎍/㎖) for 24 h. Cell viability was measured by MTT assay. 1; astragali radix extract (A), 2; lithospermi radix extract (L), 3 - 6; mixtures (A : L ratio, 5 : 5, 6 : 4, 7 : 3 and 8 : 2, respectively).
The cells were treated with three compounds (5 - 80 μM) for 24 h. Cell viability was determined by MTT assay. Data were analyzed by One-way ANOVA Dunnett’s test to compare all of the tested groups.
성능/효과
SW1353 세포에 대한 세포독성을 평가하기 위해, SW1353 세포에 황기 (Astragali Radix; Astragalus membranaceus Bunge), 지치 추출물 및 혼합 비율별 복합물을 농도별로 처리한 후, 세포 생존율 (cell viability)을 측정하였다. 모든 시료 처리군에서 아무것도 처리하지 않은 정상군 (Con)과 비교하여 최고 농도 400 ㎍/㎖ 수준까지 세포 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다 (Fig. 2). 이후 효능검정 시료의 세포 처리농도는 보다 안전한 100과 200 ㎍/㎖ 수준에서 MMPs 억제 효과를 검정하였다.
, 2013a). 하지만 70% 주정을 이용한 환류추출을 했을 때, SW1353 세포에서 고농도 수준까지 세포 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 지치는 추출법에 의해 세포 독성이 나타날 수 있으며, 70% 주정 추출물은 상대적으로 안전 성이 높은 것으로 사료된다.
하지만 70% 주정을 이용한 환류추출을 했을 때, SW1353 세포에서 고농도 수준까지 세포 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 지치는 추출법에 의해 세포 독성이 나타날 수 있으며, 70% 주정 추출물은 상대적으로 안전 성이 높은 것으로 사료된다. 각각의 황기 또는 지치 추출물과 혼합 비율별 복합물 처리가 연골세포주에서 IL-1β에 의해 유도된 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13의 생성량 증가에 대한 억제 효과를 나타내는지 평가하였다.
IL-1β 처리에 따른 MMP-1의 생성량 변화를 확인한 결과, IL-1β 처리군은 정상 대조군 (Con)과 비교하여 MMP-1의 생성량이 약 9.6 배 증가하였다 (Fig. 3).
특히, 7 : 3 혼합 비율의 복합물은 황기 또는 지치 단일 추출물 및 다른 혼합 비율의 복합물과 비교하여 IL-1β 처리에 의한 연골세포의 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13의 생성량 증가를 가장 효과적으로 억제하였으며, 이는 각각의 단일 추출물이 가지고 있는 MMPs 생성 억제 효능이 복합되어 시너지 작용 (synergistic actions)에 의해 증폭효과를 보인 것으로 생각된다.
이러한 결과를 통해 황기, 지치 단일 추출물 및 복합물이 IL-1β 처리에 의한 연골세포의 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13의 생성량 증가를 억제하는 효과가 있는 것을 확인하였다.
동일 농도의 단일 추출물 처리군에서는 IL-1β 처리군과 비교하여 각각 75.7, 72.0% 억제 효과를 보였으며, 이러한 결과를 통해 단일 추출물 처리군에 비해 6 : 4, 7 : 3 및 8 : 2 혼합물에서 시너지 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.
시료들 중에서 6 : 4, 7 : 3 및 8 : 2 혼합 비율의 복합물은 100 ㎍/㎖ 처리시, IL-1β 처리군과 비교하여 각각 95.2, 97.1 및 97.6% MMP-13 생성량 감소 효과를 보였다.
MMP-13의 생성량 변화에서는 IL-1β 처리군은 정상 대조군 (Con)과 비교하여 MMP-13의 생성량이 약 4.0 배 증가한 것을 확인하였다.
특히, 7 : 3 혼합 비율의 복합물은 100 ㎍/㎖ 처리시, IL-1β 처리군 대비하여 98.5% 감소 효과를 보였으며, 모든 시료중 가장 효과적으로 MMP-3의 생성 증가를 억제하였으며, 동일 농도의 황기 추출물 (85.4%) 및 지치 추출물 (90.7%) 처리군과 비교하여 더 효과적으로 MMP-3 생성을 억제하는 것을 확인하였다.
그러나 시료를 처리했을 경우, 모든 시료 처리군에서 IL-1β 처리에 의한 MMP-3의 생성량이 감소되는 것을 확인하였다.
그러나 시료를 처리했을 경우, 모든 시료 처리군에서 증가된 MMP-1의 생성량이 정상 대조군과 유사한 수준까지 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 황기 및 지치 단일 추출물이 MMP-1 생성량 증가에 대한 강력한 억제 효과가 있는 것으로 생각되며, 다양한 혼합 비율에 의한 복합물의 경우에도 단일 추출물의 억제 효과가 감소되지 않고 발휘되었기 때문에 복합물 간의 활성 정도가 유사하게 나타난 것으로 사료된다.
그러나 시료를 처리했을 경우, 모든 시료 처리군에서 증가된 MMP-1의 생성량이 정상 대조군과 유사한 수준까지 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 황기 및 지치 단일 추출물이 MMP-1 생성량 증가에 대한 강력한 억제 효과가 있는 것으로 생각되며, 다양한 혼합 비율에 의한 복합물의 경우에도 단일 추출물의 억제 효과가 감소되지 않고 발휘되었기 때문에 복합물 간의 활성 정도가 유사하게 나타난 것으로 사료된다.
7%) 처리군과 비교하여 더 효과적으로 MMP-3 생성을 억제하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 두 가지 단일 추출물이 혼합되어 시너지 작용에 의해 MMP-3 생성 억제 효과가 증대된 것으로 사료된다.
0 배 증가한 것을 확인하였다. 그러나 시료를 처리했을 경우, 모든 시료 처리군에서 증가된 MMP-13의 생성량이 감소된 것을 확인하였다. 시료들 중에서 6 : 4, 7 : 3 및 8 : 2 혼합 비율의 복합물은 100 ㎍/㎖ 처리시, IL-1β 처리군과 비교하여 각각 95.
이러한 결과를 통해 황기, 지치 단일 추출물 및 복합물이 IL-1β 처리에 의한 연골세포의 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13의 생성량 증가를 억제하는 효과가 있는 것을 확인하였다. 하지만, 복합물의 경우 혼합 비율 및 MMPs 종류에 따라 MMPs 생성 억제 효과는 단일 추출물과 비교하여 증폭 또는 감소하여 서로 상이한 결과를 나타내었으며, 혼합 비율-의존적인 효과는 관찰되지 않았다. 특히, 7 : 3 혼합 비율의 복합물은 황기 또는 지치 단일 추출물 및 다른 혼합 비율의 복합물과 비교하여 IL-1β 처리에 의한 연골세포의 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13의 생성량 증가를 가장 효과적으로 억제하였으며, 이는 각각의 단일 추출물이 가지고 있는 MMPs 생성 억제 효능이 복합되어 시너지 작용 (synergistic actions)에 의해 증폭효과를 보인 것으로 생각된다.
따라서 황기 및 지치 추출물을 7 : 3 비율로 혼합한 복합물은 시너지 효과를 통해 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13의 활성 또는 생성 증가를 저해하여 연골세포 보호 효과 및 골관절염의 발생에 대한 억제 효과를 나타낼 수 있을 것으로 예상된다.
황기 및 지치 유래 3 가지 단일 성분의 SW1353 세포에 대한 독성을 평가한 결과, 3 가지 단일 성분 모두 최대 농도 80 μM 수준까지 정상 대조군 (Con)과 비교하여 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다 (Fig. 4).
이러한 결과를 통해, calycosin-7-O-β-D-glucoside, calycosin 및 lithospermic acid는 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13 생성을 효과적으로 억제하는 것으로 확인되었다.
또한, 지치 유래 lithospermic acid 20 μM 처리시, IL-1β 처리군 대비하여 MMP-1의 생성량 증가에 대하여 42.7%의 저해 효과를 보였으며, MMP-3 및 MMP-13의 생성량에 대해서는 감소 효과가 각각 7.0 및 14.4%로 거의 없는 것으로 확인되었다 (Fig. 5C).
Calycosin-7-O-β-D-glucoside 40 μM 처리시, IL-1β 처리군과 비교하여 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13 생성량이 각각 20.3, 54.6 및 34.5% 감소하는 것을 확인하였다 (Fig. 5B).
3 가지 단일 성분이 연골세포주에서 IL-1β에 의해 유도된 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13의 생성량 증가에 미치는 영향을 평가한 결과, calycosin 40 μM 처리군은 IL-1β 처리군에 대비하여 MMP-1 및 MMP-3 생성량을 각각 19.0 및 43.7% 감소시켰다.
추가적으로 황기 유래 calycosin-7-O-β-D-glucoside, calycosin 과 지치 유래 lithospermic acid는 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13의 생성을 억제하는 효과를 나타냈으며, 황기, 지치 복합물의 연골보호 효과에 대한 주요 유효성분으로 작용한다고 사료 된다.
황기, 지치 복합물은 혼합 비율에 따라 calycosin 함량은 0.304 - 0.483 ㎎/g, calycosin-7-O-β-D-glucoside 함량은 0.429 - 0.666 ㎎/g, lithospermic acid 함량은 0.382 - 0.912 ㎎/g 수준이었으며, 가장 우수한 MMPs 저해 활성을 나타낸 7 : 3 혼합비의 복합물은 calycosin, calycosin-7-O-β-D-glucoside 및 lithospermic acid 함량이 각각 0.424, 0.586, 0.554 ㎎/g으로 분석되었다.
본 연구 결과를 종합해 볼 때, 황기, 지치의 주정 추출물 제조공정을 확립하였으며, 연골세포에서의 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13 생성 억제효과 평가를 통해 황기와 지치 추출물의 최적 복합 조성비를 결정하고, 혼합에 의한 시너지 효과 (synergistic effect)를 확인하였다.
최종적으로, YMC의 ODS-AM 역상 컬럼을 사용하고, H2O와 acetonitrile의 혼합용매로 기울기 용리하여 254 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정한 결과, calycosin, calycosin-7-O-β-Dglucoside, lithospermic acid 각각의 성분이 양호한 분리능을 나타내는 HPLC 동시 분석법을 확립하였다 (Fig. 6).
Signal 대비 noise 즉, S/N 비에 근거한 calycosin, calycosin-7-O-β-D-glucoside 및 lithospermic acid의 최저 검출한계농도 (LOD)는 각각 1.06, 0.56, 2.45 ng/㎕이었고, 최저 정량한계농도 (LOQ)는 4.50, 2.88, 8.22 ng/㎕ 로 측정되었다.
유효성분 3 종의 intra-day 정밀도는 0.52 - 1.69%, 정확도는 98.48 - 101.36% 범위였으며, inter-day 정밀도와 정확도는 각각 0.33 - 2.02%, 96.51 - 100.24% 범위로 측정되었다. Intra-day와 inter-day 분석 결과는 주어진 농도 범위 내에서 약 15%를 벗어나지 않는 정확성을 보여주었다.
, 2008). 결론적으로, 이번 HPLC 분석법이 비교적 높은 정확도와 정밀도를 보여줌에 따라 황기, 지치 복합물의 유효성분 HPLC 분석법으로 적합하다고 판단되었다.
후속연구
특히, 7 : 3 혼합 비율의 복합물은 황기 또는 지치 단일 추출물 및 다른 혼합 비율의 복합물과 비교하여 IL-1β 처리에 의한 연골세포의 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13의 생성량 증가를 가장 효과적으로 억제하였으며, 이는 각각의 단일 추출물이 가지고 있는 MMPs 생성 억제 효능이 복합되어 시너지 작용 (synergistic actions)에 의해 증폭효과를 보인 것으로 생각된다. 따라서 추후 황기, 지치 복합물을 이용한 골관절염 개선 연구에는 7 : 3 (황기 : 지치, w/w) 비율이 최적의 혼합 조성비로 사료된다.
이러한 결과를 통해, calycosin-7-O-β-D-glucoside, calycosin 및 lithospermic acid는 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13 생성을 효과적으로 억제하는 것으로 확인되었다. 이로써 이들 성분이 황기 복합물의 연골보호 효능과 품질을 평가하는 주요 기능성분이면서 지표성분으로 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
추가적으로 황기 유래 calycosin-7-O-β-D-glucoside, calycosin 과 지치 유래 lithospermic acid는 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13의 생성을 억제하는 효과를 나타냈으며, 황기, 지치 복합물의 연골보호 효과에 대한 주요 유효성분으로 작용한다고 사료 된다. 혼합 비율 7 : 3의 황기, 지치 복합물은 우수한 MMPs 생성 억제 활성을 나타내어 이 복합물을 활용한 골관절염 동물 모델을 이용한 효능평가 연구 및 분자생물학적인 방법을통한 기전 연구 등의 기초자료로 활용될 것으로 판단된다. 이러한 심도 깊은 연구를 통해 황기, 지치 복합물은 관절건강에 대한 기능성 원료로 개발될 가능성이 높다고 사료된다.
혼합 비율 7 : 3의 황기, 지치 복합물은 우수한 MMPs 생성 억제 활성을 나타내어 이 복합물을 활용한 골관절염 동물 모델을 이용한 효능평가 연구 및 분자생물학적인 방법을통한 기전 연구 등의 기초자료로 활용될 것으로 판단된다. 이러한 심도 깊은 연구를 통해 황기, 지치 복합물은 관절건강에 대한 기능성 원료로 개발될 가능성이 높다고 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
골관절염은 무엇인가 ?
골관절염 (osteoarthritis)은 퇴행성관절염이라 불리기도 하는 가장 흔한 관절염으로, 골 표면을 쌓고 있는 관절연골(cartilage)이 마모되거나 손상되면서 국소적인 퇴행성 변화가 나타나는 질환이다 (Aigner and McKenna, 2002). 퇴행성 관절염의 정확한 원인은 아직 규명되지 않았지만, 연령, 유전, 비만과 외상 등의 이유로 유발되며, 뼈의 퇴행성 변화, 관절의 변형 및 통증 등을 초래하는 것으로 알려져 있다 (Mandelbaum and Waddell, 2005).
지치의 한방학적 쓰임은 ?
, 2006). 한방에서는 화상, 감염 및 상처 등 피부 질환의 치료에 사용되었으며, 주로 소염제, 혈압강하작용 및 항진균 효과를 위한 약제로 사용되고 있다 (Thuong et al., 2009; Hong et al.
황기 추출물과 지치 추출물의 효과는 ?
우리는 선행연구에서 황기 추출물과 지치 추출물이 각각 IL-1& beta; 처리에 의한 연골세포에서 MMPs를 억제하고, monosodium iodoacetate (MIA) 유도 골관절염 동물모델에서 손상된 연골조직을 보호하여 관절염에 대한 효과를 나타냄을 보고한 바 있다 (Kim et al., 2013a; Kim et al.
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