[논문]혈관내피세포에서 우방자(牛蒡子) 에탄올 추출물의 항염증 효과

이윤정; 윤정주; 김혜윰; 안유미; 홍미현; 손찬옥; 나세원; 이호섭; 강대길

doi:10.15204/jkobgy.2019.32.3.020

[국내논문] 혈관내피세포에서 우방자(牛蒡子) 에탄올 추출물의 항염증 효과
Anti-Inflammatory Effect of Ethanol Extract from the Seeds of Arctium Lappa L. in Vascular Endothelial Cells 원문보기

大韓韓方婦人科學會誌 = The Journal of Korean obstetrics & gynecology, v.32 no.3, 2019년, pp.20 - 31

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Objectives: The seeds from Arctium lappa have been considered for its various pharmacological properties, which include anti-carcinogenic, anti-inflammatory, anti-diabetic, and anti-viral activities. Methods: In the present study, we investigated the anti-inflammatory effect of the ethanol extract from the seeds of Arctium lappa L (EAL) on cytokine-induced vascular inflammation in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Results: Pretreatment with EAL significantly decreased tumor necrosis factor alpha ($TNF-{\alpha}$)-induced cell adhesion molecules expression such as intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), and endothelial-selectin (E-selectin) in a dose-dependent manner. Cell adhesion assay showed that pretreatment with EAL suppressed HUVEC-monocyte adhesion by $TNF-{\alpha}$ over $1{\mu}g/ml$ concentration. We investigated the involvement of nuclear transcription factor kappa-B ($NF-{\kappa}B$) in $TNF-{\alpha}$-induced vascular inflammation. $NF-{\kappa}B$ p65 nuclear expression was induced by $TNF-{\alpha}$, however, pretreatment with EAL was attenuated that nuclear translocation. In cytoplasm, EAL was also attenuated $TNF-{\alpha}$-induced decrease of inhibitor of ${\kappa}B-{\alpha}$ ($I{\kappa}B-{\alpha}$) expression. Moreover, EAL significantly decreased $TNF-{\alpha}$-induced production of intracellular reactive oxygen species (ROS). Conclusions: Taken together, our findings suggest that seeds of Arctium lappa L could be a therapeutic herb for prevention of cardiovascular diseases throughout the inhibition of vascular endothelial inflammation.

주제어

표/그림 (6)

그림 Fig. 1. Effects of EAL on cell viability in HUVEC.
그림 Fig. 2. Effect of HHT on TNF-α-induced expression of adhesion molecules and vascular inflammation.
표 Table 1. Effect of EAL on TNF-α-Induced HUVEC Surface Expression of Cell Adhesion Molecules
그림 Fig. 3. Effect of EAL on adhesion of monocytes to TNF-α-stimulated vascular endothelial cells.
그림 Fig. 4. Effects of EAL on TNF-α-induced NF-kB signaling pathway.
그림 Fig. 5. Inhibitory effect of EAL on TNF-α-induced ROS production.

AI 본문요약
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문제 정의

TNF-α에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대한 우방자의 억제 효과를 확인하기 위한 실험을 진행하였다.
따라서 본 연구에서는 우방자 에탄올 추출물을 인간 탯줄유래 혈관내피세포에 전처리한 후 혈관 염증 억제 효과를 검증하고자 하였다. 식용과 한방에서도 사용해왔던 우방자에 대한 혈관 보호 효능을 검증하고 다양한 기전연구에 도움을 주고 더 나아가 폐경기 이후 여성뿐만 아니라 많은 사람들에게 심혈관질환 예방 및 치료를 위한 기초 한의학적 자료를 제공하는 데 그 목적이 있다.
본 연구에서는 우방자가 염증 조절 인자인 NF-κB의 활성화에 어떠한 영향을 미치는지에 대한 실험을 진행하였다.
따라서 본 연구에서는 우방자 에탄올 추출물을 인간 탯줄유래 혈관내피세포에 전처리한 후 혈관 염증 억제 효과를 검증하고자 하였다. 식용과 한방에서도 사용해왔던 우방자에 대한 혈관 보호 효능을 검증하고 다양한 기전연구에 도움을 주고 더 나아가 폐경기 이후 여성뿐만 아니라 많은 사람들에게 심혈관질환 예방 및 치료를 위한 기초 한의학적 자료를 제공하는 데 그 목적이 있다.
이에 본 연구는 인간 탯줄유래 혈관내피세포에서 대표적인 pro-inflammatory cytokine인 TNF-α에 의해 유도된 세포 부착인자 및 염증관련 전사인자인 NF-κB억제효과를 통하여 우방자 에탄올 추출물의 혈관염증 억제 효과 검증 및 그 기전에 대해 알아보았다.

제안 방법

1-10 μg/ml EAL or 50 μM EGCG for 30 min and then stimulated with 10 ng/ml TNF-α for 24 h. Cells were fixed with 1% paraformaldehyde and the cell surface expression of ICAM-1, VCAM-1, and E-selectin were analyzed by ELISA. Polyphenol such as EGCG was used as positive control.
ELISA 기법의 결과와 마찬가지로 TNF-α를 처리한 HUVEC에서 우방자에 의한 ICAM-1, VCAM-1, E-selectin의 발현 억제 정도를 확인하였다(Fig. 2).
HUVEC과 monocyte 부착율을 측정하기 위하여 HUVEC을 6-well culture plate에 분주한 후, 세포가 약 70% 정도 자라면 serum free 배지로 교체한 다음 우방자를 각 농도별로 30분간 전처리 후 TNF-α를 최종 농도 10 ng/ml이 되도록 가하여 24시간 배양하였다.
결과적으로, 이 실험에서는 TNF-α로 유도된 인간 탯줄유래 혈관내피세포 염증반응에서 우방자 에탄올 추출물의 ICAM-1,VCAM-1, 그리고 E-selectin과 같은 CAMs발현 및 NF-κB 활성에 대해 어떠한 영향을 미치는지 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, NP-40]를 넣어 15초간 vortexing한 후 ice에서 15분간 두었다. 그 후 12,000 rpm에서 5분간 원심 분리하여 세포질의 단백질이 포함되어있는 상층액을 tube에 옮겨 -70℃에서 보관하고, pellet에 buffer B [20 mM HEPES, pH 7.9, 25% glycerol, 0.42 M NaCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.2 mMEDTA, 0.5 mM DTT, 0.2 mM PMSF, protease inhibitor cocktail]을 넣고 10초간 vortexing한 후 매 10분마다 3회 vortexing하였다. 그 후 12,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 핵 단백질 부분을 포함하는 그 상층액을 새로운 tube에 옮겨 -70℃에서 보관하였다.
ROS/NF-κB 신호전달경로는 혈관 질환에 대한 염증 반응에 있어서 매우 중요한 조절 인자라고 알려져 있다. 따라서 혈관 내피세포에서의 활성산소 생성을 CM-H2DCFDA 염색을 통하여 측정하였으며 면역형광 염색을 통하여 시각화 하여 관찰하였다. 그 결과TNF-α에 의하여 유도된 활성산소의 생성은 현저하게 증가하였으며 이를 우방자 추출물이 완화시켜주는 것을 확인할 수 있었다.
혈관 내피 세포에 부착된 HL-60 세포는 fluorescence microscopy(Nikon Eclipse Ti, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다. 또한 측정한 후 0.1% SDS가 포함되어 있는 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)를 이용하여 세포를 용해시켜 spectrofluorometer(F-2500, Hitachi, Tokyo, Japan)를 사용하여 485 nm과 535 nm의 파장으로 부착율을 측정하였다.
먼저 우방자에 의한 혈관내피세포의 독성 및 세포 생존능력을 조사하여 세포보호효과를 확인하였다. MTT assay를 통해 혈관내피세포의 독성을 확인한 결과 10 μg/ml의 농도까지 세포 독성이 관찰되지 않았으나, 20 μg/ml 농도에서 세포독성이 증가함을 보였다.
배양 후 10 μl의 3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphen yltetrazolium bromide(MTT)을 첨가한 후 37℃, 5% CO2 배양기에 4시간 동안 반응 시킨 후 solubilization solution을 넣고 24시간 동안 배양한 후 ELISA reader(Infinite F200 pro, Tecan, Switzerland)를 이용하여 wave length 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.
세포 배양액을 제거한 다음 TNF-α와 함께 20 μM CM-H₂DCFDA를 넣은 다음 1시간 동안 배양하였다. 생성된 활성산소는 형광의 강도에 대한 수치로 나타내었으며 spectrofluorometer(F-2500, Hitachi, Tokyo, Japan)를 사용하여 485 nm과 535 nm의 파장으로 활성산소의 생성 정도를 측정하였다.
염증 반응을 조절하는 전사조절인자인NF-κB의 활성과 p-Iκbα 분해에 대한 우방자의 영향을 알아보기 위해 핵과 세포질을 분리하여 단백질 수준에서 발현 변화를 비교하였다.
우방자를 0.1, 0.5, 1, 5, 10 μg/ml을 각각 전처리 하였으며, 50 μM EGCG 역시 전처리한 후 TNF-α에 의하여 증가된 단핵백혈구의 세포 부착 정도를 형광현미경으로 관찰하였다(Fig. 3A).
우방자에 의한 세포부착인자의 발현감소를 확인하였으므로 혈관내피세포와 단핵구 세포와의 직접적인 부착여부를 알아보기 위하여 우방자를 세포에 30분 동안처리해 준 다음 TNF-α 자극을 24시간 주고 BCECF-AM을 이용하여 HL-60세포를 HUVEC에 분주하여 배양하였다.
우방자와 TNF-α를 처리한 HUVEC을 PBS로 2회 세척하고, RIPA buffer로 세포를 용해하여 단백질을 추출하였다.
우방자의 세포독성 여부를 확인하기 위해 HUVEC을 이용하여 세포독성을 확인하였다. HUVEC은 5×10³cells/100 μl의 농도로 96 well plate에 분주한 다음 24시간 후에 새로운 배지로 씻어내었다.
1-10 μg/ml의 농도로 전처리 하였을 때 농도 의존적으로 TNF-α 단독 처리 군에 비하여 adhesion molecule의 발현률이 감소하는 결과를 확인하였다(Table 1). 이 결과를 바탕으로 ICAM-1, VCAM-1, E-selectin 단백질 발현을 직접 확인하기 위하여 western blot을 실시하였다. ELISA 기법의 결과와 마찬가지로 TNF-α를 처리한 HUVEC에서 우방자에 의한 ICAM-1, VCAM-1, E-selectin의 발현 억제 정도를 확인하였다(Fig.
5×10⁵cells/ml로 분주하여 culture dish에서 10%FBS가 함유된 RPMI 1640 배지로 배양한 후 10 μM 2, 7-bis(2-carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein acetoxymethylester(BCECF-AM, Sigma, USA)으로 1시간 동안 염색하였다. 혈관 내피 세포에 부착된 HL-60 세포는 fluorescence microscopy(Nikon Eclipse Ti, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다. 또한 측정한 후 0.
혈관염증의 시작으로 알려진 세포부착인자의 발현율을 알아보기 위하여 ELISA기법을 이용하여 우방자가 adhesion molecule의 발현을 억제시키는 지의 여부를 확인하였다. ICAM-1, VCAM-1, E-selectin의 발현 증가는 TNF-α를 처리하였을 때 각각 50% 이상이 증가되는 것을 확인하였다.
형광 염색 탐침자인 CM-H₂DCFDA(Invitrogen, Oregon, USA)를 사용하여 ROS의 생성 정도를 측정하였다. 60 mm² dish culture plates에 혈관 내피 세포를 배양하고, 70% 정도 자라게 되면 우방자를 30분 동안 전 처리하였다.

대상 데이터

세포 배양 배지에 100 μl TMB single solution(Life technology, Carlsbad, CA, USA)을 각 well에 추가한 다음 배지의 색이 파란색으로 변하면 100 μl 1 NHCl를 넣어 반응을 중단하였다. 색이 노란색으로 변하게 되면 형광의 강도를 spectrofluorometer(Infinite F200 pro, Tecan, Switzerland)를 이용하여 495 nm 파장에서 측정하였다.
우방자(Herbarium voucher No. HBH071-01)는 전북 익산에서 구입하여 원광대학교 한의학전문대학원에서 정선하여 사용하였다. 우방자는 먼지 및 잡질을 제거하고, 상온에서 잘 건조시킨 후 다음 과정에 사용되었다.
인간 탯줄유래 혈관내피세포(HUVEC)는 American Type Culture Collection(ATCC)(CRL-2873; Manassas, VA, USA)에서 구입 하였으며, Human monocytic leukemia cell line(HL-60) 역시 ATCC(CCL-240)를 통하여 구입하여, 10%의 FBS가 포함되어 있는 RPMI 1640(Gibco, USA)에서 37℃, 5% CO₂의 농도 조건으로 배양하였다.

데이터처리

결과의 분석은 각 실험군 간의 평균치와 표준편차로 표시하였으며, 실험 결과의 통계처리는 Systat의 Sigma Plot version 10.0을 사용하여 Student's t-test를 통하여 p 값이 0.05 이하인 경우 유의한 차이로 판정하였다.

이론/모형

(A) Cell viability was measured was using the MTT assay. HUVEC were treated with various concentrations (0.
우방자와 TNF-α를 처리한 HUVEC을 PBS로 2회 세척하고, RIPA buffer로 세포를 용해하여 단백질을 추출하였다. 단백질 정량은 Bradford법을 이용하여 단백질의 동량을 10% sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)로 전기 영동하여 분리한 후 nitrocellulose membrane으로 transfer 하였다. 비특이적 항체 결합을 방지하기 위하여 BSA가 함유된 용액에 상온에서 1시간 동안 blocking 하였다.
우방자의 세포독성 범위를 확인하기 위하여 MTT assay 방법을 이용하여 세포독성을 확인하였다(Fig. 1). 우방자를 0.

성능/효과

ICAM-1, VCAM-1, E-selectin의 발현 증가는 TNF-α를 처리하였을 때 각각 50% 이상이 증가되는 것을 확인하였다.
MTT assay를 통해 혈관내피세포의 독성을 확인한 결과 10 μg/ml의 농도까지 세포 독성이 관찰되지 않았으나, 20 μg/ml 농도에서 세포독성이 증가함을 보였다.
Positive control로 강력한 항산화물질인 EGCG(Epigallocatechin Gallate)를 사용하였으며, EGCG 전처리에 의하여 TNF-α에 의한 ICAM-1, VCAM-1, E-selectin 발현 역시 억제하는 것으로 나타났다.
TNF-α에 의하여 증가된 단핵백혈구의 세포 부착 정도가 우방자 전처리 시 농도 의존적으로 TNF-α 단독 처리 군에 비하여 감소하는 결과를 얻을 수 있었다.
그 결과, TNF-α 자극에 의해 NF-κB 핵 내 단백질 발현이 증가되었고, 세포질 내 IκB-α의 발현은 감소하였다.
그 결과, TNF-α 자극은 핵 내부에서의 NF-κB 발현을 증가시켰고, 세포질에서의 IκB-α 발현을 감소시켰으나, 우방자가 이를 억제하는 것으로 나타났다.
그 결과TNF-α에 의하여 유도된 활성산소의 생성은 현저하게 증가하였으며 이를 우방자 추출물이 완화시켜주는 것을 확인할 수 있었다.
그러나 우방자를 0.1-10 μg/ml의 농도로 전처리 하였을 때 농도 의존적으로 TNF-α 단독 처리 군에 비하여 adhesion molecule의 발현률이 감소하는 결과를 확인하였다(Table 1).
MTT assay를 통해 혈관내피세포의 독성을 확인한 결과 10 μg/ml의 농도까지 세포 독성이 관찰되지 않았으나, 20 μg/ml 농도에서 세포독성이 증가함을 보였다. 그러므로 우방자의 세포 생존율에 영향을 미치지 않는 적절한 농도범위에서 실험을 수행하였으며 세포 독성을 통하여 혈관 염증 검증에 영향을 주지는 않는 것으로 나타났다.
특히 우방자를 10 μg/ml의 농도로 처리하였을 때는 positive control로 처리한 EGCG(50 μM) 수준까지 감소하는 경향을 확인하였다. 따라서 우방자 처리로 혈관내피세포의 ROS 소거능을 증가시켜 세포 내 ROS가 효과적으로 감소함을 확인할 수 있었다(Fig. 5).
또한 세포 수준에서의단백질 발현량을 측정하기 위해 westernblot을 시행한 결과, TNF-α를 단독 처리한 군에 비해 우방자를 전처리한 군에서ICAM-1, VCAM-1, 그리고 E-selectin단백질 발현이 이 유의성 있게 감소함을 보여주었다.
본 연구에서는 TNF-α(10 ng/ml) 처리에 의하여 증가된 세포부착인자 단백질 ICAM-1, VCAM-1,그리고 E-selectin의 발현이 우방자 전처리에 의해 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인 할 수 있었다.
실험 결과 TNF-α에 의해 증가된 ROS가 TNF-α 단독 처리군에 비하여 우방자의 농도 의존적으로 유의적인 감소 경향을 나타내었다.
이러한 결과는 우방자가 TNF-α로 유도된 NF-κB 핵 내 이동을 억제함으로써 염증신호전달 경로인 NF-κB 신호전달을 차단할 수 있음을 확인하였다.
이러한 결과로 보아 우방자는 IκB-α의 인산화 억제를 통해 NF-κB의 핵 내로이동 및 활성을 조절하는 것으로 예상되며 NF-κB의 활성화로 인한 여러 가지염증성 단백질의 발현을 억제하여 염증과정을 조절하는 것으로 사료된다.
이러한 실험 결과들로 보아 우방자가TNF-α로 유도된 VCAM-1, ICAM-1, 그리고 E-selectin의 발현을 조절함으로써 죽상경화증을 유발하는 혈관염증의 초기단계를 억제하여 항염증 작용에 효과를 가지고 있음을 알 수 있었다.
특히 10 μg/ml의 농도에서는 ICAM-1, VCAM-1, 그리고 E-selectin의 단백질 및 발현 모두 확실한 저해 효과를 나타내었으며 핵 내 NF-κB 활성과 ROS 생성 역시 현저하게 저해시키는 것을 알 수 있었다. 이런 결과들로 보아 우방자는 혈관 염증 및 혈관 합병증 예방 및 치료에 효과적일 수 있다고 사료된다. 특히 여성호르몬이 혈중 지질, 응고인자, 혈관 평활근세포와 내피세포 등에 미치는 영향이 알려져 있으며 이의 결핍으로 인한 폐경이 죽상동맥경화 병변의 발전에 직⋅간접적으로 기여할 것이라는 사실이 보편적으로 인정되고 있는 가운데식용이나 건강기능식품 또는 기타 다른 방식으로의 우방자 섭취는 임상에서 흔히 접할 수 있는 폐경기 여성의 심혈관계 질환 예방 및 치료에 효과적으로 활용 할 수 있을 것으로 판단된다.
특히 10 μg/ml의 농도에서는 ICAM-1, VCAM-1, 그리고 E-selectin의 단백질 및 발현 모두 확실한 저해 효과를 나타내었으며 핵 내 NF-κB 활성과 ROS 생성 역시 현저하게 저해시키는 것을 알 수 있었다.
특히 우방자를 10 μg/ml의 농도로 처리하였을 때는 positive control로 처리한 EGCG(50 μM) 수준까지 감소하는 경향을 확인하였다.
혈관내피세포와 단핵구 세포의 직접적인 부착정도를 알아본 결과,TNF-α에 의한 세포부착이 현저하게 증가하였으며 이러한 부착정도가 우방자에 의해 농도의존적으로 감소함을 확인하였다.

후속연구

한약재와 같은 천연소재로부터 치료제를 발굴할 경우 부작용이 적고 안전성이 높기 때문에 좋은 개발 후보 물질이 되리라 예상된다. 따라서 본 연구를 통해 우방자가 혈관 염증 조절을 통해 심혈관계 질환 진행에 있어서 보호효과의 가능성을 알 수 있었으며, 향후 세부작용기전 및 임상적 효능을 위한추가연구를 통해 부작용이 없는 심혈관질환 치료제 소재로 개발될 가치가 매우 높을 것으로 사료된다.
특히 여성호르몬이 혈중 지질, 응고인자, 혈관 평활근세포와 내피세포 등에 미치는 영향이 알려져 있으며 이의 결핍으로 인한 폐경이 죽상동맥경화 병변의 발전에 직⋅간접적으로 기여할 것이라는 사실이 보편적으로 인정되고 있는 가운데식용이나 건강기능식품 또는 기타 다른 방식으로의 우방자 섭취는 임상에서 흔히 접할 수 있는 폐경기 여성의 심혈관계 질환 예방 및 치료에 효과적으로 활용 할 수 있을 것으로 판단된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Nuclear factor-kappa B(NF-κB)의 역할은?	Nuclear factor-kappa B(NF-κB)는 전형적으로 inhibitory kappa B(IκB)에 의하여 억제되는 다양한 종류의 염증반응 조절 인자들의 발현을 증가시킴으로써 염증 반응에서 매우 중요한 역할을 수행한다6). NF-κB는 박테리아의 lipopolysaccharide(LPS)외에도 reactive oxygen species, oxidized lipoproteins, TNF-α나 IL-1과 같은 염증성 사이토카인들에 의하여 활성화된다7).
	NF-κB 활성의 저해는 어떠한 영향을 끼치는가?	NF-κB는 자극을 받지 않는 안정시에는 IκB-α와 결합하여 불활성화 상태로 세포질에 존재하다가 TNF-α와 같은 사이토카인의 자극을 받으면 인산화에 의해서 활성화되어 세포질에서 핵으로의 이동을 유도하게 된다. 따라서 NF-κB 활성의 저해는 잠재적으로 혈관 염증 작용을 억제할 수 있다8-10). 그러므로 이러한 심혈관계 질환과 여러 가지 합병증을 유발하는 혈관성 염증을 억제할 수 있는 안전하고 효과가 좋은 혈관성 염증 억제제를 천연물로부터 개발하고자 많은 연구가 진행되고 있다.
	우엉의 성질과 맛은 어떠한가?	우방자(Arctium lappa Linne, 牛蒡子)는 국화과(Compositae)에 속하는 다년생 풀인 우엉의 여문 씨를 말린 것으로, ≪대한민국약전≫에는 우방자를 “우엉의 잘익은 열매”로 등재하고 있다. 성질은 평(平)하고, 맛은 맵고 독이 없다. 한방에서는 소산풍열(疏散風熱), 선폐투진(宣肺透疹), 해독인후(解毒利咽) 등 작용이 있다하여 감모(感冒), 인후종통(咽喉腫痛), 마진(麻疹) 등에 사용한다.

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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