[논문]LPS에 의해 활성화된 미세아교세포에서 흰점박이꽃무지 유래 항균 펩타이드 Protaetiamycine 6의 신경염증 억제 효과

이화정; 서민철; 백민희; 신용표; 이준하; 김인우; 황재삼; 김미애

doi:10.5352/jls.2020.30.12.1078

LPS에 의해 활성화된 미세아교세포에서 흰점박이꽃무지 유래 항균 펩타이드 Protaetiamycine 6의 신경염증 억제 효과
Inhibitory Effect of Protaetiamycine 6 on Neuroinflammation in LPS-stimulated BV-2 Microglia 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.30 no.12, 2020년, pp.1078 - 1084

초록
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흰점박이꽃무지는 딱정벌레목 풍뎅이과에 속하는 곤충이며, 현재 국내에서는 식용곤충 자원으로써 단백질 공급원일 뿐만 아니라 간보호 효과와 혈행개선 등에 유용한 생리활성 물질을 다량 함유하고 있는 것으로 보고되고 있다. 항균 펩타이드(antimicrobial peptide, AMP)는 미생물에서부터 포유동물에 이르기까지 다양한 종에서 발견되며 생명체의 선천성 면역체계에서 중요한 역할을 한다. 또한 AMPs는 광범위하게 항균활성을 나타내며 면역, 거부 반응, 내성 등의 문제없이 자연적으로 생성된 자연항생제로 알려져 있다. 활성화된 미세아교세포는 tumor necrosis factor-α (TNF-α), nitric oxide (NO) 및 reactive oxygen species (ROS) 등의 염증매개물질들을 다량 분비하는데 이러한 염증매개물질들은 신경세포사멸의 주원인으로 작용하게 된다. 그러므로 본 연구에서는 미세아교세포를 이용하여 흰점박이꽃무지 유래 항균 펩타이드 Protaetiamycine 6의 신경염증 억제 효과를 조사하였다. 그 결과, Protaetiamycine 6는 LPS에 의해서 증가한 NO 생성을 현저히 억제하였고, iNOS와 COX-2 발현량을 감소시켰으며 LPS에 의해 분비되는 염증성 cytokine의 생성량도 농도의존적으로 감소시켰다. 이러한 결과로 보아 Protaetiamycine 6는 신경염증 및 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료 기능성 소재 개발에 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Protaetia brevitarsis seulensis is an insect belonging to the order Coleoptera. This insect is reported to contain large amounts of physiologically active substances useful for liver protective effect and improvements in blood circulation as well as a broad source of edible protein. Antimicrobial peptides (AMPs) are found in a variety of species, from microorganisms to mammals, and play an important role in the innate immune systems of living things. Microglia are the main source of proinflammatory cytokines and nitric oxide (NO) in the central nervous system. Activated microglia secrete large amounts of neuroinflammatory mediators (e.g., TNF-α, NO, and ROS), which are the main cause of neuronal cell death. In the present study, we investigated the inhibitory effect of Protaetiamycine 6 (PKARKLQKLSAYKTTLRN-NH2), an AMP derived from Protaetia brevitarsis seulensis, on LPS-induced neuroinflammation in BV-2 microglia. Protaetiamycine 6 significantly inhibited NO production without cytotoxicity and decreased the expression levels of inducible NO synthase and cyclooxygenase-2. In addition, Protaetiamycine 6 also reduced the production of neuroinflammatory cytokines on activated BV-2 microglia. These results suggest that Protaetiamycine 6 could be a good source of functional substance to prevent neuroinflammation and neurodegenerative diseases.

주제어

표/그림 (6)

그림 Fig. 1. Protaetiamycine 6 on the cell viability in BV-2 microglia. BV-2 microglia (2×10⁴ cells/well in a 96-well plate) were incubated with Protaetiamycine 6 for 24 hr, and cell via-bility was assessed using MTS assay. CTR: control (non-treated sample). Protaetiamycine 6: antimicrobial peptide derived from the Protaetia brevitarsis seulensis. Level of significance was identified statistically using Student's test.
표 Table 1. Sequences of primes used for RT-PCR
그림 Fig. 2. Inhibitory effect of Protaetiamycine 6 extract on the pro-duction of nitric oxide in BV-2 microglia. BV-2 microglia (4×10⁴ cells/well in a 96-well plate) were cultured with LPS (100 ng/ml) in the presence or absence of Protaetia-mycine 6 for 24 hr to determine the level of NO. CTR: control (non-treated sample). Protaetiamycine 6 (PTM): antimicrobial peptide derived from the Protaetia brevi-tarsis seulensis. Level of significance was identified stat-istically using Student’s test. #p<0.05, in comparison with control group. ***p<0.001, ** p<0.01 *p<0.05 in compar-ison with the LPS group.
그림 Fig. 3. Inhibitory effect of Protaetiamycine 6 on iNos and Cox-2 expression in LPS stimulated BV-2 microglia. BV-2 microglia (4×10⁵ cells/well in a 6-well plate) were pretreated with Protaetiamycine 6 for 1 hr prior to incubation with LPS (100 ng/ml). RNA was isolated at 5 hr after the LPS treatment. The level of iNos (A) and Cox-2 (B) mRNA were determined by quantitative real-time RT-PCR. The data were normalized to the housekeeping gene glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase (Gapdh). CTR: control (non-treated sample). Protaetiamycine 6 (PTM): antimicrobial peptide derived from the Protaetia brevitarsis seulensis. Level of significance was identified statistically using Student’s test. #p<0.05, in comparison with control group. ***p<0.001, ** p<0.01 *p<0.05 in comparison with the LPS group.
그림 Fig. 4. Inhibitory effect of Protaetiamycine 6 on the protein levels of iNOS and COX-2 in LPS stimulated BV-2 microglia. BV-2 microglia (4×10⁵ cells/well in a 6-well plate) were pretreated for 24 hr, and the cell were stimulated with LPS (100 ng/ml) in the presence of Protaetiamycine 6 for 24 hr. (A) The expression level of iNOS and COX-2 were determined by Western blot. (B) The data were normalized to β-actin. Results of densitometric analysis of Western blot are also shown. CTR: control (non-treated sample). Protaetiamycine 6 (PTM): antimicrobial peptide derived from the Protaetia brevitarsis seulensis. Level of significance was identified statistically using Student’s test. #p<0.05, in comparison with control group. ***p<0.001, ** p<0.01 *p<0.05 in comparison with the LPS group.
그림 Fig. 5. Inhibitory effect of Protaetiamycine 6 on the production of proinflammatory cytokine in LPS stimulated BV-2 microglia. BV-2 microglia (4×10⁵ cells/well in a 6-well plate) were pretreated for 24 hr, and the cell were stimulated with LPS (100 ng/ml) in the presence of Protaetiamycine 6 for 24 hr. (A) IL-6 and TNF-α in the culture media were measured by ELISA. (B) BV-2 microglia (4×10⁵ cells/well in a 6-well plate) were pretreated with Protaetiamycine 6 for 1 hr prior to incubation of LPS (100 ng/ml). RNA was isolated at 5 hr after the LPS treatment. The levels of Il-6, Tnf-α and Il-1β mRNA were determined by quantitative real-time RT-PCR. The data were normalized to Gapdh. CTR: control (non-treated sample). Protaetiamycine 6 (PTM): antimicrobial peptide derived from the Protaetia brevitarsis seulensis. Level of significance was identified statistically using Student’s test. #p<0.05, in comparison with control group. ***p<0.001, ** p<0.01 *p<0.05 in comparison with the LPS group.

AI 본문요약
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제안 방법

다음으로 염증성 cytokine (TNF-α, IL-6, IL-1β)의 유전자 발현 수준에서 Protaetiamycine 6의 효과를 확인하기 위해 real-time PCR를 수행 하였으며(Fig

대상 데이터

흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis seulensis)는 국립농업 과학원의 곤충사육동에서 사육된 것을 사용하였고 먹이원은 발효톱밥을 사용하였으며 28℃, 70%의 상대습도 조건으로 16L : 8D의 광주기로 사육하였다.

데이터처리

모든 실험은 3회 반복하여 측정하였고, 그 결과는 평균값 ± 표준편차로 나타냈다
실험결과의 통계적 분석은 SPSS 10.0 프로그램을 이용하여 각 처리구간의 유의성 검증을 실시하였고 유의성은 p<0.05로 하였다.

이론/모형

Protaetiamycine 6는 애니젠㈜에서 고상법을 이용하여 합성하였고, 순도 95% 이상의 펩타이드를 사용하였다. 합성한 펩타이드는 -20℃에서 보관하다가 산성화시킨 증류수(0.
이상의 결과에서 우리는 LPS에 의해 과하게 활성화된 BV-2 세포로부터 생성되는 PGE2의 합성효소인 Cox-2 유전자 발현과 NO의 합성효소인 iNos의 유전자 발현이 Protaetiamycine 6에 의해 억제되는 것을 확인하였다. 따라서 우리는 과하게 활성화된 BV-2 세포에서 Protaetiamycine 6가 iNOS와 COX-2 단백질 발현 또한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 Western blot으로 분석하였다(Fig. 4).

성능/효과

BV-2 세포에 LPS만 단독으로 처리한 경우 IL-6, TNF-α 그리고 IL-1β의 발현량이 대조군에 비해 현저히 증가하는 것을 확인하였으며, Protaetiamycine 6에 의해 농도 의존적으로 유전자의 발현이 억제되는 것을 확인하였다.
그 결과 LPS에 의해 증가한 IL-6와 TNF-α의 발현량이Protaetiamycine 6에 의해 농도 의존적으로 감소됨을 관찰할 수 있었다(Fig
그 결과 iNOS와 COX-2 단백질의 발현은 BV-2 세포에 LPS를 단독으로 처리하여 염증반응을 유도하였을 때 대조군에 비해 iNOS의 경우는 약 14배, COX-2의 경우는 3배 정도 발현량이 증가하였으며, Protaetiamycine 6을 농도별(10~80 μg/ml)로 함께 처리한 경우 펩타이드의 처리농도에 의해 iNOS, COX-2 단백질의 발현이 농도 의존적으로 억제됨을 확인할 수 있었다
그 결과 iNOS와 COX-2 단백질의 발현은 BV-2 세포에 LPS를 단독으로 처리하여 염증반응을 유도하였을 때 대조군에 비해 iNOS의 경우는 약 14배, COX-2의 경우는 3배 정도 발현량이 증가하였으며, Protaetiamycine 6을 농도별(10~80 μg/ml)로 함께 처리한 경우 펩타이드의 처리농도에 의해 iNOS, COX-2 단백질의 발현이 농도 의존적으로 억제됨을 확인할 수 있었다. 따라서Protaetiamycine 6은 초기 염증반응 조절인자인 iNos, Cox-2 유전자 및 iNOS, COX-2 단백질 발현을 억제함으로써 신경염증반응이 조절됨을 확인하였고, 나아가 염증 반응을 기반으로 하는 다양한 퇴행성 뇌질환 치료를 위한 기능성 소재로 활용 가능성이 높을 것으로 판단된다.
이상의 결과에서 우리는 LPS에 의해 과하게 활성화된 BV-2 세포로부터 생성되는 PGE2의 합성효소인 Cox-2 유전자 발현과 NO의 합성효소인 iNos의 유전자 발현이 Protaetiamycine 6에 의해 억제되는 것을 확인하였다. 따라서 우리는 과하게 활성화된 BV-2 세포에서 Protaetiamycine 6가 iNOS와 COX-2 단백질 발현 또한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 Western blot으로 분석하였다(Fig.

후속연구

이러한 결과는 항균펩타이드 Protaetiamycine 6이 염증성 cytokine의 생성을 현저히 억제함으로써 신경염증 억제 효능을 가지며 결과적으로 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료에 도움을 줄 수 있는 의료용 소재개발에 이용 가능할 것으로 판단된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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