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문제 정의
- 0와 37℃를 나타내었다. 본 연구에서는 T. velutina JS18 유래 laccase가 촉매하는 멜라닌 탈색 반응에서 redox mediator로써 HBT의 적용 가능성을 확인하였다.
- 본 연구에서는 사람 머리카락 유래의 천연 멜라닌 및 합 성 멜라닌에 대하여 탈색 효능을 나타내는 새로운 진균류를 선별하고, 진균류가 생산하는 멜라닌 탈색효소의 생산, 정제 및 특성에 대하여 검토하였다.
- 5 mM CuSO4를 동시에 첨가할 경우 laccase 생산량이 매우 증가하는 것으로 보고된 바 있다[25]. 본 연구의 T. velutina JS18의 경우에도 같은 laccase inducer가 laccase 생산 유도 효과를 갖는지 확인하기 위하여 GYP 배지에 1 mM syringic acid 및 0.5 mM CuSO4를 단독 또는 동시에 첨가하고 7일 동안 배양하면서 T. velutina JS18의 배양 상 등액을 대상으로 laccase 활성을 측정하였다. 그 결과 1 mM syringic acid 및 0.
제안 방법
- Laccase 유도인자 로써 Syringic acid 및 CuSO4를 첨가하고 25℃에서 7일간 배양한 결과 배양상등액에서 98 U/ml의 laccase 활성을 나타내었다. GYP 배지에서 배양한 T. velutina의 배양상등액 에서 ammonium sulfate 침전, Hi-trap Q Sepharose 컬럼 및 gel filtration을 이용하여 효소를 정제하였고, SDS-PAGE 에서 약 67 kDa의 분자량을 나타내었다. 정제된 효소의 멜 라닌 탈색율은 효소 단독으로는 24시간 만에 단지 4% 만을 나타내는 반면, HBT의 존재 하에서는 80%로 향상되었다.
- 0 × 105 까지 순차적으로 희석하고, ampicillin (100 μg/ ml)이 첨가된 potato dextrose agar (PDA) 평판배지 상에 접 종하여 25℃에서 3−5일간 배양하였다. 총 132종의 분리된 진균류에서 멜라닌 탈색능을 가진 균주를 선별하기 위하여 배양된 PDA 평판배지 상의 균사를 직경 5 mm의 cork borer 로 agar plug를 만들어 human hair melanin (0.6 g/l)을 첨가한 malt extract dextrose broth (MDB) 배지(glucose 4 g/l, malt extract 10 g/l, peptone 4 g/l, agar 15 g/l)에 접 종하고 25℃에서 120 rpm으로 1−2주간 배양하였다. 투명환 을 형성한 균주는 동일한 배지에 계대 배양하여 4℃에 보관 하였고, 이후 분석시험에 이용하였다.
- 분리된 균주를 동정하기 위하여 Internal transcribed spacer (ITS) 염기서열을 분석하였다. 분리된 균주를 Potato dextrose broth (PDB) 배지에 접종하고 25℃에서 120 rpm 으로 7−10일 동안 배양한 후, 배양액을 membrane filter (pore size, 7 μm)을 이용하여 곰팡이 균사를 거른 뒤 멸균 증 류수로 3회 반복하여 씻어 내었다.
- 분리된 균주를 Potato dextrose broth (PDB) 배지에 접종하고 25℃에서 120 rpm 으로 7−10일 동안 배양한 후, 배양액을 membrane filter (pore size, 7 μm)을 이용하여 곰팡이 균사를 거른 뒤 멸균 증 류수로 3회 반복하여 씻어 내었다. Genomic DNA 추출은 GenEx Genomic DNA extraction kit (Gene All, Korea)를 이용하였으며, ITS 영역의 증폭은 ITS1 (5′-TCCGTAGGT GAACCTGCGG-3′)과 ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC3′) 프라이머를 사용하였다. PCR 반응은 pre-denaturation (95℃, 5 min), denaturation (94℃, 1 min), annealing (58℃, 30 sec), extension (72℃, 1 min 30 sec) 과정을 35회 실시 하고, 최종적으로 72℃, 10 min 동안 반응하여 rDNA-ITS 영역을 증폭하였다.
- Genomic DNA 추출은 GenEx Genomic DNA extraction kit (Gene All, Korea)를 이용하였으며, ITS 영역의 증폭은 ITS1 (5′-TCCGTAGGT GAACCTGCGG-3′)과 ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC3′) 프라이머를 사용하였다. PCR 반응은 pre-denaturation (95℃, 5 min), denaturation (94℃, 1 min), annealing (58℃, 30 sec), extension (72℃, 1 min 30 sec) 과정을 35회 실시 하고, 최종적으로 72℃, 10 min 동안 반응하여 rDNA-ITS 영역을 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물은 1.
- PCR 반응은 pre-denaturation (95℃, 5 min), denaturation (94℃, 1 min), annealing (58℃, 30 sec), extension (72℃, 1 min 30 sec) 과정을 35회 실시 하고, 최종적으로 72℃, 10 min 동안 반응하여 rDNA-ITS 영역을 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물은 1.0% agarose 상에서 전기영동하여 UV illuminator에서 확인하였으며, Gel SV Kit (Gene All)를 이용하여 정제한 후에 pGEM-T easy vector (Promega, USA)에 cloning하여 ABI3730XL DNA analyzer (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 분석하였다.
- 5 mM CuSO4, 1 mM syringic acid)가 첨가된 1 l의 GYP 배지에 접종하고 25℃에서 130 rpm으로 7일 동안 본배양하였다. 또한, 균주를 접종하지 않은 GYP 배지에 1 mM syringic acid 및 0.5 mM CuSO4를 단독 또는 동시에 첨가하고 동일조건에서 7일간 배양한 후 laccase 활성을 측정하여 대조구 값으로 설정하였다.
- 1 mM CuSO4) 에 녹인 후 같은 buffer로 24시간 투석하였다. 투석한 단백 질은 ÄKTAprime (GE Healthcare)을 이용하여 HiTrap Q HP column에 loading한 후 0−1.0 M의 NaCl로 농도구배를 주어 결합된 단백질을 용출하였다. 용출된 획분은 멜라닌 탈 색 활성을 측정하여 활성이 있는 획분을 모아 Amicon centricon-10 filter (Milipore)로 농축한 다음 buffer B (50 mM sodium phosphate, pH 6.
- 0 M의 NaCl로 농도구배를 주어 결합된 단백질을 용출하였다. 용출된 획분은 멜라닌 탈 색 활성을 측정하여 활성이 있는 획분을 모아 Amicon centricon-10 filter (Milipore)로 농축한 다음 buffer B (50 mM sodium phosphate, pH 6.0, 150 mM NaCl)로 투 석하였다. 투석한 용액은 SuperdexTM 200 column (GE Healthcare)에 로딩한 후 buffer B로 용출하고 멜라닌 탈색 활성을 측정하여 활성이 있는 획분을 모아 Amicon centricon10 filter (Milipore)로 농축하였다.
- 0, 150 mM NaCl)로 투 석하였다. 투석한 용액은 SuperdexTM 200 column (GE Healthcare)에 로딩한 후 buffer B로 용출하고 멜라닌 탈색 활성을 측정하여 활성이 있는 획분을 모아 Amicon centricon10 filter (Milipore)로 농축하였다. 단백질의 정제도는 SDSPAGE (10% acrylamide gel)을 통하여 확인하였고, 전기영 동 밴드는 coomassie를 사용하여 염색하였다.
- 투석한 용액은 SuperdexTM 200 column (GE Healthcare)에 로딩한 후 buffer B로 용출하고 멜라닌 탈색 활성을 측정하여 활성이 있는 획분을 모아 Amicon centricon10 filter (Milipore)로 농축하였다. 단백질의 정제도는 SDSPAGE (10% acrylamide gel)을 통하여 확인하였고, 전기영 동 밴드는 coomassie를 사용하여 염색하였다.
- 멜라닌 탈색 반응은 곰팡이 유래의 laccase [18], manganese peroxidase [15], lignin peroxidase [17] 중 한가지 효소에 의해 촉매되는 것으로 알려져 있다. T. velutina JS18의 균 사체로부터 멜라닌 탈색에 관여하는 효소를 동정하기 위하여 JS18균주를 GYP 배지에 접종하고 25℃에서 7일간 배양 한 후 배양 상등액을 대상으로 laccase, manganese peroxidase, lignin peroxidase 활성을 조사하였다. 그 결과 T.
- 구리 이온은 laccase의 보결분 자단(prosthetic group)으로 알려져 있고, laccase 생산에 있어 방향족 화합물은 laccase isozyme의 분비율 향상, laccase 유전자의 전사 유도, 세포 외 단백질 분해활성의 감소에 기 여하는 것으로 보고된 바 있다[25]. JS18 균주를 GYP 배지 에 laccase inducer (0.5 mM CuSO4, 1 mM syringic acid) 를 첨가하고 7일동안 배양한 후, 배양 상등액의 효소를 ammonium sulfate 침전, 음이온 교환수지 및 gel filtration chromatography을 이용하여 정제하였다. 정제된 효소를 SDS-PAGE로 확인한 결과 약 67 kDa 부근에서 밴드가 확 인되었다(Fig.
- 따라서, laccase와 더불어 redox mediator가 함께 존재하면 hydroxyl radical이 생성되고 이것이 nonphenolic compound까 지 산화할 수 있기 때문에 난분해성 물질의 분해 효율이 상승할 수 있다. T. velutina JS18로부터 정제한 효소에 대하여 멜라닌 탈색 활성을 조사하기 위해 정제된 효소와 합성 멜라닌을 37℃에서 24시간 반응하였고, 여기에 다양한 redox mediator를 첨가하여 멜라닌 탈색율을 조사하였다. 그 결과 효소 단독으로 합성 멜라닌과 반응한 경우에는 단지 4%만 이 탈색되는 반면, 1 mM HBT를 mediator로 첨가한 경우에는 탈색율이 80%로 향상되었다(Fig.
- 정제된 멜라닌 탈색 효소의 pH 및 온도에 대한 영향을 알아보기 위하여 다양한 pH 및 온도 조건에서 1.5 mM HBT 및 합성 멜라닌과 함께 24시간 반응하고 멜라닌 탈색 활성을 조사하였다. 본 효소의 멜라닌 탈색에 대한 최적 pH는 5.
대상 데이터
- 경상남도 삼림 지역의 토양, 썩은 나무 등에서 채취한 100 여개의 샘플을 phosphate buffered saline (PBS)와 혼합한 후 1.0 × 105 까지 순차적으로 희석하고, ampicillin (100 μg/ ml)이 첨가된 potato dextrose agar (PDA) 평판배지 상에 접 종하여 25℃에서 3−5일간 배양하였다. 총 132종의 분리된 진균류에서 멜라닌 탈색능을 가진 균주를 선별하기 위하여 배양된 PDA 평판배지 상의 균사를 직경 5 mm의 cork borer 로 agar plug를 만들어 human hair melanin (0.
- 경상남도 삼림 지역의 토양, 고목 등에서 채취한 132종의 진균류에 대하여 사람 머리카락 유래 천연 멜라닌을 첨가한 MDB 고체 배지상에서 균사체를 배양하고, 투명환을 형성하는 균주를 선별하였다. 그 결과 고목에서 분리한 진균류 1종 에서 투명환이 확인되었다(Fig.
이론/모형
- (B) Phylogenetic tree. The tree was constructed using the neighbor joining method. The bar represents 0.
성능/효과
- 삼림지역의 고목에서 분리한 JS18 균주는 합성 멜라닌을 탈색하는 세포 외 분비효소를 생산했다. JS18 균주의 internal transcribed spacer (ITS) 염기서열을 분석하고 계 통학적으로 확인한 결과 본 균주는 Trametes velutina로 동 정되었다. JS18 균주는 laccase 활성을 나타냈지만 manganese peroxidase 및 lignin peroxidase 활성은 나타내지 않았다.
- JS18 균주는 laccase 활성을 나타냈지만 manganese peroxidase 및 lignin peroxidase 활성은 나타내지 않았다. 본 균주를 회분배양한 결과 멜라닌 탈색 활성은 laccase 활 성으로부터 유래하는 것으로 확인되었다. Laccase 유도인자 로써 Syringic acid 및 CuSO4를 첨가하고 25℃에서 7일간 배양한 결과 배양상등액에서 98 U/ml의 laccase 활성을 나타내었다.
- velutina의 배양상등액 에서 ammonium sulfate 침전, Hi-trap Q Sepharose 컬럼 및 gel filtration을 이용하여 효소를 정제하였고, SDS-PAGE 에서 약 67 kDa의 분자량을 나타내었다. 정제된 효소의 멜 라닌 탈색율은 효소 단독으로는 24시간 만에 단지 4% 만을 나타내는 반면, HBT의 존재 하에서는 80%로 향상되었다. 또한 1.
- 5 mM HBT의 농도에서는 최대 81%의 멜라닌 탈색 율을 나타내었다. 본 효소의 멜라닌 탈색에 대한 최적 pH 및 온도는 각각 5.0와 37℃를 나타내었다. 본 연구에서는 T.
- 경상남도 삼림 지역의 토양, 고목 등에서 채취한 132종의 진균류에 대하여 사람 머리카락 유래 천연 멜라닌을 첨가한 MDB 고체 배지상에서 균사체를 배양하고, 투명환을 형성하는 균주를 선별하였다. 그 결과 고목에서 분리한 진균류 1종 에서 투명환이 확인되었다(Fig. 1). 투명환을 형성한 균주를 동정하기 위하여 Internal transcribed spacer (ITS) 염기서 열을 분석하고 BLAST program을 이용하여 상동성을 분석한 결과 100%의 신뢰도로 Trametes velutina로 동정되어 본 균주를 Trametes velutina JS18로 명명하였다(Fig.
- 1). 투명환을 형성한 균주를 동정하기 위하여 Internal transcribed spacer (ITS) 염기서 열을 분석하고 BLAST program을 이용하여 상동성을 분석한 결과 100%의 신뢰도로 Trametes velutina로 동정되어 본 균주를 Trametes velutina JS18로 명명하였다(Fig. 2).
- velutina JS18의 균 사체로부터 멜라닌 탈색에 관여하는 효소를 동정하기 위하여 JS18균주를 GYP 배지에 접종하고 25℃에서 7일간 배양 한 후 배양 상등액을 대상으로 laccase, manganese peroxidase, lignin peroxidase 활성을 조사하였다. 그 결과 T. velutina JS18의 배양 상등액에서 manganese peroxidase 및 lignin peroxidase 활성은 나타나지 않았고, laccase의 기질에 대한 활성(8 unit/ml)만 확인되었다. 따라서, T.
- velutina JS18의 배양 상등액에서 manganese peroxidase 및 lignin peroxidase 활성은 나타나지 않았고, laccase의 기질에 대한 활성(8 unit/ml)만 확인되었다. 따라서, T. velutina JS18의 경우 배양액 중에 생산된 laccase가 멜라닌 탈색 활성을 나타내는 것으로 예상되었다. Laccase는 종류별로 다양한 기 질 특이성을 가지고 있기 때문에 곰팡이에서만 약 100여종 이상의 종류가 보고 되었지만[22], 현재까지 멜라닌을 탈색 시키는 laccase는 Phlebia radiata BP-11-2 [13], Lentinus polychrous Lév [14], Trametes versicolor [23] 및 Pheniophora sp.
- velutina JS18의 배양 상 등액을 대상으로 laccase 활성을 측정하였다. 그 결과 1 mM syringic acid 및 0.5 mM CuSO4를 단독으로 첨가한 경우에 는 대조구와 비교하여 laccase 활성이 각각 5배 및 4배씩 증 가하였고, 동시에 첨가한 경우에는 대조구와 비교하여 12배 활성이 증가하였다(Fig. 3). JS18 균주의 laccase 최대 활성 은 98 U/ml을 나타내었고, 기존 보고된 Trametes versicolor 유래 laccase의 활성(11.
- 3). JS18 균주의 laccase 최대 활성 은 98 U/ml을 나타내었고, 기존 보고된 Trametes versicolor 유래 laccase의 활성(11.4 U/ml) [26]과 Trametes hirsuta 유래 laccase의 활성(31.7 U/ml) [27]과 비교하여 매우 높은 것으로 확인되어 본 균주는 다른 Trametes 속 균주보다 laccase 생산량이 우수하였다. 구리 이온은 laccase의 보결분 자단(prosthetic group)으로 알려져 있고, laccase 생산에 있어 방향족 화합물은 laccase isozyme의 분비율 향상, laccase 유전자의 전사 유도, 세포 외 단백질 분해활성의 감소에 기 여하는 것으로 보고된 바 있다[25].
- 5 mM CuSO4, 1 mM syringic acid) 를 첨가하고 7일동안 배양한 후, 배양 상등액의 효소를 ammonium sulfate 침전, 음이온 교환수지 및 gel filtration chromatography을 이용하여 정제하였다. 정제된 효소를 SDS-PAGE로 확인한 결과 약 67 kDa 부근에서 밴드가 확 인되었다(Fig. 4). 또한, SuperdexTM 200 column을 이용한 gel filtration 분석 결과 약 69 kDa의 분자량을 나타내어 정 제된 효소는 monomeric enzyme을 형성하는 것으로 확인되 었다(data not shown).
- 4). 또한, SuperdexTM 200 column을 이용한 gel filtration 분석 결과 약 69 kDa의 분자량을 나타내어 정 제된 효소는 monomeric enzyme을 형성하는 것으로 확인되 었다(data not shown). 지금까지 보고된 Trametes 속 유래 의 laccase는 60−70 kDa 사이의 분자량을 나타냈고[22], T.
- velutina JS18로부터 정제한 효소에 대하여 멜라닌 탈색 활성을 조사하기 위해 정제된 효소와 합성 멜라닌을 37℃에서 24시간 반응하였고, 여기에 다양한 redox mediator를 첨가하여 멜라닌 탈색율을 조사하였다. 그 결과 효소 단독으로 합성 멜라닌과 반응한 경우에는 단지 4%만 이 탈색되는 반면, 1 mM HBT를 mediator로 첨가한 경우에는 탈색율이 80%로 향상되었다(Fig. 5A). 그 외에 ABTS와 syringaldehyde를 첨가한 경우에는 멜라닌 탈색율이 8%로 소량 상승하였고, 다른 mediator에 대해서는 탈색율에 거의 변화가 없었다(Fig.
- Xu 등은 Laccase가 촉매하는 paper pulp 탈색반응과 polycyclic hydrocarbon의 분해반응에서 NOH기를 가진 HBT 화합물은 laccase와의 산화환원전위 (redox potential) 차이가 크면 클수록 기질에 대한 산화율이 높기 때문에 촉매 활성이 향상된다고 보고하였다[28]. 따라서, T. velutina JS18 유래 laccase도 다른 redox mediator 보다 N-OH기를 가진 HBT와의 산화환원전위 차이가 커서 멜라닌 탈색율이 향상된 것으로 추측되었다.
- 본 효소의 HBT 농도에 따른 멜라닌 탈색율의 변화를 알아보기 위하여 다양한 농도의 HBT를 첨가하고 탈색율을 조 사한 결과, 1.5 mM HBT 농도에서 24시간 만에 81%의 탈색 율을 나타냈고, 2 mM HBT의 농도에서는 조금 더 낮은 73% 탈색율을 보여 본 효소의 멜라닌 탈색을 위한 HBT의 최적 농도는 1.5 mM로 확인되었다(Fig. 5B). 이와 같이 멜라닌 탈 색은 효소 단독으로는 효율이 낮기 때문에 mediator의 종류 및 농도에 따라 멜라닌 탈색율이 크게 달라질 수 있음을 확 인하였다.
- 5 mM HBT 및 합성 멜라닌과 함께 24시간 반응하고 멜라닌 탈색 활성을 조사하였다. 본 효소의 멜라닌 탈색에 대한 최적 pH는 5.0 으로 80%의 탈색율을 보였고, pH 4.0−6.0의 범위에서 70% 이상의 탈색율을 나타냈다(Fig. 6A). 그러나 pH 3.
- 본 연구 결과에서 T. velutina JS18의 배양액으로부터 정 제한 효소는 HBT와 함께 멜라닌을 효율적으로 탈색하는 것으로 확인되었고, 미백 화장품 원료로써의 적용 가능성을 시 사하였다. 그러나 HBT는 폭발 위험 물질로 분류되어 있어 화장품 원료로 적합하지 않기 때문에 현재, 인체에 적합한 mediator의 탐색 및 개발을 추가로 진행 중에 있다.
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