[논문]유전자 발현 데이터 기반 구강암에서의 세포 조성 차이 분석

이제근

doi:10.15207/jkcs.2019.10.8.059

유전자 발현 데이터 기반 구강암에서의 세포 조성 차이 분석
Distinct cell subtype composition using gene expression data in oral cancer 원문보기

한국융합학회논문지 = Journal of the Korea Convergence Society, v.10 no.8, 2019년, pp.59 - 65

이제근 (부산대학교 치의학전문대학원 치의생명과학과)

초록
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암 조직에는 다양한 형태의 세포가 존재하지만, 이들의 조성을 실험적으로 확인하기는 매우 어렵다. 본 연구에서는 유전자 발현 데이터에 통계적 기계학습 모델을 적용하여 각 샘플의 세포 조성을 추론하고, 이러한 세포 조성이 암조직과 정상 조직간에 차이가 있는지를 확인하였다. 두 가지 서로 다른 회귀 모델을 이용하여 세포 조성을 예측한 결과 CD8 T cell과 Neutrophil이 구강암 조직에서 정상 조직에 비해 증가함을 확인할 수 있었다. 또한 비지도학습 중 하나인 t-SNE를 적용하여, 유추된 세포 조성에 의해 정상 조직과 구강암 조직이 서로 군집을 이루고 있음을 확인하였고, 지도 학습 기반의 다양한 분류 알고리즘들을 이용하여 세포 조성 정보를 이용하여 구강암과 정상 조직을 예측하는 것이 가능함을 보였다. 이 연구는 구강암의 면역 세포 침투에 대한 이해도를 증진하는데에 도움을 줄 수 있을 것이다.

Abstract ▼ AI-Helper

There are various subtypes of cells in cancer tissues, but it is hard to confirm their composition experimentally. Here, we estimated the cell composition of each sample from gene expression data by using statistical machine learning approaches, two different regression models and investigated whether the cell composition was different between cancer and normal tissue. As a result, we found that CD8 T cell and Neutrophil were increased in oral cancer tissues compared to normal tissues. In addition, we applied t-SNE, which is one of the unsupervised learning, to verify whether normal tissue and oral cancer tissue can be clustered by the derived cell composition. Moreover, we showed that it is possible to predict oral cancer and normal tissue by several supervised classification algorithms. The study would help to improve the understanding of the immune cell infiltration at oral cancer.

주제어

표/그림 (11)

그림 Fig. 1. Schematic Overview
그림 Fig. 2. Cellular composition obtained by CIBERSORT
그림 Fig. 3. Cellular composition obtained by TIMER
그림 Fig. 4. Boxplots for cell subtypes obtained by CIBERSORT. OSCC means oral cancer samples.
그림 Fig. 5. Boxplots for cell subtypes obtained by TIMER. OSCC means oral cancer samples.
표 Table 1. t-test for CIBERSORT
표 Table 2. t-test for TIMER
그림 Fig. 6. t-SNE plot for cell subtype composition obtained by CIBERSORT
그림 Fig. 7. t-SNE plot for cell subtype composition obtained by TIMER
표 Table 3. Classification performance using CIBERSORT results
표 Table 4. Classification performance using TIMER results

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 CIBERSORT와 TIMER 두 가지 방법을 이용하여 각 샘플의 세포 별 조성을 확인하여 보았다. CIBERSORT의 수행을 위해서는 유전자 발현 데이터 뿐 아니라 기준값으로 사용하기 위한 signature 유전자 파일도 함께 입력으로 넣어야한다.
본 연구에서는 구강암 조직과 정상 조직으로부터 얻어진 유전자 발현양 데이터를 이용하여 CIBERSORT와 TIMER의 두 가지 서로 다른 방법을 통해 세포 조성을 확인하고, 두 그룹 간에 차이가 있는지를 확인해보았다. 본 연구는 면역 세포 침투의 이해도를 높일 수 있고, 이는 향후 암 치료를 위한 기반 지식이 될 수 있을 것이다.
본 연구에서는 우선 CIBERSORT와 TIMER 각각을 이용하였을 때 각 샘플 별 세포 조성의 결과를 확인하여 보았다. Fig.
본 연구에서는 구강암 조직과 정상 조직의 유전자 발현 데이터로부터 CIBERSORT와 TIMER 두 가지 방법을 이용하여 세포 조성 정보를 유추하였다. 이를 통해 두 가지 서로 다른 방법을 통해 얻어진 결과를 이용하여 공통적으로 예측되는 세포 조성 차이를 확인하여 보았다. 또한 유전자 발현 정보에 기반하여 유추된 세포 구성 정보를 이용한 기계학습 방법이 암 종을 예측할 수 있는지를 탐색하였다[7,8].

제안 방법

마지막으로 세포 조성 데이터에 지도학습 기반 분류 알고리즘을 적용하여 암 조직과 정상 조직의 구분이 가능한지를 확인해보았다. 로지스틱 회귀(logistic regression), 인공신경망(Artificial Neural Networks), 결정 나무(Decision Tree), 랜덤 포레스트(Random Forest), 서포트 벡터 머신(Support Vector Machine) 등의 대표적인 분류 알고리즘들을 이용하여 분류 정확도를 측정하여 정상 조직과 구강암 조직 간에 세포 조성이 구분되는 특성이 있는지, 또한 이러한 정보에 기반한 구강함 예측이 가능한지 여부를 살펴보았다. 본 분석에서의 분류 결과는 모두 10-fold cross-validation에 의해 측정되었다.
마지막으로 기계학습 기법을 이용하여 세포 조성 값을 이용하여 구강암 조직과 정상 조직에 대한 분류가 가능 한지 확인해보았다. Fig.
3, max_iter=1000 으로 설정하고 실험을 수행 하였다. 마지막으로 세포 조성 데이터에 지도학습 기반 분류 알고리즘을 적용하여 암 조직과 정상 조직의 구분이 가능한지를 확인해보았다. 로지스틱 회귀(logistic regression), 인공신경망(Artificial Neural Networks), 결정 나무(Decision Tree), 랜덤 포레스트(Random Forest), 서포트 벡터 머신(Support Vector Machine) 등의 대표적인 분류 알고리즘들을 이용하여 분류 정확도를 측정하여 정상 조직과 구강암 조직 간에 세포 조성이 구분되는 특성이 있는지, 또한 이러한 정보에 기반한 구강함 예측이 가능한지 여부를 살펴보았다.
본 연구에서는 구강암 조직과 정상 조직의 유전자 발현 데이터로부터 CIBERSORT와 TIMER 두 가지 방법을 이용하여 세포 조성 정보를 유추하였다. 이를 통해 두 가지 서로 다른 방법을 통해 얻어진 결과를 이용하여 공통적으로 예측되는 세포 조성 차이를 확인하여 보았다.
본 연구에서는 우선적으로 t-검정을 이용하여 구강암 조직과 정상 조직 간의 세포 조성 차이가 존재하는지를 확인하였다. 단측 검정을 이용하여 p-value를 계산하였다.
또한 경우에 따라서는 여러 개의 서로 다른 인자가 하나의 유전자로 매핑되는 경우도 존재한다. 유전자 발현양 기반 세포 조성 예측을 위해서는 하나의 유전자당 하나씩의 값만 존재하여야 하기에, 하나의 유전자에 해당하는 인자가 여러 개 존재하는 경우 각 인자의 분산 (variance)값을 계산하여 분산이 가장 큰 인자만을 사용 하였다. 이러한 전처리 과정을 통해 최종적으로 분석에 사용된 인자는 총 17,324개였다.
통계적인 분석을 통해 각 세포 타입 별로 암 조직과 정상 조직에 특정 세포의 양이 차이가 있는지를 살펴보 았다. Fig.

대상 데이터

본 데이터는 총 17,881 개의 인자로 이루어져 있다. 하지만, 이들 인자 중에는 특정 유전자에 해당하지 않는 인자들도 일부 존재하기에 이러한 인자들은 분석에서 제외하였다.
TIMER의 수행에서 역시 기준값으로 사용하기 위한암 종을 입력해야한다. 본 분석에서 사용된 구강암은 두경부암(head and neck cancer; HNSCC)의 한 종류로 간주될 수 있기에 HNSC로 선택하고 수행하였다. TIMER에서도 총 6개의 세포에 대한 조성을 예측하지만, B cell, CD4 T Cell, CD8 T Cell, Neutrophil, Macrophage, Dendritic Cell로 예측되는 세포 종류는 CIBERSORT와 조금의 차이가 있었다.
CIBERSORT의 수행을 위해서는 유전자 발현 데이터 뿐 아니라 기준값으로 사용하기 위한 signature 유전자 파일도 함께 입력으로 넣어야한다. 본 분석에서는 CIBERSORT 에서 기본적으로 제공하는 LM6 파일을 이용하여 총 6개 세포 타입(B cell, CD8 T Cell, CD4 T Cell, NK cell, Monocyte, Neutrophil)을 예측할 수 있었다. Permutation 값은 100으로 설정하여 실행하였다.
본 연구에서는 22개의 정상 조직과 57개의 구강암 조직의 총 79개로 샘플의 유전자 발현양 데이터를 이용하였다[9]. 이 데이터는 Affymetrix GeneChip Human Gene 1.
본 연구에서는 22개의 정상 조직과 57개의 구강암 조직의 총 79개로 샘플의 유전자 발현양 데이터를 이용하였다[9]. 이 데이터는 Affymetrix GeneChip Human Gene 1.0 ST Array 를 이용하여 생산된 것으로 GEO (Gene Expression Omnibus; accession number GSE25099)로부터 다운로드 받아서 분석에 사용하였다.
유전자 발현양 기반 세포 조성 예측을 위해서는 하나의 유전자당 하나씩의 값만 존재하여야 하기에, 하나의 유전자에 해당하는 인자가 여러 개 존재하는 경우 각 인자의 분산 (variance)값을 계산하여 분산이 가장 큰 인자만을 사용 하였다. 이러한 전처리 과정을 통해 최종적으로 분석에 사용된 인자는 총 17,324개였다.

데이터처리

다음으로는 비지도학습 방법 중 하나인 t-SNE 를 이용하여 구강암 조직과 정상 조직 간의 세포 조성 차이를 확인하였다[10]. t-SNE의 수행을 위해서는 R software 의 Rtsne 패키지를 이용하였으며, perplexy는 10, theta=0.3, max_iter=1000 으로 설정하고 실험을 수행 하였다. 마지막으로 세포 조성 데이터에 지도학습 기반 분류 알고리즘을 적용하여 암 조직과 정상 조직의 구분이 가능한지를 확인해보았다.
본 연구에서는 우선적으로 t-검정을 이용하여 구강암 조직과 정상 조직 간의 세포 조성 차이가 존재하는지를 확인하였다. 단측 검정을 이용하여 p-value를 계산하였다. 다음으로는 비지도학습 방법 중 하나인 t-SNE 를 이용하여 구강암 조직과 정상 조직 간의 세포 조성 차이를 확인하였다[10].
우선 CIBERSORT에 대해 두 그룹 간에 보여지는 차이가 통계적으로 유의한지 여부를 확인하기 위해 t-검정을 이용하였다.Table 1은 CIBERSORT의 결과에 대해각 세포 별로 t-검정 결과를 p-value와 함께 보여준다.
3에서와 같이 상대적으로 각 샘플별로 세포 조성이 비교적 유사하게 예측됨을 알 수 있었다. 하지만, CIBERSORT와 TIMER 모두 전체적인 세포 조성을 확인해봤을 때 구강암 조직과 정상 조직 간에 아주 확연한 차이를 이 결과만으로는 확인하기 어렵기에 통계적인 분석과 기계학습 기반 분석을 진행하였다.

이론/모형

단측 검정을 이용하여 p-value를 계산하였다. 다음으로는 비지도학습 방법 중 하나인 t-SNE 를 이용하여 구강암 조직과 정상 조직 간의 세포 조성 차이를 확인하였다[10]. t-SNE의 수행을 위해서는 R software 의 Rtsne 패키지를 이용하였으며, perplexy는 10, theta=0.
로지스틱 회귀(logistic regression), 인공신경망(Artificial Neural Networks), 결정 나무(Decision Tree), 랜덤 포레스트(Random Forest), 서포트 벡터 머신(Support Vector Machine) 등의 대표적인 분류 알고리즘들을 이용하여 분류 정확도를 측정하여 정상 조직과 구강암 조직 간에 세포 조성이 구분되는 특성이 있는지, 또한 이러한 정보에 기반한 구강함 예측이 가능한지 여부를 살펴보았다. 본 분석에서의 분류 결과는 모두 10-fold cross-validation에 의해 측정되었다.

성능/효과

05에 가까운 값을 가지고 있기에 현재의 데이터에서는 그 차이를 통계적으로 명확히 증명하기는 어려웠다. CD8 T cell의 경우 TIMER에서도 CIBERSORT 결과에서와 마찬가지로 구강암 조직에서 세포 조성이 확연히 증가함이 확인되었다. CD8 T cell 의 경우 암 세포를 죽이는 데에 직접적인 역할을 수행하는 것으로 잘 알려져 있기에, 암 조직에서 CD8 T cell의 양이 증가하는 것은 명확한 사실로 보인다[11,12].
두 그림 모두 같은 순서로 샘플들이 정렬되어 있으며, 좌측 22개의 막대는 정상 조직 샘플에 대한 결과이며, 나머지 우측 57개의 막대는 구강암 조직에 대한 결과이다. CIBERSORT의 결과는 Fig. 2에서 보여지듯이 TIMER의 결과에 비해 상대 적으로 각 샘플 별로 세포 조성의 값에 많은 차이를 보였다. 이와 반대로 TIMER의 경우는 Fig.
CIBERSORT의 결과를 우선 확인해볼 때, CD8 T cell이 가장 낮은 p-value를 보였다. 즉, CD8 T cell이 정상 조직과 구강암 조직에서 가장 많은 차이를 보임을 의미한다.
즉, CD8 T cell이 정상 조직과 구강암 조직에서 가장 많은 차이를 보임을 의미한다. Fig. 4에서 확인할 수 있는 것과 같이 구강암 조직에서는 CD8 T cell의 조성이 정상 조직에서보다 확연히 높음을 알 수 있었다. 또한 Neutrophil의 경우도 p-value가 0.
CD8 T cell 의 경우 암 세포를 죽이는 데에 직접적인 역할을 수행하는 것으로 잘 알려져 있기에, 암 조직에서 CD8 T cell의 양이 증가하는 것은 명확한 사실로 보인다[11,12]. Neutrophil도 TIMER 분석 결과 CIBERSORT에서와 유사하게 구강암에서 크게 증가하는 것으로 확인되었다. 암에서 neutrophil이 증가한다는 보고가 이미 있어왔기 에, 본 분석에서 나타난 이러한 결과 역시 명확한 사실로 생각할 수 있다[13,14].
Monocyte와 NK cell은 CIBERSORT 결과에서만 확인이 가능하고, Macrophage와 Dendritic cell의 경우는 TIMER의 결과에서만 확인이 가능하기에 이들 세포들은 두 방법에 대한 비교 분석은 불가능했다. 결과를 살펴보면, CIBERSORT에서만 확인되는 Monocyte와 NK cell은 구강암 조직과 정상 조직 사이에 통계적으로 유의한 차이를 보이지는 않았다. 마찬가지로 TIMER에서만 확인 가능한 Macrophage 역시도 통계적으로 유의한 차이를 이야기하기는 어려웠다.
4에서 확인할 수 있는 것과 같이 구강암 조직에서는 CD8 T cell의 조성이 정상 조직에서보다 확연히 높음을 알 수 있었다. 또한 Neutrophil의 경우도 p-value가 0.023으로 구강암에서 Neutrophil을 정상 조직에 비해 높은 비율로 가지고 있음을 알 수 있었다. 하지만 NK cell과 Monocyte의 경우에는 통계적으로 유의한 차이를 발견할 수 없었다.
본 연구를 통해 CD8 T Cell과 Neutrophil 세포의 양이 구강암 조직에서 증가해있음을 공통적으로 확인할 수 있었다. 또한 기계학습 방법을 이용한 분류 결과는 CIBERSORT의 경우에 비해 TIMER를 이용했을 때 훨씬 높은 정확도로 구강암과 정상 조직을 분류해낼 수 있었다.
본 연구를 통해 CD8 T Cell과 Neutrophil 세포의 양이 구강암 조직에서 증가해있음을 공통적으로 확인할 수 있었다. 또한 기계학습 방법을 이용한 분류 결과는 CIBERSORT의 경우에 비해 TIMER를 이용했을 때 훨씬 높은 정확도로 구강암과 정상 조직을 분류해낼 수 있었다.
Table 2와 같이, TIMER의 결과를 확인해보면 CIBERSORT와 많은 부분에서 유사하지만 부분적으로는 다른 특성도 가짐을 확인할 수 있었다. 우선 B cell의 경우를 살펴보면, TIMER에서와 CIBERSORT 모두 구강암 조직에서 정상조직 보다 조금 낮은 비율의 B cell을 가짐을 확인할 수 있었으나, 두 방법 모두 t-검정 결과 p-value가 0.05에 가까운 값을 가지고 있기에 현재의 데이터에서는 그 차이를 통계적으로 명확히 증명하기는 어려웠다. CD8 T cell의 경우 TIMER에서도 CIBERSORT 결과에서와 마찬가지로 구강암 조직에서 세포 조성이 확연히 증가함이 확인되었다.
하지만 TIMER를 이용한 분류 결과를 보면 분류 알고리즘에 관계없이 매우 높은 정확도를 보임을 확인할 수 있었다. 특히 민감도 역시 CIBERSORT 결과에서와는 달리 매우 높은 값을 가지고 있기에 불균형 데이터 집단의 특성과 관계없이 세포 조성 정보에 의해 구강암 조직과 정상 조직을 잘 분류할 수 있음을 확인할 수 있었다.
하지만 TIMER를 이용한 분류 결과를 보면 분류 알고리즘에 관계없이 매우 높은 정확도를 보임을 확인할 수 있었다. 특히 민감도 역시 CIBERSORT 결과에서와는 달리 매우 높은 값을 가지고 있기에 불균형 데이터 집단의 특성과 관계없이 세포 조성 정보에 의해 구강암 조직과 정상 조직을 잘 분류할 수 있음을 확인할 수 있었다.

후속연구

CIBERSORT와 TIMER의 결과에 차이가 나는 한 가지 부분은 CD4 T cell이다. 구강암 조직과 정상 조직 간의 차이가 아주 크지는 않지만 CIBERSORT에서는 구강암 조직에서 CD4 T cell의 양이 상대적으로 적게 관찰 되었으나, TIMER 분석 결과에서는 구강암 조직에서 CD 4 T Cell의 양이 조금 증가하는 것으로 확인되어 향후 추가적인 분석이 더 필요할 것으로 보인다.
하지만 한 편으로는 CIBERSORT의 결과와 TIMER의 결과에 조금 차이가 있기에 보다 정확한 세포 조성 유추 방법이 개발될 필요가 있다. 또한 암 조직이라 하더라도암 세포와 정상 세포가 혼재되어 있는 형태이기에, 암 세포와 정상 세포의 비율에 따라 유전자 발현 분석의 결과가 달라질 수 있음은 이미 보고된 바가 있기에[15], 현재의 데이터에 대해서도 이러한 purity 정보를 확인하고, 이에 따라 보다 적절한 세포 조성 예측 방법을 이용하거나 기존 방법을 개선하는 등의 연구가 향후 추가로 더 필요할 것으로 보인다.
본 연구에서는 구강암 조직과 정상 조직으로부터 얻어진 유전자 발현양 데이터를 이용하여 CIBERSORT와 TIMER의 두 가지 서로 다른 방법을 통해 세포 조성을 확인하고, 두 그룹 간에 차이가 있는지를 확인해보았다. 본 연구는 면역 세포 침투의 이해도를 높일 수 있고, 이는 향후 암 치료를 위한 기반 지식이 될 수 있을 것이다.
하지만 한 편으로는 CIBERSORT의 결과와 TIMER의 결과에 조금 차이가 있기에 보다 정확한 세포 조성 유추 방법이 개발될 필요가 있다. 또한 암 조직이라 하더라도암 세포와 정상 세포가 혼재되어 있는 형태이기에, 암 세포와 정상 세포의 비율에 따라 유전자 발현 분석의 결과가 달라질 수 있음은 이미 보고된 바가 있기에[15], 현재의 데이터에 대해서도 이러한 purity 정보를 확인하고, 이에 따라 보다 적절한 세포 조성 예측 방법을 이용하거나 기존 방법을 개선하는 등의 연구가 향후 추가로 더 필요할 것으로 보인다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	CIBERSORT은 어떤방법인가?	가장 대표적인 것이 CIBERSORT와 TIMER이다. CIBERSORT는 미국 스탠포드 대학의 Newman 등에 의해 개발된 방법으로 여기서는 서포트 벡터 회귀(support vector regression) 방법에 기반하여 세포 조성을 유추하였다[5]. TIMER의 경우에는 미국 하버드의 Liu 그룹에서 개발된 것으로 선형 회귀 분석 방법에 기반하여 총 6개의 세포에 대한 조성을 확인한다 [6].
	TIMER란?	CIBERSORT는 미국 스탠포드 대학의 Newman 등에 의해 개발된 방법으로 여기서는 서포트 벡터 회귀(support vector regression) 방법에 기반하여 세포 조성을 유추하였다[5]. TIMER의 경우에는 미국 하버드의 Liu 그룹에서 개발된 것으로 선형 회귀 분석 방법에 기반하여 총 6개의 세포에 대한 조성을 확인한다 [6].
	유전자 발현양 데이터로부터 회귀모델 등 전산학 적인 계산 방법을 이용하여 세포 조성을 확인하는 방법 들이 개발된 개표적인 방법은?	최근 유전자 발현양 데이터로부터 회귀모델 등 전산학 적인 계산 방법을 이용하여 세포 조성을 확인하는 방법 들이 개발되었다. 가장 대표적인 것이 CIBERSORT와 TIMER이다. CIBERSORT는 미국 스탠포드 대학의 Newman 등에 의해 개발된 방법으로 여기서는 서포트 벡터 회귀(support vector regression) 방법에 기반하여 세포 조성을 유추하였다[5].

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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