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문제 정의
- 또한 교맥은 체내 장부의 열독을 풀어주어 종기 궤양 등의 치료에 활용되어 왔으므로10,11), 알러지성 염증질환에서 핵심적인 역할을 담당하는 비만세포의 활성화를 억제할 수 있는지 조사하였다.
- 본 연구는 FE가 알러지의 발생기작에서 중요한 역할을 담당하는 비만세포의 탈과립과 후기 염증반응을 유발하는 cytokine 및 ROS의 생산에 대한 억제효과를 조사하고 MAPK와 NF-κB 신호전달기전에 대해 연구하였다.
- 본 연구는 RBL-2H3 세포를 이용하여 anti-DNP IgE와 DNP-HSA으로 알러지성 염증반응을 유발하고 비만세포 탈과립과 cytokine, ROS의 생산과 MAPK 및 NFκB의 신호전달에 미치는 교맥 추출물의 억제효과를 살펴보았다.
제안 방법
- RBL-2H3 cells를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 48 well plate(Corning, USA)에 5×104cells/㎖의 세포수가 되도록 분주하여 37℃ 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. FE를 농도별(0, 10, 20, 30, 40 및 50㎎/㎖)로 처리한 후 1시간 동안 반응시켰다. 배양액을 제거 한 후 5㎎/㎖의 MTT를 각 well에 넣고 잘 섞어 준 후 4시간 37℃ incubator에서 배양한 후 tetrazolium bromide salt를 제거하고 DMSO를 150㎕씩 분주하여 well에 생성된 formazan이 잘 녹을 수 있게 충분히 흔들어 모두 녹인 후 microplate reader (Molecular Devices, USA)를 사용하여 570㎚에서 흡광도를 측정하여 평균값과 표준 편차를 구하였다.
- Microplate reader(Molecular Devices Co. Ltd., USA)를 사용하여 450㎚에서 흡광도를 측정하여 누출된 IL-4와 TNF-α의 양을 계산하였다.
- 1% Tween 20)에 용해된 5% skim milk에 1시간동안 실온에서 blocking한 후 anti-p-ERK와 anti-ERK, anti-p-JNK와 anti- JNK, anti-p-p38, anti-p38, anti-NFκB, anti-p-Iκ Bα, anti-IκBα와 β-actin primary antibody(1 : 1000 dilution)로 4℃에서 overnight 반응한 후 TBST로 3회 세척하고, HRP-conjugated secondary antibody(1 : 1000 dilution)로 1시간동안 실온에서 반응시켰다. TBST로 3회 세척한 후 ECL system (Amersham)을 이용하여 발색시켰다.
- , Korea)를 사용하여 45℃에서 30분, 94℃에서 5 분간 반응시킨 후 94℃에서 30초간 denaturation시키고, 55-60℃에서 30초간 annealing시킨 다음, 72℃에서 1분간 extension시키는 cycle을 32회 반복한 뒤, 마지막 extension은 72℃에서 5분간 PCR machine (GeneAmp, PCR system 9700, USA)에서 수행하였다. 각 PCR products는 2% agarose gel에 loading하여 100V 조건에서 30분간 전기영동을 통하여 분석하였다. 각각의 primer의 염기서열은 다음과 같다(Table 1).
- 그 후 anti-DNP IgE(30ng/㎖)로 감작하고 37℃ 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. 각 well의 세포들을 Siraganian buffer(119mM NaCl, 5mM KCl, 0.4mM MgCl2, 25mM PIPES, 40mM NaOH, pH 7.2)로 2번 세척한 다음 각 well 당 5.6mM glucose, 1mM CaCl2와 0.1% BSA가 포함된 Siraganian buffer를 첨가하고 FE를 농도별(0, 20 및 40㎎/㎖)로 1시간 동안 37℃ 5% CO2 incubator에서 배양 한 후 DNP-HSA(10㎍/㎖)로 처리하여 1시간 동안 반응시키고 ice bath에서 10분 동안 방치한 후 반응을 종결시켰다. 상층액 20㎕를 96 well plate에 옮기고 substrate buffer(4-p-Nitrophenyl-N-acetyl-b-D-glucosami nide 1 mM, sodium citrate 0.
- 그 후 anti-DNP IgE(30ng/㎖)로 감작하고 37℃ 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. 각 well의 세포들을 Siraganian buffer(119mM NaCl, 5mM KCl, 0.4mM MgCl2, 25mM PIPES, 40mM NaOH, pH 7.2)로 2번 세척한 다음 각 well 당 5.6mM glucose, 1mM CaCl2와 0.1% BSA가 포함된 Siraganian buffer를 첨가하였다. 그 후 FE(0, 20 및 40㎎/㎖)를 처리하여 1시간 동안 37℃ 5% CO2 incubator에서 배양한 후 DNP-HSA(10㎍/㎖)를 처리한 후 4시간 동안 반응시키고 ice bath에서 10분 동안 방치한 후 반응을 종결시켰다.
- 1% BSA가 포함된 Siraganian buffer를 첨가하였다. 그 후 FE(0, 20 및 40㎎/㎖)를 처리하여 1시간 동안 37℃ 5% CO2 incubator에서 배양한 후 DNP-HSA(10㎍/㎖)를 처리한 후 4시간 동안 반응시키고 ice bath에서 10분 동안 방치한 후 반응을 종결시켰다. 상층액을 분리하여 5,000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 분리된 상층액을 -70℃에 보관하였다가 IL-4와 TNF-α ELISA kit(BD Biosciences Pharmingen, USA)를 사용하여 측정하였다.
- cells/㎖)은 37℃에서 30분동안 10μM DCFH-DA로 배양되었다. 그 후 PBS로 배지에 남아 있는 DCFH-DA를 제거한 후 FE(0, 20 및 40㎎/㎖)를 처리하여 30분동안 배양하고 DNP-HSA (10㎍/㎖)에 10분동안 자극하였다. 얼음 위에서 반응을 정지시킨 후 490㎚(excitation)과 530㎚(emission)에서 fluorometer (SPECTRAMAX M2, Molecular Devices Co.
- FE를 농도별(0, 10, 20, 30, 40 및 50㎎/㎖)로 처리한 후 1시간 동안 반응시켰다. 배양액을 제거 한 후 5㎎/㎖의 MTT를 각 well에 넣고 잘 섞어 준 후 4시간 37℃ incubator에서 배양한 후 tetrazolium bromide salt를 제거하고 DMSO를 150㎕씩 분주하여 well에 생성된 formazan이 잘 녹을 수 있게 충분히 흔들어 모두 녹인 후 microplate reader (Molecular Devices, USA)를 사용하여 570㎚에서 흡광도를 측정하여 평균값과 표준 편차를 구하였다.
- 상층액을 분리하여 5,000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 분리된 상층액을 -70℃에 보관하였다가 IL-4와 TNF-α ELISA kit(BD Biosciences Pharmingen, USA)를 사용하여 측정하였다.
- 새로운 DMEM 배지로 교환한 후 FE를 농도별(0, 20 및 40㎎/㎖)로 세포에 처리하여 1시간동안 배양한 후 PBS로 2회 세척한 다음 DNP-HSA(10μg/㎖)을 4시간동안 처리하여 면역반응을 유도하였다.
- 그 후 anti DNP-IgE(30ng/㎖)로 감작하고 37℃ 5% CO2 incubator에서 24시간동안 배양하였다. 새로운 DMEM 배지로 교환한 후 FE를 농도별(0, 20 및 40㎎/㎖)로 세포에 처리하여 1시간동안 배양한 후 PBS로 2회 세척한 다음 DNP-HSA(10㎍/㎖)을 1시간동안 처리하여 면역반응을 유도하였다. 반응 후 cells는 cold PBS로 2회 세척한 다음, 0℃에서 low salt buffer를 첨가하여 부드럽게 pipetting하고 15분동안 ice위에 방치한 후 10% Igepal CA-630을 첨가하여 강하게 vortexing하였다.
- 알러지 초기반응의 지표인 탈과립에 대한 억제효과를 살펴보기 위하여 β-hexosaminidase의 분비를 측정하였다12).
- 그 후 PBS로 배지에 남아 있는 DCFH-DA를 제거한 후 FE(0, 20 및 40㎎/㎖)를 처리하여 30분동안 배양하고 DNP-HSA (10㎍/㎖)에 10분동안 자극하였다. 얼음 위에서 반응을 정지시킨 후 490㎚(excitation)과 530㎚(emission)에서 fluorometer (SPECTRAMAX M2, Molecular Devices Co. Ltd. USA)를 사용하여 ROS에 의해 산화된 DCF의 양을 측정하였다.
대상 데이터
- RBL-2H3은 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank, KCLB)에서 분양받아 배양하였다. 세포의 배양을 위하여 10% heat-inactivated FBS(Gibco BRL, USA)과 1% penicillin 및 streptomycin(Gibco BRL, USA)을 포함한 DMEM(Gibco BRL, USA) 배양액에서 배양하였다.
- 본 실험에 사용된 교맥(Fagopyrum esculentum: FE)는 옴니허브(대구, 한국)에서 구입하여 사용하였다. FE 100g을 증류수로 水洗하여 1L의 75% Ethanol을 加하여 incubator(iNtRON BIOTECHNOLOGY CO.
- RBL-2H3은 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank, KCLB)에서 분양받아 배양하였다. 세포의 배양을 위하여 10% heat-inactivated FBS(Gibco BRL, USA)과 1% penicillin 및 streptomycin(Gibco BRL, USA)을 포함한 DMEM(Gibco BRL, USA) 배양액에서 배양하였다. 세포는 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였고, 세포의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 0.
데이터처리
- 成績은 SPSS 17.0K for Windows 통계 프로그램패키지를 사용하여 평균치±표준편차로 나타내었고 유의수준은 P<0.05로 하였다.
- 05로 하였다. 각 실험군 간의 통계학적 분석은 one way-ANOVA와 Dunett test 검정을 실시하였다.
이론/모형
- cells/㎖) were treated with the indicated concentrations(0, 10, 20, 30, 40, and 50㎎/㎖) of FE for 1 hr. Cell viability was evaluated using a colorimetric assay based on MTT assay. Results represent as the mean±SD.
- IL-4 and TNF-α concentration was measured from cell supernatant using ELISA method.
- RBL-2H3 세포의 생존 및 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT법을 사용하였다. RBL-2H3 cells를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 48 well plate(Corning, USA)에 5×104cells/㎖의 세포수가 되도록 분주하여 37℃ 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다.
- 세포내 ROS의 분비는 Nakano 등13)의 방법에 의해 측정하였다.
성능/효과
- FE(20 and 40㎎/㎖)를 처리한 세포에서 p-IκBα의 발현이 억제되고 IκBα의 발현이 증가하였다(Fig. 6B).
- RBL-2H3 cells에서 분비된 IL-4의 양은 아무런 처리를 하지 않은 세포에서 1.27±0.14pg/㎖이었으며, 항원으로 자극한 세포에서 10.05±0.82pg/㎖로 아무런 처리를 하지 않은 세포에 비해 유의한(p<0.05) 증가를 나타내었다.
- RBL-2H3 cells에서 염증성 cytokine의 발현에 대해 조사한 결과, 아무런 처리를 하지 않은 세포에 비해 항원으로 자극한 세포에서 IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, TNF-α과 GM-CSF mRNA의 발현량이 현저하게 증가하였으며, FE(20 and 40㎎ /㎖)를 처리한 세포에서 mRNA의 발현이 농도의존적으로 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 3).
- RBL-2H3 cells에서의 ERK1/2, JNK1/2와 p38의 발현에 대해 조사한 결과, 아무런 처리를 하지 않은 세포에 비해 항원으로 자극한 세포에서 p-ERK1/2, p-JNK1/2와 p38의 발현이 증가하였으며, FE(20 and 40㎎/㎖)를 처리한 세포에서 p-ERK1/2, p-JNK1/2와 p38의 발현이 억제하는 것으로 보아 FE가 ERK1/2, JNK1/2와 p38의 인산화를 억제하는 것으로 나타났다(Fig. 5).
- RBL-2H3 cells에서의 항원자극에 의해 유도된 ROS의 양을 60분 동안 조사한 결과, 항원으로 자극한 후 FE를 전처리하지 않은 세포에서 ROS 증가률은 시간에 비례하여 증가하는데 비해, FE(20 and 40㎎/㎖)을 처리한 세포에서 ROS 증가률은 농도에 비례하여 상대적으로 낮은 농도를 유지하며 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 4).
- RBL-2H3 cells에서의 핵내로 전이된 NFκB의 발현에 대해 조사한 결과 아무런 처리를 하지 않은 세포에 비해 항원으로 자극한 세포에서 NFκB의 발현이 증가하였으며, FE(20 and 40㎎/㎖)를 처리한 세포에서 NFκB의 발현이 억제하였다(Fig. 6A).
- RBL-2H3 세포의 생존 및 증식에 미치는 영향을 알아본 결과 FE를 처리하지 않은 세포는 0.89±0.05의 흡광도를 나타내었고, FE를 농도별(10, 20, 30, 40 및 50㎎/㎖)로 처리한 세포에서 각각 0.93±0.04, 0.91±0.09, 0.94±0.06, 0.97±0.05, 및 1.04±0.06의 흡광도를 나타내어 모든 농도에서 세포생존에 영향을 미치지 않았고 50㎎/㎖의 농도에서 유의한 세포증식이 관찰되었다(Fig. 1A).
- 또한 RBL-2H3 cells에서 분비된 TNF-α의 양은 아무런 처리를 하지 않은 세포에서 15.50±0.68pg/㎖이었으며, 항원으로 자극한 세포에서 34.84±1.11pg/㎖로 아무런 처리를 하지 않은 세포에 비해 유의한(p<0.05) 증가를 나타내었다.
- 본 연구에서 FE는 IL-4과 TNF-α의 생산을 유효하게 억제하였고, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, TNF-α와 GM-CSF 같은 다양한 비만세포 유래 사이토카인의 유전자 발현을 억제하였다.
- . 본 연구에서 FE는 세포내 ROS의 생산을 억제하는 결과를 나타내었고 이는 FE의 항산화 효능24)에 대한 보고와 일치하는 결과로서 ROS 억제를 통한 탈과립과 사이토카인 생산을 억제할 수 있을 것으로 생각된다.
- 그러므로 β-hexosaminidase의 측정은 비만세포의 활성과 탈과립을 억제하는 효능을 조사하는데 널리 활용되는 방법이다15). 본 연구에서 FE은 비만세포 생존률에 영향을 미치지 않는 농도에서 처리되었고, 항원으로 유도된 비만세포의 탈과립을 현저히 억제하였다.
- 세포질내 IκBα의 발현에 대해 조사한 결과, 아무런 처리를 하지 않은 세포에 비해 항원으로 자극한 세포에서p-IκBα의 발현이 증가하였으며, IκBα의 발현은 감소하였다.
- 이를 종합해 볼 때 FE는 비만세포 탈과립과 cytokine의 생산가 유전자의 발현 억제하는데 이는 세포내 ROS의 생성을 억제하고, MAPK 신호전달경로와 NFκB의 핵내 전이를 저해함으로써 비만세포의 활성을 억제하는 것으로 생각된다.
- 항원-항체 결합단계에서 β -hexosaminidase 분비에 미치는 FE의 효과를 살펴본결과 FE 20㎎/㎖ 농도에서 47.39±10.50%의 억제효과를 나타내었고, FE 40㎎/㎖ 농도에서 46.36±6.06% 46.36±6.06%의 억제효과를 나타내 모든 농도에서 유의성있는 억제효과를 나타내었다(Fig. 1B).
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