[논문]연골세포 및 관절연골의 노화 과정에서 세포내 항산화 인자들의 변화

김강미; 김윤재; 김종민; 손동현; 박영철

doi:10.5352/jls.2019.29.8.888

초록
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류마티스관절염(rheumatoid arthritis)과 골관절염(osteoarthritis) 같은 관절질환은 연골세포(chondrocytes) 감소와 관절연골(articular cartilage)의 분해를 수반한다. 최근, 연골세포의 활성과 연골 항상성(cartilage homeostasis)에 염증성 ROS (reactive oxygen species) burst 및 나이와 관련된 산화적 스트레스(oxidative stress)의 증가와 관련된 연구가 활발히 진행되고 있다. 본 연구는 관절연골로부터 분리한 연골세포의 노화 과정과 나이대별 관절연골에서 항산화 인자들(antioxidants)의 변화를 조사함으로써, 연골세포와 관절연골의 노화 과정 동안 산화적 스트레스로부터 조직을 보호하는 항산화 인자들의 역할을 규명하는데 목적이 있다. 쥐의 관절연골로부터 분리한 연골세포의 연속 계대배양을 통한 노화 과정에서 산화적 스트레스가 증가함을 관찰하였다. 그리고, 노화 유도한 연골세포는 세포내 총 glutathione (GSSG/GSH) 양과 항산화 효소 superoxide dismutase (SOD)와 heme oxygenase-1 (HO-1)의 발현이 증가하였다. 다음으로, 나이대별 쥐로부터 분리한 관절연골에서 항산화 인자의 발현을 분석하였다. 항산화 인자 glutathione의 양은 40주령에서 발현이 가장 높게 관찰되었으며 72주령에 다소 감소하였고, SOD와 HO-1의 발현은 나이대별로 현저히 증가되는 경향을 보였다. 이를 종합해 볼 때, 세포내 항산화 인자들은 과도한 양의 ROS에 반응하여 연골세포의 노화와 나이와 관련된 관절연골의 퇴화 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 보인다.

Abstract ▼ AI-Helper

Cartilage diseases, such as rheumatoid arthritis (RA) and osteoarthritis (OA), are associated with the loss of chondrocytes and degradation of articular cartilage. Recent studies revealed that inflammatory reactive oxygen species (ROS) and age-related oxidative stress can affect chondrocyte activity...

Cartilage diseases, such as rheumatoid arthritis (RA) and osteoarthritis (OA), are associated with the loss of chondrocytes and degradation of articular cartilage. Recent studies revealed that inflammatory reactive oxygen species (ROS) and age-related oxidative stress can affect chondrocyte activity and cartilage homeostasis. We investigated changes in the levels of intracellular antioxidants during cellular senescence of primary chondrocytes from rat articular cartilages. Cellular senescence was induced by serial subculture (passages 0, 2, 4, and 8) of chondrocytes and measured using specific senescence-associated ${\beta}$-galactosidase ($SA-{\beta}-gal$) staining. ROS production increased significantly in the senescent chondrocytes. In addition, total glutathione (GSSG/GSH) and superoxide dismutase (SOD) levels and heme oxygenase-1 (HO-1) expression increased in senescent chondrocytes induced by serial subculture. Analysis of changes in intracellular antioxidant levels in articular cartilage from rats of different ages (5, 25, 40, and 72 wk) revealed that total glutathione levels were highest after 40 wk and slightly decreased after 72 wk as compared with those after 25 wk. SOD and HO-1 expression levels increased in accordance with age. Based on these results, we conclude that intracellular antioxidants may be associated with cartilage protection against excessive oxidative stress in the process of chondrocyte senescence and age-related cartilage degeneration in an animal model.

주제어

표/그림 (6)

그림 Fig. 1. Induction of cellular senescence by serial subculture in ariticular chondrocytes. Rat primary articular chondrocytes were serially subcultured up to P6. Cellular senescence was measured using SA-β-gal activity assay. (A) Percentages of senescent cells were calculated from numbers of blue-stained cells per 200 cells in randomly selected areas. *p<0.05 and **p<0.01 vs. P0 cells. (B) Chondrocyte images were captured at x20 magnification.
그림 Fig. 2. Generation of ROS by serial subculture in ariticular chondrocytes. As indicated, the cells were incubated with 10 μM H₂DCF-DA for 10 min, and intracellular levels of ROS were determined by confocal microscopy.
그림 Fig. 3. Changes of total glutathione (GSSG/GSH) by serial subculture in chondrocytes. Cells were washed and homogenized with glass pestle in 0.5% MPA solution. Intracellular glutathione levels were determined in the supernatants from each cell homogenates using total glutathione assay kit. The results are presented as the means of ± SDs of triplicate cultures.
그림 Fig. 4. Detection of SOD and HO-1 expression by serial subculture in chondrocytes. (A) Whole cell lysates were analyzed by Western blotting using specific antibodies against SOD and HO-1. b-Actin was used as an internal control to monitor equal protein loading. (B) Chondrocytes were fixed and reacted with specific antibodies against SOD and HO-1 for immunofluorescence staining.
그림 Fig. 5. Changes of total glutathione (GSSG/GSH) during aging in rat articular cartilages. Articular cartilages were isolated from different aged rats, as indicated. The tissues were washed and homogenized with glass pestle in 0.5% MPA solution. Intracellular glutathione levels were determined in the supernatants from each tissue homogenates. The results are presented as the means of ± SDs of triplicate experiments.
그림 Fig. 6. Detection of SOD expression during aging in rat articular cartilages. The results of hematoxylin and eosin (H&E) staining and immunohistochemical staining of anti-SOD antibody are shown. Magnification is 200x or 400x.

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서 관절연골로부터 분리한 chondrocytes의 노화와 쥐의 나이대별 관절연골로부터 세포내 항산화 인자들의 발현을 조사하였다. 이는 염증성 reactive oxygen species (ROS) burst와 나이와 관련된 산화적 스트레스의 증가가 chondrocytes의 기능과 관절 항상성에 영향을 미치는 것을 규명하는데 도움을 줄 것으로 생각한다.

제안 방법

노화된 세포에서 증가하는 항산화 인자들이 쥐의 관절조직에서도 발현이 증가하는지를 분석하고자 쥐의 나이대별 관절연골을 분리하여 총 glutathione, SOD, HO-1의 양을 조사하였다. 주령이 5, 25, 40, 72인 female Sprague-Dawley rats에서 무릎관절의 연골을 분리한 후 연골조직에 존재하는 glutathione (GSSG/GSH)의 정량은 100 mg 조직을 사용하여 균질 화한 후 total glutathione assay kit를 이용하였고, 항산화 효소 SOD와 HO-1의 발현은 관절연골의 고정과 decalcification 과정을 거친 후 immunohistochemistry staining 방법으로 조사 하였다.
다음으로, 노화과정동안 산화적 스트레스로부터 세포를 보호하는 항산화 인자들의 변화를 조사하였다. 연속 계대배양을 통해 얻은 chondrocytes에서 세포내 존재하는 총 glutathione (GSSG/GSH)의 양을 조사한 결과, P6 세포에서 크게 증가함을 보였다(Fig.
세포노화에 따른 세포내 산화적 스트레스의 변화를 측정하기 위하여, ROS에 반응하는 DCF의 형광을 이용하여 chondrocytes 내 ROS의 양을 측정하였다. P0와 연속 계대배양을 통해 얻은 P2, P4, P6 chondrocytes를 35-mm dish에 분주한 뒤 10% FBS를 포함하는 DMEM 배양액에서 24시간 동안 배양한 후 ROS-sensitive fluorophore인 H₂DCF-DA를 첨가하고 confocal microscope를 사용하여 형광을 측정하였다.
본 연구자는 선행연구에서 배양중인 chondrocytes의 연속 계대배양은 세포노화를 유도한다는 결과를 발표하였다[17]. 쥐의 관절연골로부터 분리한 chondrocytes를 연속 계대배양을 진행하였고, SA-β-gal staining 방법을 이용하여 각 다른 passage의 chondrocytes에서 세포노화의 정도를 분석하였다. 연속 계대배양한 chondrocytes의 passage 수가 증가할수록 SA-β-gal로 염색되는 수가 증가하였다(Fig.

대상 데이터

Chondrocytes는 5주된 female Sprague-Dawley rats (Samtako BioKorea, Osan, Korea)로부터 knee joint cartilage (무릎관절의 연골)를 분리하여 슬라이스를 만든 후 1시간 동안 효소(0.2% type II collagenase in DMEM) 처리를 통하여 분리하였다. 원심분리 후 얻은 chondrocytes는 5×10⁴ cells/cm² 밀도로 culture dishes에서 10% heat-inactivated FBS와 antibiotics (50 U/ml penicillin, 50 μg/ml streptomycin)를 포함하는 DMEM 배양액에서 5% CO₂ /air atmosphere 조건에서 37℃ incubator에서 배양하였다.
(Carlsbad, CA, USA) 제품을 사용하였다. Horse radish peroxidase (HRP)가 부착되어 있는 이차 항체와 enhanced chemiluminescence (ECL) Western blotting kit는 Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ, USA) 제품을 사용하였다.

데이터처리

모든 실험은 적어도 세번 이상 반복하여 결과를 means ± standard deviations (SD)로 표현하였다. One-way analysis는 GraphPad Prism software (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)를 이용하여 분석하였고, p-value<0.05를 구하여 통계적 유의성을 검증하였다.
모든 실험은 적어도 세번 이상 반복하여 결과를 means ± standard deviations (SD)로 표현하였다. One-way analysis는 GraphPad Prism software (GraphPad Software, Inc.

성능/효과

이는 증가된 항산화 인자가 산화적 스트레스로부터 세포와 조직을 보호하는 역할을 한다는 것을 의미한다. 하지만, 72주령의 관절연골은 퇴화가 너무 진행되어 있음을 관찰할 수 있고, 아울러 총 glutathione 양도 유의하게 감소하는 경향을 보였다. 향후 실험에서, 5주령과 40주령의 사이의 나이대별 관절연골을 좀 더 세분화해서 세밀하게 조사할 필요가 있다고 여겨진다.
노화 유도한 chondrocytes는 세포내 총 glutathione 양과 항산화 효소 SOD 및 HO-1의 발현이 증가하였다. 나이대별 쥐로부터 분리한 관절연골에서 항산화 인자 glutathione의 양은 40주령에서 발현이 가장 높게 관찰되었으며 72주령에 다소 감소하였고, SOD와 HO-1의 발현은 나이대별로 증가하는 경향을 보였다. 이는 증가된 항산화 인자가 산화적 스트레스로부터 세포와 조직을 보호하는 역할을 한다는 것을 의미한다.
본 연구에서 chondrocytes의 세포노화 과정 및 쥐의 나이대별 관절연골로부터 chondrocytes의 세포내 항산화 인자의 발현을 분석하였다. 노화 유도한 chondrocytes는 세포내 총 glutathione 양과 항산화 효소 SOD 및 HO-1의 발현이 증가하였다. 나이대별 쥐로부터 분리한 관절연골에서 항산화 인자 glutathione의 양은 40주령에서 발현이 가장 높게 관찰되었으며 72주령에 다소 감소하였고, SOD와 HO-1의 발현은 나이대별로 증가하는 경향을 보였다.

후속연구

향후 실험에서, 5주령과 40주령의 사이의 나이대별 관절연골을 좀 더 세분화해서 세밀하게 조사할 필요가 있다고 여겨진다. 이런 연구결과들의 축적은 세포 외 기질의 분비와 관절연골 항상성 유지를 위한 chondrocytes의 활성 조절을 가능하게 하고, 이를 이용한 염증성 및 퇴행성 관절질환의 치료적 접근을 위한 기초적 정보를 제공할 것으로 생각한다.
하지만, 72주령의 관절연골은 퇴화가 너무 진행되어 있음을 관찰할 수 있고, 아울러 총 glutathione 양도 유의하게 감소하는 경향을 보였다. 향후 실험에서, 5주령과 40주령의 사이의 나이대별 관절연골을 좀 더 세분화해서 세밀하게 조사할 필요가 있다고 여겨진다. 이런 연구결과들의 축적은 세포 외 기질의 분비와 관절연골 항상성 유지를 위한 chondrocytes의 활성 조절을 가능하게 하고, 이를 이용한 염증성 및 퇴행성 관절질환의 치료적 접근을 위한 기초적 정보를 제공할 것으로 생각한다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	염증성 질환과 관련된 병리적 조건에서 ROS의 과도한 증가 및 항산화 인자의 결여는 관절연골에 어떤 영향을 미치는가?	또한, 연구자들은 염증성 질환과 관련된 병리적 조건에서 ROS의 과도한 증가뿐 아니라 항산화 인자의 결여가 관찰된다는 것을 보고하였다[21]. 이는 다양한 염증성 물질의 분비를 촉진하고 세포 외 기질을 파괴하는 MMPs의 발현도 증가시켜 관절연골의 손상을 일으키게 한다. 게다가 관절연골에 존재하는 chondrocytes의 노화와 세포사망(apoptosis)을 촉진하여 관절연골의 항상성을 깨고 궁극적으로 관절의 손상을 일으키게 된다. 한편, chondrocytes는 이러한 ROS의 독성에 맞서기 위해 SOD, catalase, glutathione peroxidase (GPX) 뿐 아니라 HO-1 등을 포함하는 정교하게 조직화된 항산화 효소계를 가지고 있다[2, 5, 14].
	관절질환은 연골세포와 관절연골에 어떤 영향을 미치는가?	류마티스관절염(rheumatoid arthritis)과 골관절염(osteoarthritis) 같은 관절질환은 연골세포(chondrocytes) 감소와 관절연골(articular cartilage)의 분해를 수반한다. 최근, 연골세포의 활성과 연골 항상성(cartilage homeostasis)에 염증성 ROS (reactive oxygen species) burst 및 나이와 관련된 산화적 스트레스(oxidative stress)의 증가와 관련된 연구가 활발히 진행되고 있다.
	Chondrocytes는 무엇인가?	Chondrocytes (연골세포)는 관절연골에 존재하는 유일한 세포로서 synovial fluid로부터 외부 화학적 신호와 영양분을 공급받아 세포 외 기질을 생산하고 유지하는 역할을 담당한다[8, 32]. 즉, chondrocytes는 세포 외 기질을 생산하는 합성경로와 다양한 matrix metalloproteinases (MMPs)의 활성에 의한 세포 외 기질의 제거에 관여하는 분해경로의 균형을 유지하는데 관여한다.

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