[논문]제주지역 망아지에서 Rhodococcus equi 감염증의 병리학적 특징

송경옥; 양형석; 손원근; 김재훈

doi:10.14405/kjvr.2019.59.3.141

제주지역 망아지에서 Rhodococcus equi 감염증의 병리학적 특징
Pathologic characteristics for the Rhodococcus equi infection in foals in Jeju 원문보기

Korean journal of veterinary research = 대한수의학회지, v.59 no.3, 2019년, pp.141 - 149

송경옥 (제주특별자치도 동물방역과) , 양형석 (제주특별자치도 동물위생시험소) , 손원근 (제주대학교 수의과대학 및 수의과학연구소) , 김재훈 (제주대학교 수의과대학 및 수의과학연구소)

Abstract ▼ AI-Helper

From 1996 to 2014, 14 foals from nine farms in Jeju were diagnosed with a Rhodococcus equi infection. Clinically, most foals showed characteristic respiratory signs, including hyperthermia and dyspnea. The seasonal occurrence of R. equi infection in foals was higher in summer, such as June (eight foals; 57.1%) and July (four foals; 28.6%), than in the other seasons. The major cases of R. equi infections were observed among two-month-old (eight foals; 57.1%) and three-month-old (three foals; 21.4%) foals. Histopathologically, bronchopneumonia, abscess, and granulomatous pneumonia were the most prevalent lesions in the lungs of foals. Colonic ulcers and submucosal abscesses were found in a foal. Some foals showed granulomatous lymphadenitis and abscesses in the mesenteric and other lymph nodes. According to the polymerase chain reaction using 10 tissue samples of foals and nine R. equi isolates, the vapA gene was detected in 11/11 (100%) foals. Immunohistochemical staining using the anti-VapA monoclonal antibody was applied to detect the R. equi VapA antigen in the organs of foals. R. equi VapA antigens were demonstrated in most lungs and some mesenteric and hilar lymph nodes of 13 foals. Isolated virulent R. equi VapA bacteria showed high sensitivity to gentamicin, quinolones, rifampin, and vancomycin.

주제어

표/그림 (9)

표 Table 1. Tested internal tissues and samples of foals
그림 Fig. 1. Gross findings.
표 Table 2. Gross findings for foals infected with Rhodococcus equi
그림 Fig. 2. Histopathologic findings.
표 Table 3. Histopathologic findings of foals infected with Rhodococcus equi
그림 Fig. 3. (A) Isolated mucoid and salmon-pink colonies on blood agar were confirmed as Gram-positive coccobacilli (B). (C) PCR products of VapA (PC, VapA positive control; Lane M, 100 bp DNA ladder; NC, negative control; lane 1, isolated bacterial colony; lane 2, pulmonary exudates from case No. 14 foal).
표 Table 4. Immunohistochemical results of VapA antigen expression in the internal tissues of foals in comparison with the results of PCR
그림 Fig. 4. Immunohistochemistry.
표 Table 5. Results of the antimicrobial susceptibility for Rhodococcus equi isolates from foals

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구는 제주지역 말 사육목장에서 발생한 망아지 R.equi 감염증의 병리조직학적 특징을 파악하고 병변 형성에 관여하는 균체의 유전자형을 규명함과 동시에 면역조직화학적 검사를 통해 내부 실질 장기 병변에서 R. equi 병독성 균주 VapA 단백질의 존재를 확인하고자 실시하였다.

제안 방법

5 µL/mL in DW)으로 염색하였다. UV transilluminator 로 R. equi vapA 유전자에 대한 특이적인 564 bp의 밴드 유무를 확인하였으며, 증폭산물의 크기를 확인하기 위하여 100 bp DNA ladder (Bioneer, Korea)를 마커로 사용하였다.
각 조직을 4–5 µm 두께로 절편하여 silane 코팅 슬라이드에 부착한 후, 탈파라핀 및 함수과정을 거쳤다.
고정된 조직은 통상적인 조직 처리과정에 따라 파라핀 포매하여 3-4 μm로 절편을 제작하여 hematoxylin and eosin (H&E) 염색을 실시하였다.
균체는 0.5 McFarland 혼탁도를 기준으로 조정하여 혈액배지에 접종균액을 멸균멸봉으로 배지 전체에 균질하게 도말한 다음 항생제 디스크를 배지표면에 부착시키고 37°C에서 48시간 배양하였으며, 디스크 주위에 형성된 억제대의 직경으로 감수성 여부를 판정하였다.
고정된 조직은 통상적인 조직 처리과정에 따라 파라핀 포매하여 3-4 μm로 절편을 제작하여 hematoxylin and eosin (H&E) 염색을 실시하였다. 또한 조직 병변 내 세균의 감염 여부 확인 및 다른 질병과의 감별진단을 위한 특수염색으로 Gram, Periodic Acid-Schiff (PAS) 및 Ziehl-Neelsen 염색을 실시하였다.
부검축 13마리 중 −70 o C에 보관되어 있던 10마리의 폐장 등 신선 생조직에서 QIAamp DNA mini kit (Qiagen, Germany)를 이용하여 DNA를 추출하였다.
부검축 13마리에서 병변이 확인 된 폐장, 대장 및 장간막 림프절과 환축 1마리의 기관 삼출물로부터 원인균을 분리하기 위해 무균적으로 시료를 채취하여 혈액배지와 MacConkey agar에 접종하여 37^oC에서 48시간 동안 호기배양하였다.
분리 세균 또는 조직에서 추출한 DNA 2 µL와 각각의 primer 0.5 µL (20 pmol) 및 DNase RNase free distilled water 17 µL를 AccuPower HotStart PCR PreMix (Bioneer K-5050, Korea)에 첨가하여 최종 반응 용량이 20 µL가 되도록 하였다.
일차 항체로는 mouse monoclonal anti-VapA (Mab 10G5) antibody (Kitasato University, Japan)를 사용하였으며 antibody diluent solution (Dako, USA)에 1:5,000의 농도로 희석한 다음 조직 절편에 적하하여 37°C에서 1시간 처리한 다음 이차 항체에 40분간 반응시켰다.
폐사되어 의뢰된 13마리의 망아지는 일반적인 절차에 따라 부검을 수행하여 외관검사 및 내부장기의 육안병변을 확인하였다. 폐장, 심장, 간장, 비장, 신장, 림프절, 소화기계 등의 내부장기를 채취하였고, 10% 중성완충포르말린에 고정하였다.
폐장 병변 및 기관 삼출물에서 분리되어 −70°C에 보관 중이던 9개의 R. equi 균주를 혈액배지에 재도말하여 증식된 신선한 세균집락으로부터 핵산을 추출하였다.
폐장 병변 및 기관 삼출물에서 분리된 9개의 R. equi 균체에 대하여 항생제 감수성 검사를 실시하였다. 항생제 감수성 디스크는 BBL사 제품으로 chloramphenicol, streptomycin, sulfamethoxazol/trimethoprim, tetracycline, vancomycin, ciprofloxacin, amoxicillin/clavulanic acid, gentamicin, oxytetracycline, kanamycin, cefazolin, rifampin과 Oxoid사제품으로 ceftiofur, penicillin G, erythromycin, ampicillin, neomycin, enrofloxacin 등 총 18종의 항생제를 사용하였으며, 감수성 여부는 각각의 제조회사에서 제시한 감수성 판정기준을 따랐다.

대상 데이터

공시재료

공시동물은 1996년부터 2014년까지 제주도내 9개 말 사육 목장으로부터 제주대학교 수의병리학교실 및 제주특별자치도 동물위생시험소에 병성감정 의뢰된 망아지를 대상으로 하였다. 그 중 조직검사, 세균배양 검사 및 중합효소연쇄반응법에 의해 R.
공시동물은 1996년부터 2014년까지 제주도내 9개 말 사육 목장으로부터 제주대학교 수의병리학교실 및 제주특별자치도 동물위생시험소에 병성감정 의뢰된 망아지를 대상으로 하였다. 그 중 조직검사, 세균배양 검사 및 중합효소연쇄반응법에 의해 R. equi 감염증으로 진단된 13마리의 부검축과 1마리의 기관 삼출물 등 총 14마리의 망아지 시료를 실험에 공여하였다. 각 개체에 대한 검사시료 세부내역은 Table 1과 같다.
따라서 장간막 또는 결장 관련 림프절이 종창되고 조직학적으로 농양과 육아종을 형성한다[15]. 본 실험에서도 1마리의 결장에서 궤양과 농양이 관찰되었고 결장 내 농양은 GALT를 중심으로 분포하고 있었다. 또한 66.
C에 보관되어 있던 10마리의 폐장 등 신선 생조직에서 QIAamp DNA mini kit (Qiagen, Germany)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출 시료는 냉동 보관된 생조직과 DNase RNase free distilled water (Invitrogen, USA)를 1:10 비율로 혼합하여 균질화 시킨 후상층액을 이용하였다. 1.
폐사되어 의뢰된 13마리의 망아지는 일반적인 절차에 따라 부검을 수행하여 외관검사 및 내부장기의 육안병변을 확인하였다. 폐장, 심장, 간장, 비장, 신장, 림프절, 소화기계 등의 내부장기를 채취하였고, 10% 중성완충포르말린에 고정하였다. 고정된 조직은 통상적인 조직 처리과정에 따라 파라핀 포매하여 3-4 μm로 절편을 제작하여 hematoxylin and eosin (H&E) 염색을 실시하였다.
equi 감염 시 주된 병변은 폐장에서 관찰되었으며 기관지폐렴, 농양 및 화농육아종성 폐렴 등의 세 가지 병변이 단독보다는 혼재되어 분포하고 있었다(Table 3). 폐장의 기관지 및 폐포강 내에 중성호성 백혈구와 단핵세포들이 침윤되어 있는 기관지폐렴이 9마리에서 관찰되었다. 또한 변성 또는 붕괴된 중성호성 백혈구로 구성된 폐농양(Fig.
equi 균체에 대하여 항생제 감수성 검사를 실시하였다. 항생제 감수성 디스크는 BBL사 제품으로 chloramphenicol, streptomycin, sulfamethoxazol/trimethoprim, tetracycline, vancomycin, ciprofloxacin, amoxicillin/clavulanic acid, gentamicin, oxytetracycline, kanamycin, cefazolin, rifampin과 Oxoid사제품으로 ceftiofur, penicillin G, erythromycin, ampicillin, neomycin, enrofloxacin 등 총 18종의 항생제를 사용하였으며, 감수성 여부는 각각의 제조회사에서 제시한 감수성 판정기준을 따랐다. 균체는 0.

이론/모형

R. equi 균주의 병독성 vapA 유전자 검출을 위한 primer 는 Takai 등[11,12]의 방법에 따라 forward primer (5′-GACTCTTCACAAGACGGT-3′) 및 reverse primer (5′-TAG GCG TTG TGC CAG CTA-3′)를 제작하여 이용하였다.
본 연구에서 조직 내 R. equi의 VapA 항원을 확인하기 위하여 IHC에 이용된 단클론항체는 Takai 등[18]에 의해 개발되었다. 이후 Madarame 등[19]은 IHC 기법을 이용하여 폐장의 농양 부위에 침윤된 큰포식세포와 다핵거대세포의 세포질에 VapA 항원이 주로 분포하고 있음을 보고하였다.
부검축 13마리의 조직 내에서 VapA 항원의 분포를 조사 하고 R. equi 감염에 따른 세포학적 변화상을 확인하기 위하여 Envision polymer reagent (Dako, Denmark) 방법으로 IHC를 수행하였다. 각 조직을 4–5 µm 두께로 절편하여 silane 코팅 슬라이드에 부착한 후, 탈파라핀 및 함수과정을 거쳤다.

성능/효과

IHC 기법을 이용하여 VapA 항원의 조직 내 발현 양상을 검사한 결과 폐장(92.3%)과 장간막 림프절(66.7%)에서는 항원 발현이 높은 반면 기타 림프절(25.0%)과 대장(14.3%)에서는 낮게 검출되었다(Table 4). VapA 항원은 폐장, 장간막 림프절 및 대장의 농양 병소와 육아종성 염증 병변에 침윤된 큰포식세포와 다핵거대세포의 세포질 내에서 관찰되었다 (Fig.
equi에 감염된 망아지들은 고열을 동반한 식욕저하, 호흡곤란, 비루, 기침 등의 호흡기 증상을 보였다. R. equi에 감염된 14마리에 대하여 계절별 및 연령별 발생 시기를 분석한 결과 계절적으로는 6월이 가장 많은 8마리 (57.1%), 7월이 4마리(28.6%), 5월 및 8월이 각각 1마리 (7.1%) 순으로 나타났다.
R. equi에 감염된 망아지의 육안병변으로 폐장에 농양소견이 부검축 13마리 중 12마리(92.3%)에서 확인되어 가장 빈번하였다(Table 2). 폐 농양은 주로 전복측엽 내지 후배측엽에 1–10 cm의 융기된 유백색 결절성 병소가 국소 다발성으로 관찰되었고(Fig.
병리 조직학적으로 폐장 병변의 유형을 세분하여 관찰한 결과 기관지폐렴, 화농육아종성 폐렴 및 농양 등 3가지 소견으로 구분되었다. 각 개체는 한 가지의 폐 병변이 독립적으로 존재하기 보다는 주로 세 가지 병변이 혼재되어 나타났고 초기 변화상인 기관지폐렴에서 만성의 화농육아종성폐렴으로 진행 되는 양상을 보였다. R.
equi 9개 균체를 대상으로 항생제 감수성 여부를 검사한 결과 가장 효과적인 항생제로는 amoxicillin/ clavulanic acid, ceftiofur, gentamicin, neomycin, quinolones 계열, rifampin, vancomycin임을 알 수 있었다. 그러나 sulfamethoxazol/trimethoprim, tetracycline 계열 및 cefazolin에는 강한 내성을 가지는 것으로 확인되었다(Table 5).
본 실험에서도 1마리의 결장에서 궤양과 농양이 관찰되었고 결장 내 농양은 GALT를 중심으로 분포하고 있었다. 또한 66.7% (4/6)의 장간막 림프절에서 중성호성 백혈구로 구성된 농양과 함께 단핵세포와 다핵거대세포가 침윤된 육아종성 림프절염이 확인되어 전형적인 장염형 R. equi 감염임을 확인할 수 있었다.
equi에 감염된 망아지에서는 육안적으로 폐장의 농양이 가장 많이 나타났으며 주로 전복측엽 내지 후배측엽에 융기된 유백색의 결절성 병소가 국소 다발성으로 관찰되었다. 병리 조직학적으로 폐장 병변의 유형을 세분하여 관찰한 결과 기관지폐렴, 화농육아종성 폐렴 및 농양 등 3가지 소견으로 구분되었다. 각 개체는 한 가지의 폐 병변이 독립적으로 존재하기 보다는 주로 세 가지 병변이 혼재되어 나타났고 초기 변화상인 기관지폐렴에서 만성의 화농육아종성폐렴으로 진행 되는 양상을 보였다.
감염된 균체로 인해 화농성 기관지폐렴이 유발되어 농양으로 진행 되고 시간이 지나면서 점차 만성화되어 화농육아종성 결절로 변형되며 일부의 병소들은 서로 융합하여 건락성 삼출물을 포함한 큰 결절들을 형성할 수도 있다[4]. 본 실험에서 R. equi에 감염된 망아지에서는 육안적으로 폐장의 농양이 가장 많이 나타났으며 주로 전복측엽 내지 후배측엽에 융기된 유백색의 결절성 병소가 국소 다발성으로 관찰되었다. 병리 조직학적으로 폐장 병변의 유형을 세분하여 관찰한 결과 기관지폐렴, 화농육아종성 폐렴 및 농양 등 3가지 소견으로 구분되었다.
본 연구에서 분리된 R. equi 9개 균주들이 가지는 항생제 감수성은 제주도 분리 균주[20] 및 경인 지역 분리 균주[10] 와 대체로 유사한 것으로 확인되었다. 그러나 kanamycin, penicillin 제제 및 streptomycin항생제에는 중등도의 감수성을 나타내고 있었다.
본 연구에서는 R. equi에 감염된 총 14마리의 망아지에 대하여 질병 발생 시기를 분석한 바, 계절적으로는 온도가 높아지는 6–7월(85.7%)에 개체의 연령별로는 모체이행항체가 떨어지는 시기인 생후 2–3개월령(78.5%)에서 주로 발생 하는 양상을 보였다.
장 병변의 경우에도 살모넬라균체, cyathostomes (small strongylus) 및 Listeria monocytogenes가 혼합 감염된 말에서 유사한 장점막 궤양과 육아종성 장염이 발생되어 이러한 질병과도 감별이 필요할 것으로 생각된다[17]. 본 연구에서는 세균배양검사, PCR, 병리조직 특수염색, IHC 검사 등을 통하여 R. equi 감염증으로 최종 진단되었다. 특히 특수 염색과 IHC를 통하여 큰포식세포와 다핵거대세포의 세포질에 감염되어 있는 편성 세포내 기생성 세균인 R.
부검축 13마리 중 −70°C에 보관되어 있던 10마리의 폐장을 포함한 신선 조직과 분리된 9개의 R. equi 균주의 유전자형을 확인하기 위한 PCR 검사 결과 검사한 시료 모두에서 564 bp의 특이 밴드가 검출되어 총 11마리에서 vapA 유전자(Fig. 3C)가 확인되었다.
부검축 13마리에 대한 병리조직학적 검사 결과, R. equi 감염 시 주된 병변은 폐장에서 관찰되었으며 기관지폐렴, 농양 및 화농육아종성 폐렴 등의 세 가지 병변이 단독보다는 혼재되어 분포하고 있었다(Table 3). 폐장의 기관지 및 폐포강 내에 중성호성 백혈구와 단핵세포들이 침윤되어 있는 기관지폐렴이 9마리에서 관찰되었다.
분리된 R. equi 9개 균체를 대상으로 항생제 감수성 여부를 검사한 결과 가장 효과적인 항생제로는 amoxicillin/ clavulanic acid, ceftiofur, gentamicin, neomycin, quinolones 계열, rifampin, vancomycin임을 알 수 있었다. 그러나 sulfamethoxazol/trimethoprim, tetracycline 계열 및 cefazolin에는 강한 내성을 가지는 것으로 확인되었다(Table 5).
세균분리를 시도한 결과 의뢰된 14마리의 시료 중 부검축 8마리의 실질장기와 1마리의 기관 삼출물에서 총 9개의 R.equi 균주를 분리할 수 있었다. 균체들은 혈액배지에서 점액성이 강하고 연어살색인 전형적인 R.
9%의 높은 감수성을 보이고 있었다. 실험적으로 시험관 내에서의 균체에 대한 다양한 항생제의 적용은 가능하지만, R. equi 균체는 세포 내에 기생하고 병변도 결합조직에 둘러싸인 만성 육아종성 병소를 만들기 때문에 감염된 말에 서의 실질적인 항생제 효능은 실험실 결과와 다소간의 차이가 있을 것으로 추정된다. 특히 rifampin과 erythromycin은지용성 항생제로서 건락화 된 물질 및 세포 내로의 침투가 용이하기 때문에 병용 시 서로의 내성을 줄여주고 상승효과를 발휘하여 R.
2E)이 관찰되었다. 이 균체들은 Gram 염색 결과 양성 구간균(Fig. 2F)으로 확인되었으며, PAS 및 ZiehlNeelsen 염색 시 모두 음성반응을 나타내었다.
그러나 kanamycin, penicillin 제제 및 streptomycin항생제에는 중등도의 감수성을 나타내고 있었다. 일반적으로 야외에서 본 질병의 치료제로 추천되는 erythromycin과 rifampin의 경우 각각 100% 및 88.9%의 높은 감수성을 보이고 있었다. 실험적으로 시험관 내에서의 균체에 대한 다양한 항생제의 적용은 가능하지만, R.
2B)이 각각 11마리의 개체에서 관찰되었다. 전체적으로 7마리의 망아지 폐장에서 기관지폐렴, 폐농양 및 육아종성 폐렴이 공존하고 있었다.
equi 감염증으로 최종 진단되었다. 특히 특수 염색과 IHC를 통하여 큰포식세포와 다핵거대세포의 세포질에 감염되어 있는 편성 세포내 기생성 세균인 R. equi를 증명하였으며 다른 세균성 질병과의 감별 진단이 용이하였다.
3A) 을 형성하였으나 MacConkey 배지에서는 자라지 않았다. 혈액배지에 증식한 세균 집락은 염색 결과 Gram 양성의 구간 균으로 확인되었다(Fig. 3B).

후속연구

제주도에서는 제주마, 한라마 및 경주마 등전국 대비 60% 정도의 말을 사육하고 있어 말 산업의 메카로 알려져 있으며, 2014년에는 군내 최초로 말산업 특구로 지정되었다. 그러므로 본 질병에 대한 전반적인 이해를 통한 조기진단과 적절한 치료 및 질병예방을 위한 농장 및 마필의 체계적인 관리가 반드시 필요한 것으로 사료된다.
equi 균체는 세포 내에 기생하고 병변도 결합조직에 둘러싸인 만성 육아종성 병소를 만들기 때문에 감염된 말에 서의 실질적인 항생제 효능은 실험실 결과와 다소간의 차이가 있을 것으로 추정된다. 특히 rifampin과 erythromycin은지용성 항생제로서 건락화 된 물질 및 세포 내로의 침투가 용이하기 때문에 병용 시 서로의 내성을 줄여주고 상승효과를 발휘하여 R. equi 감염 망아지의 치료에 적극 활용할 수 있을 것으로 사료된다[1,2].

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	R. equi가 사람에게 끼치는 영향은 무엇인가?	이 후에는 소, 염소, 돼지, 고양이 등에서 산발적인 감염을 유발하기도 하였다[3,4]. 사람에서는 1967년 Golub에 의해 면역계가 손상된 사람의 폐 농양과 피하 농양에서 처음 분리 보고되었으며[2], 최근에는 사람 면역 결핍 바이러스(human immunodeficiency virus)에 감염된 환자와 같이 면역력이 저하된 사람에서 기회감염을 일으키는 중요한 병원체로 부각되었다[2,3]. 국내에서도 이 병원체로 인한 인체 감염 예가 2건 보고된 바 있다[5,6].
	Rhodococcus equi는 무엇인가?	Rhodococcus equi는 방선균목의 노카르디아과에 속하는 그람양성의 편성 세포내 기생성 세균이며, 전 세계적으로 토양 및 초식동물의 분변 등에서 발견되고, 여름철 고온 환경에서 잘 증식하여 방목지 동물과 이들의 사육환경 속에 널리 분포되어 있다[1-3].
	망아지에게 폐렴이나 폐농양을 유발시키는 병원체는 무엇이 있는가?	망아지에서 폐렴이나 폐농양을 유발할 수 있는 병원체로는 R. equi 이외에도 Streptococcus equi subspecies (subsp.) zooepidemicus, Streptococcus equi subsp. equi, Staphylococcus aureus, Escherichia coli 등이 있다. 특히 Streptococcus equi subsp.

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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