[논문]LPS로 유도한 대식세포에서 Nitric Oxide 생성을 저해하는 쉽싸리 성분의 분리

박희준

doi:10.7732/kjpr.2019.32.4.264

초록
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쉽싸리(L. lucidus)가 가지는 효능의 하나로 알려진 항염증효과의 활성물질을 파악하기 위하여 본 연구를 수행하였다. 항염효과는 LPS로 활성화한 macrophage 264.7이 생산하는 NO의 감소효과를 측정함으로써 평가하였다. 쉽싸리 추출물에서 얻은 비극성 분획물인 $CHCl_3$ 분획물은 농도의존적으로 현저히 NO 생산을 감소시켰다. 이에 비해 극성 분획물인 BuOH 분획물은 그 효과가 약하였다. Silica gel column chromatography에 의해 이 $CHCl_3$ 분획물로부터 주요 화합물인 ursolic acid를 분리하고 분광학적 방법으로 동정할 수 있었다. 효과가 약하였던 BuOH 분획물로부터 diaion HP-20 column chromatography와 sephadex LH-20 column chromatography로 이 분획의 주요 화합물인 rosmarinic acid를 분리하고 역시 분광학적 방법으로 동정하였다. Ursolic acid는 농도의존적으로 NO 생산을 억제하였으나 rosmarinic acid는 그 효과가 상대적으로 약하였다. 이러한 사실로부터 쉽싸리의 항염효과는 주로 ursolic acid의 존재 때문임을 알 수 있었다.

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This research was performed to identify the anti-inflammatory constituent from the herb of Lycorus lucidus (Lamiaceae). The MeOH extract of this plant material and its two fractions, the lipophilic- ($CHCl_3$ fraction) and the hydrophilic fraction (BuOH fraction), were prepared to test an...

This research was performed to identify the anti-inflammatory constituent from the herb of Lycorus lucidus (Lamiaceae). The MeOH extract of this plant material and its two fractions, the lipophilic- ($CHCl_3$ fraction) and the hydrophilic fraction (BuOH fraction), were prepared to test anti-inflammatory activity. For this purpose, the inhibition rate on inducible nitric oxide synthase (iNOS) activity was assessed by determining nitric oxide (NO) formation in lipopolysaccharide (LPS)-induced macrophage 264.7 cells. The $CHCl_3$ fraction that greatly inhibited nitric NO formation was chromatographed to lead the isolation of ursolic acid. Since ursolic acid inhibited NO formation dose dependently in this study, this compound was considered as one of the active constituent responsible for anti-inflammation. However, the activity of rosmarinic acid isolated from the BuOH fraction was weak.

주제어

표/그림 (3)

그림 Fig. 1. Structure of compounds 1 (ursolic acid) and 2 (rosmarinic acid) isolated from L. lucidus.
$Fig. 2. Effect of the MeOH extract of L. lucidus and its two fractions (CHCl<sub>3</sub>- and BuOH fraction) on NO formation [(A) and (B)] and on cell viability (C) in LPS-activated macrophage 264.7 cells. The data are presented as the means ± SD. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.005 by t-test. The amount of nitrate was measured by Griess reaction. The cell viability was measured using MTT. Cells were pretreated with different concentrations of ursolic acid and stimulated with LPS (1 ㎍/mL).$ 그림 Fig. 2. Effect of the MeOH extract of L. lucidus and its two fractions (CHCl₃- and BuOH fraction) on NO formation [(A) and (B)] and on cell viability (C) in LPS-activated macrophage 264.7 cells. The data are presented as the means ± SD. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.005 by t-test. The amount of nitrate was measured by Griess reaction. The cell viability was measured using MTT. Cells were pretreated with different concentrations of ursolic acid and stimulated with LPS (1 ㎍/mL).
그림 Fig. 3. Effect of compound ursolic acid, rosmarinic acid, caffeic acid and salvianolic acid on NO formation in LPS-activated macrophage 264.7 cells.

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문제 정의

쉽싸리(L. lucidus)가 가지는 효능의 하나로 알려진 항염증 효과의 활성물질을 파악하기 위하여 본 연구를 수행하였다. 항염효과는 LPS로 활성화한 macrophage 264.
, 2010)의 작용이 보고된 바 있다. 그러나 쉽싸리의 염증을 억제하는 화합물의 규명은 이루어지지 않았으므로, 그것을 밝히기 위하여 본 연구를 수행하였다.
, 2007). 그러므로 연구자들은 항염물질을 탐색하기 위하여 lipopolysaccharide (LPS)로 유도한 대식세포의 NO 생산억제효과를 측정하고자 하였다.
본 연구에서는 쉽싸리 전초로부터 MeOH 추출물과 그 분획물을 제조한 후 이들이 LPS로 유도한 대식세포에서 NO 생산 저해 효과가 있는지 측정하였다. 그리고 유효한 분획으로부터 주된 화합물을 분리하여 NO 저해효과를 일으키는 화합물을 찾고자 하였다. 분리된 화합물인 ursolic acid와 rosmarinic acid의 화학구조는 Fig.
본 연구에서는 쉽싸리 전초로부터 MeOH 추출물과 그 분획물을 제조한 후 이들이 LPS로 유도한 대식세포에서 NO 생산 저해 효과가 있는지 측정하였다. 그리고 유효한 분획으로부터 주된 화합물을 분리하여 NO 저해효과를 일으키는 화합물을 찾고자 하였다.

제안 방법

NO 생산을 저해하는 화합물을 검색하기 위한 목적으로 쉽싸리의 MeOH 추출물로부터 비극성 분획인 CHCl₃ 분획물과 극성 분획인 BuOH 분획물로 나누었다. 비극성 분획물은 주로 지용성 화합물을, 그리고 극성 분획물에는 주로 수용성 화합물을 포함하므로 이와 같은 분획과정으로 수행하였다.
쉽싸리 MeOH 추출물과 그 분획물인 CHCl₃ 분획물과 BuOH 분획물을 시료로 이용하여 대식세포가 생산하는 NO 생산을 억제하는 효과에 관한 실험을 하여 그 결과를 Fig. 2에 나타내었다.
lucidus)가 가지는 효능의 하나로 알려진 항염증 효과의 활성물질을 파악하기 위하여 본 연구를 수행하였다. 항염효과는 LPS로 활성화한 macrophage 264.7이 생산하는 NO의 감소효과를 측정함으로써 평가하였다. 쉽싸리 추출물에서 얻은 비극성 분획물인 CHCl₃ 분획물은 농도의존적으로 현저히 NO 생산을 감소시켰다.

대상 데이터

American Type Culutre Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 구입한 mouse macrophage RAW 264.7 cell은 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)와 antibioticsantimycotics (PSF; 100 units/mL penicillin G sodium, 100 ng/mL streptomycin, 250 ng/mL amphotericin B)를 첨가한 DMEM 배지에서 배양하였다. 5% CO₂를 포함하는 습한 공기 중에서 37℃로 유지하였다.
CHCl₃ 분획물에서 분리한 ursolic acid, BuOH 분획물에서 얻은 rosmarinic acid가 NO 생산에 미치는 효과를 측정하기 위해 시료로 사용하였다. Rosmarinic acid는 caffeic acid 두 분자가 축합한 dimer의 형태이다.
강원도 고성군에서 9월경 채취한 쉽싸리 전초를 채집하여 말린 후 세절하여 식물재료로 사용하였다. 이 식물은 상지대학교 송병민 교수의 감정으로 쉽싸리(Lycopus lucidus, Lamiaceae)로 동정되었다.
그리고, diaion HP-20 column의 정지상은 Mitsubishi Chemical사의 제품을 사용하였다. 생리활성 실험을 위해 사용한 caffeic acid는 Sigma사 제품을 사용하였고, salvianolic acid는 단삼(Salvia milthorrhiza)에서 분리한 화합물을 사용하였다.
570 ㎚에서 흡광도를 측정하여 세포생존율(%)를 control group (LPS+)와 비교하여 결정하였다. 실험에 사용한 시료는 MeOH 추출물, CHCl₃ 분획물, BuOH 분획물, 그리고 분리한 ursolic acid와 rosmarinic acid이었다. 그리고 caffeic acid의 dimer인 rosmarinic acid 구조를 고려하여 caffeic acid와 trimer 구조인 salvianolic acid를 추가하여 실험에 사용하였다.
저자들은 본 실험에서 저자들의 흥미와 관심에 따라 rosmarinic acid 이외에 caffeic acid, salvianolic acid를 실험에 사용하였다. 이 중 caffeic acid는 Sigma사 제품을, salvianolic acid는 단삼에서 분리하여 본 연구실에서 보유중인 화합물을 사용하였다. 그 결과 Fig.

데이터처리

NO 생산을 50%로 낮추는 농도를 IC₅₀치로 하였다. 이것은 Table Curve 2D v5.01 (Systat Software Inc., San Jose, CA, USA)를 이용하여 non-linear regression 분석을 통해 계산하였다.

이론/모형

IR spectrum은 JASCO 4200 FT-IR spectrometer를 사용하여 KBr disk 법으로 측정하였다. ¹H 및 ¹³C-NMR spectrum은 Bruker AM-600 spectrometer에서 tetramethylsilane (TMS)를 내부표준물질로 하여 측정하였다.

성능/효과

3에서 나타낸 바와 같이 10 ㎍/mL, 20 ㎍/mL, 40 ㎍/mL 농도에서 LPS로 유도한 대식세포의 NO 생산을 농도의존적으로 저해함을 알 수 있다. 그러므로 쉽싸리에 존재하는 ursolic acid가 NO 생산을 저해한 결과에 따라 민간에서 사용되는 쉽싸리의 항염증 효과는 이 화합물에 따른 것임을 알 수 있었다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	NO의 장단점은?	NO는 염증의 발생에서 중요한 역할을 하는 신호전달을 위한 분자이다. NO는 생리적 조건에서 항염효과를 나타내지만, 이의 과도한 생산은 염증유발 매개체로 작용할 수 있다. NO는 대식세포에서 nitric oxide synthase의 작용에 의해 생산되어 혈관내피세포로 들어가서 혈관확장을 일으킬 뿐 아니라 cytokine으로 활성화된 대식세포의 면역반응을 일으킨다.
	NO가 염증반응을 일으키는 이유는?	NO는 생리적 조건에서 항염효과를 나타내지만, 이의 과도한 생산은 염증유발 매개체로 작용할 수 있다. NO는 대식세포에서 nitric oxide synthase의 작용에 의해 생산되어 혈관내피세포로 들어가서 혈관확장을 일으킬 뿐 아니라 cytokine으로 활성화된 대식세포의 면역반응을 일으킨다. 이러한 과정에 따라 관절, 장관, 폐 등에서 염증반응을 나타내게 된다(Sharma et al.
	NO은 무엇인가?	NO는 염증의 발생에서 중요한 역할을 하는 신호전달을 위한 분자이다. NO는 생리적 조건에서 항염효과를 나타내지만, 이의 과도한 생산은 염증유발 매개체로 작용할 수 있다.

참고문헌 (7)

Kim, S.J., H.T. Shin, J.B. An, J.W. Yoon, J.W. Lee, S.Y. Jung and T.I. Heo. 2017. Flora of Mt. Samyeong (Yanggu-gun, Gangwon-do) in DMZ area of Korea, Korean J. Plant Res. 30:191-212.

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Murata, T., M. Watahiki, Y. Tanaka, T. Miyase and F. Yoshizaki. 2010. Hyaluronidase Inhibitors from Takuran, Lycopus lucidus. Chem. Pharm. Bull. 58:394-397.

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Seebacher, W., N. Simic, R. Weis, R. Saf and O. Kunert. 2003. Complete assignments of 1H and 13C NMR resonances of oleanolic acid, 18 ${\alpha}$ oleanolic acid, ursolic acid and their 11oxo derivatives. Magn. Reson. Chem. 41:636-638.

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Sharma, J.N., A. Al-Omran and S.S. Parvathy. Role of nitric oxide in inflammatory diseases. 2007. Inflammopharmacol. 15:252-259.

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Shin, T.Y., S.H. Kim, K. Suk, J.H. Ha, I. Kim, M.G. Lee, C.D. Jun, S.Y. Kim, J.P. Lim, J.S. Eun, H.Y. Shin and H.M. Kim. 2005. Anti-allergic effect of Lycopus lucidus on mast cellmediated allergy model. Toxicol. Appl. Pharmacol. 209:255-262.

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Slusarczyk, S., M. Hajnos, K. Skalicka-Wozniak and A. Matkowski. 2009. Antioxidant activity of polyphenols from Lycopus lucidus Turcz. Food Chem. 113:134-138.

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Woo, E.R. and M.S. Piao. 2004. Antioxidative constituents from Lycopus lucidus, Arch. Pharm. Res. 27:173-176.

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