[논문]T-세포 항원 수용체 매개 신호전달 조절자로서 돼지 CD45RO 구조특성

채한화; 임다정

doi:10.5762/kais.2019.20.9.211

[국내논문] T-세포 항원 수용체 매개 신호전달 조절자로서 돼지 CD45RO 구조특성
Key Structural Features of PigCD45RO as an Essential Regulator of T-cell Antigen Receptor Signaling 원문보기

한국산학기술학회논문지 = Journal of the Korea Academia-Industrial cooperation Society, v.20 no.9, 2019년, pp.211 - 226

채한화 (국립축산과학원 동물유전체과, 전남대학교 약학대학) , 임다정 (국립축산과학원 동물유전체과)

초록
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백혈구 공통 항원인 돼지 CD45는 PTPRC 유전자에 암호화 되어 있으며, CD45엑손의 선택적 스플라이싱에 따라 다른 T-세포에서 발현되는 티로신 인산분해효소이다. CD45는 기질인 TCR의 $CD3{\zeta}$ 사슬, Lck, Fyn, Zap-70 kinase의 인산화된 티로신에서 인산을 분해하여 T-세포 항원 수용체(TCR) 매개 신호전달을 조절한다. CD45의 조절이상은 많은 면역 질환과 관련이 있어서, CD45는 면역약물 개발에 표적이 되어왔다. TCR 신호전달의 조절효과를 가진 주요 구조적 특징을 특성화하기 위해, 사람의 알려진 CD45 구조를 템플릿으로 적용하여 돼지 CD45RO(가장 작은 CD45 isoform)의 단백질 구조와 예측된 돼지 CD45RO 모델구조에 $CD3{\zeta}$ 사슬의 ITAM(REEpYDV)를 도킹하여 CD45RO/ITAM 펩타이드 결합구조를 예측하였다. 돼지 CD45RO의 구조적 특징은 세포외영역의 구조견고성과 세포질 내 티로신 인산분해효소 도메인의 KNRY와 PTP signature 기능모티프(두 기능 모티프는 ITAM 펩타이드 결합부위의 좁은 입구로 역할)에 있었다. 주요 구조특성은 돼지 CD45RO-ITAM 펩타이드 결합구조 안정성과 결합친화력을 조절하면서 기질 선택성에 영향을 준다. 돼지 CD45RO의 구조적 특성은 T-세포에 특이적인 면역 조절제를 탐색하는 데에 적용될 것이다.

Abstract ▼ AI-Helper

Pig CD45, the leukocyte common antigen, is encoded by the PTPRC gene and CD45 is a T cell-type specific tyrosine phosphatase with alternative splicing of its exons. The CD45 is a coordinated regulator of T cell antigen receptor (TCR) signal transduction achieved by dephosphorylating the phosphotyrosine of its substances, including $CD3{\zeta}$ chain of TCR, Lck, Fyn, and Zap-70 kinase. A dysregulation of CD45 is associated with a multitude of immune disease and has been a target for immuno-drug discovery. To characterize its key structural features with the effects of regulating TCR signaling, this study predicted the unknown structure of pig CD45RO (the smallest isoform) and the complex structure bound to the ITAM (REEpYDV) of $CD3{\zeta}$ chain via homology modeling and docking the peptide, based on the known human CD45 structures. These features were integrated into the structural plasticity of extracellular domains and functional KNRY and PTP signature motifs (the role of a narrow entrance into ITAM binding site) of the tyrosine phosphatase domains in a cytoplasmic region from pig CD45RO. This contributes to the selective recognition of phosphotyrosine from its substrates by adjusting the structural stability and binding affinity of the complex. The characterized features of pigCD45RO can be applied in virtual screening of the T-cell specific immunomodulator.

Keyword

표/그림 (14)

그림 Fig. 1. Inducing ligated T-cell receptor signaling by CD45
그림 Fig. 2 The homology modeling process of pig CD45RO
그림 Fig. 3. The sequence alignment of the CD45 PTP domains
그림 Fig. 4. Schematic representation of the pig CD45RO structure model
표 Table 1. Estimating the quality of pig CD45RO model structures
그림 Fig. 5. A structural analysis of pig CD45 models by Ramachandran plot
그림 Fig. 6. The structural rigid of pig CD45 extracellular domain(D1-D4)
그림 Fig. 7. Functional motifs in PTP domains from pig CD45
그림 Fig. 8. Common Protein tyrosine phosphatase catalytic mechanism[45]
그림 Fig. 9. Structure of CD45 PTP-D1 bound to ITAM-1 phosphopeptide(REEpYDV) of CD3ζchain.
그림 Fig. 10. The Ala mutation effect on PTP domains of pig CD45 and ITAM-1peptide (REEpYDV) complex
그림 Fig. 11. The superimposed PTP domain between CD45 and CD148
그림 Fig. 12. Structure of CD148 PTP-D1 bound to ITAM-1 phosphopeptide(REEpYDV) of CD3ζchain.
그림 Fig. 13. Compared signaling networks of CD45 and CD148

AI 본문요약
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문제 정의

CD45isoforms의 구조적 특징이 림프구의 신호전달 조절과 연관되어 있고, 이는 외부항원에 대한 면역방어에도 직접적 영향을 준다. 본 연구에서는 돼지 CD45RO 단일항체에 인식되는 isoform(이하 CD45RO) 단백질 구조로부터 T-림프구 항원수용체 매개 신호전달 활성화와 연관된 기능모티프를 발굴하여 CD45에 선택적으로 작용할 수 있는 길항제 또는 억제제를 개발하고자 할 때, allostericsite로 작용 가능한 영역을 제안하고자 한다. 이러한 기능모티프 정보는 CD45의 기질단백질과 유사한 모방체 이외에 다양한 형태를 갖는 면역조절 후보물질의 가상탐색(knowledge-based virtual screening in silico)에 적용될 수 있다.
특히, 돼지 CD45는 CD25, CD11b, SWC1, SWCT7, MHCII와 함께 γδT세포표지자[31-33]로서 항원 유도 T-림프구와 B-림프구 항원수용체를 활성화[34]하고, 돼지 써코바이러스(Porcine circovirus type 2, PCV-2)백신에 대한 면역반응[35], 아프리카 돼지 열병 바이러스(African swine fever virus, ASFV) 감염된 세포마커(CD45, CD163,CD203a, CD16, CD14)[36]와 연관된 것으로 알려져있지만, 현재 돼지 CD45기능과 연관된 구조특성은 잘 알려져 있지 않다. 본 연구를 통하여 돼지 CD45RO 예측된 구조로부터 티로신인산분해효소 기능과 연관된 모티프, 구조적 견고성과 관련된 도메인-도메인 상호작용영역, 기질단백질의 ITAMs 결합부위 특징에 대한 insight를 제공하고자 한다.
본 연구에서는 외부바이러스 항원을 인식한 활성 T-세포에서 많이 발현되는 돼지 CD45RO 단백질 구조 모델(ECD model1, PTP model2)로부터 기능과 직접적으로 연관되어 있는 세포외영역의 구조견고성, 세포질내 티로신 인산분해효소 작용점내 기능모티프(active site의 크기와 깊이를 결정하는 KNRY motif, PTP-signature motif), 항원 수용체 매개 신호전달의 시작단계에서 CD45의 기질 T-세포 항원수용체-CD3ζ 사슬(CD247)의 ITAM-1 펩타이드(REEpYDV) 선택성에 대한 새로운 insights를 제공하였다.

제안 방법

이중에서 인간 CD45의 세포외 도메인(cysteine- rich domain과 FN3 domains) 구조(PDBID: 5FMV, 5FN6, 5FN7)와 세포질 내 티로신인산분해효소 도메인(PTP domains)구조 (PDB ID: 1YGR,1YGU)가 있다[17-18]. 현재 돼지 CD45의 단백질 3차구조가 알려져 있지 않지만, 돼지와 인간의 CD45 단백질 서열 유사성이 65%이상으로 높기 때문에, 실험적으로 구조가 결정된 인간 CD45의 구조를 주형(template)로하여, Fig. 2와 같은 순서로 Homology modeling을 수행하였다.
알려진 인간 CD45 단백질구조(template)에 예측하고자 하는 돼지 CD45RO의 단백질 서열(query protein)을 sequence-structure alignment를 하였다. alignment 결과를 바탕으로 하여, 잘 보존된 영역에서는 인간 CD45 구조와 매우 유사하게 돼지 CD45RO 구조가 예측되었다.
돼지 CD45RO 구조 모델 내 각 원자들간의 거리와 결합각, 비틀림각 등의 정보를 template structure(인간 CD45)의 X-ray구조로부터 threading하여 아미노산 잔기의 원자위치좌표가 상대적으로 결정되었다. 또한, 인간과 돼지 CD45RO에서 보존되지 않은 영역(세포외 도메인 중 cysteine-rich domain과 세포내 PTP-D2의 긴 acidic loop와 basic loop 영역)에서는 loop search와 model refinement과정을 진행 후, 모델구조를 최적화하였다. 최적화된 돼지 CD45RO 구조모델을 유사한 분자크기를 갖는 실험적으로 결정된 인간 CD45도 포함된다른 단백질구조들과 비교하여 평가하였다.
또한, 인간과 돼지 CD45RO에서 보존되지 않은 영역(세포외 도메인 중 cysteine-rich domain과 세포내 PTP-D2의 긴 acidic loop와 basic loop 영역)에서는 loop search와 model refinement과정을 진행 후, 모델구조를 최적화하였다. 최적화된 돼지 CD45RO 구조모델을 유사한 분자크기를 갖는 실험적으로 결정된 인간 CD45도 포함된다른 단백질구조들과 비교하여 평가하였다. 최종적으로,돼지 CD45RO의 세포외영역(cysteine-rich domainD1 and FN3 domain D2-D4: Pro179-Ser429 residues)과 세포내 티로신 인산분해 도메인(PTP domains ofPTP-D1 and PTP-D2: residues Lys481- Pro1086) 3차-구조를 각각 예측하였다.
최적화된 돼지 CD45RO 구조모델을 유사한 분자크기를 갖는 실험적으로 결정된 인간 CD45도 포함된다른 단백질구조들과 비교하여 평가하였다. 최종적으로,돼지 CD45RO의 세포외영역(cysteine-rich domainD1 and FN3 domain D2-D4: Pro179-Ser429 residues)과 세포내 티로신 인산분해 도메인(PTP domains ofPTP-D1 and PTP-D2: residues Lys481- Pro1086) 3차-구조를 각각 예측하였다.
edu/Lab/Glycomine_struct/)[20]방법으로구조모델에서 Asn-x-Ser/Thr motif를 탐색하였다. 탐색된 N-linked glycosylation site 중에서 인간 CD45의 X-ray로 결정된 구조(PDB ID: 5FMV)에 돼지 CD45RO 구조모델을 정렬(structural alignment)하여 동일하게 겹치는 N-linked glycosylation site를 선별하였다. 돼지 CD45RO구조모델내 FN3 도메인(D2-D4)에서 5개 N-linked glycosylation site(Asn236, Asn294,Asn326, Asn346, Asn414)에 N-acetyl-glucosamine를 이용하여 반복적으로 글리코실화 하였다.
탐색된 N-linked glycosylation site 중에서 인간 CD45의 X-ray로 결정된 구조(PDB ID: 5FMV)에 돼지 CD45RO 구조모델을 정렬(structural alignment)하여 동일하게 겹치는 N-linked glycosylation site를 선별하였다. 돼지 CD45RO구조모델내 FN3 도메인(D2-D4)에서 5개 N-linked glycosylation site(Asn236, Asn294,Asn326, Asn346, Asn414)에 N-acetyl-glucosamine를 이용하여 반복적으로 글리코실화 하였다.
CD3ζ사슬의ITAM(QQQQNQLpYNELNLGRREEpYDVLDKRRG)에서 2번째 인산화된 티로신(pYxxL/I)서열이 포함된 REEpYDV펩타이드를 돼지CD45RO의 티로신인산분해활성이 있는 PTP-D1 도메인에 docking하여 CD45RO와 CD3ζ사슬(CD247)내 ITAM간의 상호작용을 하는 작용점(결합부위에서 15Å)의 특성을 분석하였다.
연구에서 수행한 돼지 CD45RO 구조예측(Homologymodeling), 글리코실화(N-linked glycosylation), 티로신인산분해활성도메인(PTP-D1)에 CD3ζ사슬(CD247)내 ITAM 모방체(REEpYDV) docking 연구는 Discoverystudio 소프트웨어 2017R2버전에서 생체내 환경과 같은 pH7.4인 CHARMm force field[21]를 적용하여 MODELLER[22], CDOCKER[23] 프로그램을 사용하여 연구를 진행하였다.
이번 연구에서 수행한 돼지 CD45RO 구조예측(Homologymodeling), 글리코실화(N-linked glycosylation), 티로신인산분해활성도메인(PTP-D1)에 CD3ζ사슬(CD247)내 ITAM 모방체(REEpYDV) docking 연구는 Discoverystudio 소프트웨어 2017R2버전에서 생체내 환경과 같은 pH7.4인 CHARMm force field[21]를 적용하여MODELLER[22], CDOCKER[23] 프로그램을 사용하여 연구를 진행하였다.
CD3ζ사슬의ITAM(QQQQNQLpYNELNLGRREEpYDVLDKRRG)에서 2번째 인산화된 티로신(pYxxL/I)서열이 포함된 REEpYDV펩타이드를 돼지CD45RO의 티로신인산분해활성이 있는 PTP-D1 도메인에 docking하여 CD45RO와 CD3ζ사슬(CD247)내 ITAM간의 상호작용을 하는 작용점(결합부위에서 15Å)의 특성을 분석하였다. 돼지 CD45RO구조모델내 PTP-D1에 docking동안, 인간 CD45의 PTP domains-REEpYDV 결합구조(PDB ID:1YGR)에서 REEpYDV펩타이드 위치를 시작점으로 설정하여 CDOCKER 프로그램(CHARMm-based dockingmethod)으로 flexible ligand docking 하였다. 이번 연구에서 수행한 돼지 CD45RO 구조예측(Homologymodeling), 글리코실화(N-linked glycosylation), 티로신인산분해활성도메인(PTP-D1)에 CD3ζ사슬(CD247)내 ITAM 모방체(REEpYDV) docking 연구는 Discoverystudio 소프트웨어 2017R2버전에서 생체내 환경과 같은 pH7.
CD45의 세포내·외 도메인의 구조적 유동성이 적어지면, 상대적으로 CD45의 구조적 견고성(structural plasticity)이 커지고, TCR로‘close contact’에서 CD45의 구조가 잘 유지되어 신호전달에 도움이 된다. 이번 연구에서는 CD45의 구조적 특징을 고려하여 6개 CD45 isoforms중에서 가장 구조적 견고성이 크고, 활성 T-세포에서 많이 발현되는 CD45RO 구조를 예측하였다. 특히, 돼지 CD45는 CD25, CD11b, SWC1, SWCT7, MHCII와 함께 γδT세포표지자[31-33]로서 항원 유도 T-림프구와 B-림프구 항원수용체를 활성화[34]하고, 돼지 써코바이러스(Porcine circovirus type 2, PCV-2)백신에 대한 면역반응[35], 아프리카 돼지 열병 바이러스(African swine fever virus, ASFV) 감염된 세포마커(CD45, CD163,CD203a, CD16, CD14)[36]와 연관된 것으로 알려져있지만, 현재 돼지 CD45기능과 연관된 구조특성은 잘 알려져 있지 않다.
NCBI에 등록된 돼지 CD45 아미노산 서열(NCBI ID:XP_003130644.5)을 Promal3D(multiple protein structure- based alignment[37])적용하여 인간 CD45의 X-ray 구조(PDB ID: 5FMV, 5FN6, 5FN7,1YGR, 1YGU)에 multiple alignment하여 돼지 CD45에 보존되어 있는 도메인내 서열정보를 먼저 분석하였다. 돼지 CD45의 아미노산 서열로부터 세포외 영역에 존재하는 cysteine- rich domain(D1: Pro86-Pro140), 3개 FN3 domains(D2: Pro141-Thr243, D3:Gln252-Thr336, D4: Arg345-Ser429), 세포막에 존재하는 영역(TM: Tyr430-Pro488), 세포내 티로신 인산분해 활성도메인(PTP-D1: Ile489-Glu775, PTP-D2:Val776-Pro1086)으로 CD45RO isoform 전체도메인 배열을 확인할 수 있었다(Fig.
4). 이 domain 구조 및 배열정보를 활용하여 Modeller 프로그램으로 Homologymodeling을 수행하여 인간 CD45 template structures와 돼지 CD45RO query sequence간의 다중정렬결과, 보존된 영역에서 아미노산잔기의 위치좌표가 threading되어 인간 CD45 template structures의 3차-구조 기본특성이 돼지 CD45RO 구조모델에 반영되었다. 반면에, 인간의 CD45 template에 보존되지 않은 세포외 도메인 cysteine-rich domain D1(Pro86-Pro139), 세포 내 PTP-D2 도메인에 존재하는 긴 loop(acidic loop:Ser850-Glu869와 basic loop: Lys1007-Arg1017)는loop search와 model refinement과정을 추가적으로 진행하였다.
이 domain 구조 및 배열정보를 활용하여 Modeller 프로그램으로 Homologymodeling을 수행하여 인간 CD45 template structures와 돼지 CD45RO query sequence간의 다중정렬결과, 보존된 영역에서 아미노산잔기의 위치좌표가 threading되어 인간 CD45 template structures의 3차-구조 기본특성이 돼지 CD45RO 구조모델에 반영되었다. 반면에, 인간의 CD45 template에 보존되지 않은 세포외 도메인 cysteine-rich domain D1(Pro86-Pro139), 세포 내 PTP-D2 도메인에 존재하는 긴 loop(acidic loop:Ser850-Glu869와 basic loop: Lys1007-Arg1017)는loop search와 model refinement과정을 추가적으로 진행하였다.
세포내 PTP-D2의 긴 acidic loop와 basic loop는 PTP-D1도메인과의 직접적인 상호작용을 하지 않지만, PTP-D1과 PTP-D2 도메인간의 서로 존재하는 방향에 영향을 줘서 PTP-D1에 기질의 ITAM이 docking 하는데 steric effect를 제공하기 때문에 loop refinement 과정이 필요하였다. 세포내 PTP-D2 도메인 내 loop refinement 과정으로 긴 loop의 conformer를 결정한 후, 돼지 CD45RO 구조모델의 backbone 구조를 유지하면서 아미노산잔기의 side-chain을 최적화하기 위해,CHARMm force field (pH7.4)하에서 side-chain refinement과정을 더 진행하였다. 돼지 CD45RO 구조모델의 quality를 Modeller 프로그램의 DOPE score[38]와 Profiles-3D score[39]로 평가하여 최적화된 구조모델을 선택하였다.
이때, 돼지 CD45의 PTP model2에서는 10개 아미노산 잔기(Val662, Asp792, Leu847, Asp858, Asp863, Lys968, Glu985, Lys1014, Arg1026, Met1010)들이 outliner로서 disallowed region에 위치하였다. Ramachandran plot과 다양한 아미노산잔기(Molprobity and Clash score[40])와 전체구조(DOPE score, Profile-3D)단위의 돼지 CD45RO 모델구조 검증과정에서 scoring 점수가 단백질의 크기에 의존할 수 있기 때문에, 인간 CD45 구조를 포함하여 PDB내 실험적으로 결정된 유사한 크기를 갖는 다른 단백질들과도 비교하여 모델구조의 타당성을 확인하였다 (Table 1, Fig. 5)
돼지 CD45가 CD3ζ사슬(CD247)의 ITAM-1 인산화된 펩타이드(REEpYDV)에서 인산분해로 T-세포 면역반응을 억제하여 조절하는 데 PTP 도메인 3차-구조의 안정성이 중요한지 또는 ITAM 기능 서열에 대한 선택성이 있는 지를 확인하기 위하여, I) CD45 작용점의 잔기들과II) REEpYDV서열에서 인산화된 티로신(pY)제외하고Ala으로 mutation 하였다.
돼지 CD148구조, CD148과 CD3ζchain(CD247)의 ITAM-1 인산화된 펩타이드(REEpYDV)결합구조는 실험적으로 결정되지 않았지만, 이번연구에서 인간 CD148의 X-ray 구조(PDB ID : 2NZ6 [47]) template를 기반으로 돼지 CD45와 같은 방법으로 구조 예측과 docking을 동일하게 수행하여 CD45와 CD148의 PTP 도메인을 비교하였다.
CD45는 대부분 조혈모세포에 발현되고 CD148은 혈소판에서 발현되지만 PTP-D1은 세포막에 인접하게 위치하여, 근처에 위치한 CD3ζ사슬(CD247)의 ITAM-1인산화된 티로신(pY)부터 인산을 분해(Y)한다. 또한,CD148도 CD45의 기질 단백질(Src그룹에 속하는 티로신인산화효소인 Lck, Zap-70 등)과 상호작용을 하여T-세포 항원 수용체 ITAMs매개 Zap-70, LAT(Zap-70의 기질로서 linker of activated T-cells)로부터 IL-2분비로 T-세포 활성을 조절한다. 즉, CD45(PTPRC)와 CD148(PTPRJ)의 PTP 도메인은 T-세포 항원 수용체 매개 신호전달 시작단계에서 백혈구의 특이적인 티로신인산화효소인 Lck을 활성화 하거나 억제하는 데 모두 관여한다(Fig.

대상 데이터

실험적 방법(X-ray, NMR 등)으로 결정된 CD45의 단백질 구조는 PDB(Protein data bank)에서 6개 구조가 존재한다. 이중에서 인간 CD45의 세포외 도메인(cysteine- rich domain과 FN3 domains) 구조(PDBID: 5FMV, 5FN6, 5FN7)와 세포질 내 티로신인산분해효소 도메인(PTP domains)구조 (PDB ID: 1YGR,1YGU)가 있다[17-18].
따라서 Profiles-3D score값이 클수록, 환경에 잘 부합되게아미노산 잔기가 존재하여 구조적 안정성을 가지게 된다. 최적화된 돼지 CD45RO 구조모델은 세포막에 존재하는 영역(실험적으로 구조가 결정되지 않는 TM: Tyr430- Pro488)을 제외한 세포외 영역(D1-D4:Pro66-Ser429)의 ECD model1과 세포내 영역(PTP-D1-PTP-D2: Lys481- Pro1086)의 PTP model2로 각각 예측되었다(Fig. 4). 돼지 CD45RO 구조모델의 DOPE와 Profile score값은 인간 CD45의 X-ray구조 template structure(PDB ID : 5FMV,5FN6, 5FN7, 1YGR, 1YGU)와 비교하여 분석한 결과를 Table 1에 요약하였다.
CD3ζ사슬의3개 ITAM(ITAM-1, ITAM-2, ITAM-3)중 세포막에 근접해 있는 ITAM-1의 인산화된 티로신 기능서열(REEpYDV)을 돼지 CD45의 PTP 도메인에 docking하였다.
이와 반대로, 엑손6에서 A138G는 exon skipping을 자극하여 CD45RO의 발현량이 증가하는 데, B형 간염, 자가면역 갑상선 질환에 대해서는 보호효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. mCD45RNA의 선택적 스플라이싱에 대한 중요한 factor인 hnRNPLL(heterogeneous ribonucleoprotein)과 PSF(polypyridinetract binding protein-associated splicing factor)[49-50]도 CD45에 대한 원천적인 기능조절자로 연구대상이다. 잘 알려진 CD45에 의한 T-세포와 B-세포에서 항원수용체 매개 신호전달 조절 이외에도, 골수계 세포(호중구, 단핵구, 대식세포, 수지상세포, 비만세포)에서 MyD88(myeloid differentiation primary response 88)-의존적/비의존적 기작을 조절[51]하는 기능은 매우 흥미롭다.

이론/모형

돼지 CD45RO의 세포외도메인에 존재하는 N-linked glycosylation site를 GPP(http://comp.chem.nottingham. ac.uk/glyco/)[19],GlycoMine ^Struct ( ht t p : / / g l y c o mi n e . e r c .monash.edu/Lab/Glycomine_struct/)[20]방법으로구조모델에서 Asn-x-Ser/Thr motif를 탐색하였다. 탐색된 N-linked glycosylation site 중에서 인간 CD45의 X-ray로 결정된 구조(PDB ID: 5FMV)에 돼지 CD45RO 구조모델을 정렬(structural alignment)하여 동일하게 겹치는 N-linked glycosylation site를 선별하였다.
4)하에서 side-chain refinement과정을 더 진행하였다. 돼지 CD45RO 구조모델의 quality를 Modeller 프로그램의 DOPE score[38]와 Profiles-3D score[39]로 평가하여 최적화된 구조모델을 선택하였다. DOPE score는 돼지 CD45RO의 예측된 구조모델들에서 각 conformer의 구조적 안정성(structural stability)을 상대적 conformational energy로 측정하는 것으로 DOPE score값이 적을수록,더 안정한 conformer의 구조모델이라 할 수 있다.

성능/효과

알려진 인간 CD45 단백질구조(template)에 예측하고자 하는 돼지 CD45RO의 단백질 서열(query protein)을 sequence-structure alignment를 하였다. alignment 결과를 바탕으로 하여, 잘 보존된 영역에서는 인간 CD45 구조와 매우 유사하게 돼지 CD45RO 구조가 예측되었다. 돼지 CD45RO 구조 모델 내 각 원자들간의 거리와 결합각, 비틀림각 등의 정보를 template structure(인간 CD45)의 X-ray구조로부터 threading하여 아미노산 잔기의 원자위치좌표가 상대적으로 결정되었다.
alignment 결과를 바탕으로 하여, 잘 보존된 영역에서는 인간 CD45 구조와 매우 유사하게 돼지 CD45RO 구조가 예측되었다. 돼지 CD45RO 구조 모델 내 각 원자들간의 거리와 결합각, 비틀림각 등의 정보를 template structure(인간 CD45)의 X-ray구조로부터 threading하여 아미노산 잔기의 원자위치좌표가 상대적으로 결정되었다. 또한, 인간과 돼지 CD45RO에서 보존되지 않은 영역(세포외 도메인 중 cysteine-rich domain과 세포내 PTP-D2의 긴 acidic loop와 basic loop 영역)에서는 loop search와 model refinement과정을 진행 후, 모델구조를 최적화하였다.
5)을 Promal3D(multiple protein structure- based alignment[37])적용하여 인간 CD45의 X-ray 구조(PDB ID: 5FMV, 5FN6, 5FN7,1YGR, 1YGU)에 multiple alignment하여 돼지 CD45에 보존되어 있는 도메인내 서열정보를 먼저 분석하였다. 돼지 CD45의 아미노산 서열로부터 세포외 영역에 존재하는 cysteine- rich domain(D1: Pro86-Pro140), 3개 FN3 domains(D2: Pro141-Thr243, D3:Gln252-Thr336, D4: Arg345-Ser429), 세포막에 존재하는 영역(TM: Tyr430-Pro488), 세포내 티로신 인산분해 활성도메인(PTP-D1: Ile489-Glu775, PTP-D2:Val776-Pro1086)으로 CD45RO isoform 전체도메인 배열을 확인할 수 있었다(Fig. 4). 이 domain 구조 및 배열정보를 활용하여 Modeller 프로그램으로 Homologymodeling을 수행하여 인간 CD45 template structures와 돼지 CD45RO query sequence간의 다중정렬결과, 보존된 영역에서 아미노산잔기의 위치좌표가 threading되어 인간 CD45 template structures의 3차-구조 기본특성이 돼지 CD45RO 구조모델에 반영되었다.
Ramachandran plot를 통하여 돼지 CD45RO 최종모델(ECD model1, PTP model2)의 모든 아미노산에서 펩타이드 결합의 이면각(phi and psi torsion angles)분포를 고려하여 전체적인 모델의 geometric 그리고 stereochemical quality를 평가한 결과, 인간 CD45의 X-ray 구조보다 돼지 CD45RO 모델 구조(ECD model1and PTP model2)가 더 안정적인 conformer로 예측되었다. Ramachandran plot에서 예측된 돼지 CD45 모델구조의 세포외도메인(ECD model1) 92.
docking 결과, 돼지 CD45의 PTP-D1에 결합된 CD3ζ사슬의 ITAM-1 기능서열(REEpYDV)의 인산화된티로신(pY)은 3개 key residues(Cys709, Arg715,Asp677)에 위치하였다.
돼지 CD45 작용점 내 Val540, Leu750, Ile542, Gly714,Gln753, Gln757, Arg538, Arg585는 ITAM-1 인산화된 펩타이드가 결합할 수 있는 pocket의 형태를 유지하는 데 영향을 준다. 반면에 WPD motif의 Asp677은 결합구조의 안정성보다는 Cys709, Arg715와 함께 key residues로 기능이 더 중요하게 작용하여 결합력에 더 변이효과가 컸다. Asp677과 달리, Cys709의 nucleophile기능과 Arg715의 intermediate 안정화는 정확한 위치에서 작용하는 것이 중요하여 결합력 보다는 구조안정성에 훨씬 더 영향을 준다.

후속연구

CD45는 외부미생물과 바이러스의 외부패턴인식수용체 Toll-like receptor(TLR1-TLR10, CD281-CD290)에서 TLR2(CD282)와 TLR9(CD289)의 MyD88-의존적기작을 비활성화하여 IFN-β를 포함한 염증사이토카인분비를 억제하지만, TLR3(CD283)와 TLR4(CD284)MyD88-비의존적 기작을 활성화하여 IFN-β분비를 증가한다. 향후, 돼지 CD45RO 구조모델로부터 RNA바이러스에 대한 TLR3, TLR7/8 (CD287/CD288), TLR9의MyD88-의존적/비의존적 기작조절로 항바이러스 효과에 대한 연구를 진행 할 것이다. 더 나아가서, 돼지 집단 내 CD45에 존재하는 유전자 다형성(polymorphic variants), 품종별 유의적 아미노산변이(nSNP)와 바이러스(PCV2, ASFV등) 질환에 대한 감수성 또는 저항성, 면역질환 관련 효과를 구명하는 연구로 더 확대해 나갈 것이다.
향후, 돼지 CD45RO 구조모델로부터 RNA바이러스에 대한 TLR3, TLR7/8 (CD287/CD288), TLR9의MyD88-의존적/비의존적 기작조절로 항바이러스 효과에 대한 연구를 진행 할 것이다. 더 나아가서, 돼지 집단 내 CD45에 존재하는 유전자 다형성(polymorphic variants), 품종별 유의적 아미노산변이(nSNP)와 바이러스(PCV2, ASFV등) 질환에 대한 감수성 또는 저항성, 면역질환 관련 효과를 구명하는 연구로 더 확대해 나갈 것이다. 또한, CD45의 기질단백질과 유사한 모방체 이외에 다양한 형태를 갖는 면역조절 후보물질의 가상탐색(knowledge- based virtual screening in silico)에도 적용할 것이다.
더 나아가서, 돼지 집단 내 CD45에 존재하는 유전자 다형성(polymorphic variants), 품종별 유의적 아미노산변이(nSNP)와 바이러스(PCV2, ASFV등) 질환에 대한 감수성 또는 저항성, 면역질환 관련 효과를 구명하는 연구로 더 확대해 나갈 것이다. 또한, CD45의 기질단백질과 유사한 모방체 이외에 다양한 형태를 갖는 면역조절 후보물질의 가상탐색(knowledge- based virtual screening in silico)에도 적용할 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	면역반응에서 신호전달이 시작되는 과정은?	면역반응에서 신호전달을 시작하는 항원수용체(TCR 또는 BCR)는 막단백질(integral membrane protein)로 존재한다. 항원수용체가 세포외영역에서 수용성의 리간드(항원 등)를 인식하거나혹은 항원제시세포에 부착된 주조직복합체(MHC)에 결합된 항원펩타이드를 인식하면, 항원 리간드 결합으로 유도되는 항원수용체의 입체구조 변화가 일어난다. T-림프구 항원수용체(TCR)가 활성화되면, TCR 구조에서 항원결합부위는 α와 β 사슬이지만 매우 짧은 세포질 내 tail로 신호전달기능이 없어서, TCR는 CD3의 γ, δ, ε, ζ 사슬과 신호전달 복합체를 이루게 된다. 동시에, 항원수용체와 공동수용체(CD4, CD8)간의 교차결합(cross-linking)을 통해 군집(clustering)을 형성하여 신호전달을 시작한다[1]. 신호전달의 시작단계에서 항원수용체의 세포질부위 또는 어뎁터 단백질의 티로신, 세린, 트레오닌 잔기에 인산기가 효과적으로 결합이 된다.
	신호전달이란 무엇인가?	신호전달은 특정수용체에 리간드가 결합한 후에 일어나는 세포내 생화학적인 반응이며, 가장 정교한 신호전달은 면역반응이다. 면역반응에서 신호전달을 시작하는 항원수용체(TCR 또는 BCR)는 막단백질(integral membrane protein)로 존재한다.
	CD45가 T-세포를 활성화하는 방법은?	CD45는 림프구 항원수용체 매개 신호전달의 초기단계에서 Src계열의 티로신인산화효소(T-세포내 Lck, Fyn, ZAP-70과 B-세포내 Lyn,Fyn, Blk, Syk)와 상호 작용을 하지만, CD45에 의한 T세포 신호전달의 조절은 B-세포에서 작용하는 것보다 더 효과적이다[2]. CD45는 기질단백질인 Lck와 Fyn의 비활성화 구조에 있는 C-terminal에 위치한 negative-조절부위에서 인산화된 티로신(Lck의 pY505, Fyn의pY528)에서 인산기를 분해하여 Lck와 Fyn이 활성화된 입체구조를 갖도록 도와줘서, TCR-매개 신호전달을 통해 T-세포를 활성화한다. 반면에, CD45는 Lck, Fyn의 활성화구조에 존재하는 인산화된 티로신잔기(Lck의pY394, Fyn의 pY417)에서 인산을 제거하여 신호전달을 억제하는 데도 관여한다[3-4].

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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