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문제 정의
- 또한 모발의 melanin 합성 감소는 melanin생성과정의 중요한 효소인 tyrosinase의 활성 감소로 인해 발생한다[16]. 따라서 본 연구에서는 백모를 흑모로 변화시키기 위해 체내 발생되는 활성산소를 억제시키고 tyrosinase 관련 효소의 활성화를 촉진시켜야 한다고 판단하였다.
- 따라서 본 연구에서는 흑임자 주정 추출물(SBEE)의 melanin 생성 촉진에 대한 효과를 조사하기 위하여 흑임자 주정 추출물의 기름층(SBEEO)과 침전층(SBEEP)을 분리시켜 항산화 연구뿐만 아니라 melanin 합성에 대한 연구를 진행하였다.
- 본 연구는 모낭에서 melanin을 합성하는 melanocyte인 B16F1 세포를 사용하여 melanocyte의 melanin 생성을 저해시키는 활성산소의 억제와 melanin 합성 촉진 효과를 흑임자를 이용하여 조사하였다. 흑임자를 주정 추출하여 두 가지 분획물인 흑임자 주정 침전분획(SBEEP) 및 흑임자 기름 상등분획(SBEEO)을 획득하였다.
- Tyrosinase는 모발의 melanocyte의 melanin합성에 중요한 효소로서 melanin합성의 촉진을 나타내는 작용 기전을 가지고 있다. 이 실험은 in vitro에서 tyrosinase의 활성에 대한 SBEEP 와 SBEEO의 촉진 효과를 조사하였다. Tyrosinase 활성 실험의 정확성을 평가하기 위하여 음성 대조군으로 100 μg/ml의 vitamin C와 2,000 μg/ml의 arbutin이 사용되었다.
제안 방법
- B16F1 세포에 용출 완충용액(50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.4% Nonidet P-40, 120 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2 , 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 80 μg/ ml leupeptin, 3 mM NaF and 1 mM DTT)을 첨가하여 4℃에서 30분 동안 처리하였다.
- B16F1 세포에서 DOPA로 melanin 생성을 자극시켜 생성된 melanin 함량을 측정하였다. Fig.
- Brand-Williams [13] 실험방법을 변형하여 SBEEO와 SBEEP의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical 소거능력을 측정하였다. 각 시료를 시험농도로 처리하고 10초 동안 잘 혼합한 다음, 실온에서 20분 동안 반응시킨 후 525 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- Cristofalo 실험방법[8]을 변형하여 24well에 B16F1 세포를 배양하여 H2O2를 10, 50, 100, 250, 500, 800 μM의 농도로 처리하여 24시간 방치하였다.
- H2O2를 24 hr 동안 처리해 melanin 생성능력을 억제시킨 B16F1 cell에서 melanin 생성기전의 tyrosin hydroxylase인 tyrosinase와 DOPA 산화 후 생성되는 최종 melanin을 만드는 효소인 tyrosinase rerated protein (TRP-1), tyrosinae rerated protein 2 (TRP-2), MITF와 항산화 효소인 SOD-3의 단백질 발현을 조사하였다. Fig 10에서 보는 바와 같이 SBEEP 는 tyrosinase, SOD-3의 단백질 발현은 아무런 효과를 보이지 않았고 TRP-1, MITF의 단백질 발현을 감소시켰다.
- SBEEP와 SBEEO가 생체 내 생성되는 과산화수소의 억제 효과를 조사하기 위하여 세포 내로 침투 후 세포 내에서 생성되는 H2O2 와 반응하여 녹색 형광을 띠는 DCFH-DA를 사용하였다. 이 형광의 세기를 측정하여 시료의 H2O 소거 능력을 알아보았다.
- SBEEP와 SBEEO이 melanocyte의 세포 손상과 단백질, DNA 및 지질 산화와 관련 있는 체내에서 발생하는 활성산소종의 억제에 대한 효과를 조사하기 위하여 DPPH radical 소거 활성을 측정하는 실험을 수행하였다. DPPH radical 소거 활성은 항산화 물질로 의해 DPPH radical의 색 변화를 지표로 하여 항산화 효과를 예측할 수 있다.
- Tyrosinase 활성 실험의 정확성을 평가하기 위하여 음성 대조군으로 100 μg/ml의 vitamin C와 2,000 μg/ml의 arbutin이 사용되었다.
- Western blot의 band는 LAS3000 ®image analyzer (Fuji film Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.
- 여기서 얻은 pellet에 1N NaOH (10% DMSO) 200 μl를 첨가하고 vortex 후 405 nm에서 흡광도를 측정 하였다. melanin 표준품 (Sigma, USA)으로 얻은 표준 검량선을 이용하여 각 well에서 생성된 melanin 양을 산출하였다. melanin은 단위세포(104 cells)에서의 melanin 생성량을 비교하였다.
- 여기서 얻은 pellet에 1N NaOH (10% DMSO) 200 μl를 첨가하고 vortex 후 405 nm에서 흡광도를 측정 하였다. melanin 표준품 (Sigma, USA)으로 얻은 표준 검량선을 이용하여 각 well에서 생성된 melanin 양을 산출하였다. melanin은 단위세포(104 cells)에서의 melanin 생성량을 비교하였다.
- melanin 표준품 (Sigma, USA)으로 얻은 표준 검량선을 이용하여 각 well에서 생성된 melanin 양을 산출하였다. melanin은 단위세포(104 cells)에서의 melanin 생성량을 비교하였다.
- melanin 표준품(Sigma, USA)으로 얻은 표준 검량선을 이용하여 각 well에서 생성된 melanin 양을 산출하였다. melanin은 단위세포에서의 melanin 생성량을 비교하였다.
- 세척·건조된 흑임자를 믹서기로 분쇄하여 분말로 제조 후 주정에 3일간 추출하고 여과하였다. 각 여과된 여액을 감압 농축하고 동결 건조를 통해 시료 내 잔여 용매를 완전 휘발 시킨 후 4,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 침전물에서 극성의 흑임자추출물을 획득하고 상등액에서 비극성의 흑임자추출물을 획득하였다. 이러한 방법으로 분리된 기름층(SBEEO)과 침전층(SBEEP) 시료를 dimethyl sulfoxide (DMSO) 로 용해시킨 후 시험 농도로 희석하여 본 연구에 사용하였다.
- Oyaizu [15]의 방법에 따라 측정하였다. 각각의 SBEEO와 SBEEP 1 ml에 pH 6.6의 200 mM 인산 완충용액 및 1%의 potassium ferricyanide를 각 1 ml씩 차례로 가하여 교반 한 후 50℃의 수욕상에서 20분 동안 반응시켰다. 여기에 10% TCA 용액 1 ml를 가하여 13,500× g에서 15분 동안 원심분리하여 얻은 상등액 1 ml에 증류수 및 ferric chloride 각 1 ml를 가하여 혼합한 후 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 10 μg의 세포용출액을 10% Tris-HCl gel에서 전기영동후 단백질을 전기적으로 nitrocellulose membrane으로 전이 시켰다. 그 다음 10% skim milk를 nitrocellulose membrane에 전처리하고 목적 단백질에 대한 1차 항체(anti-tyrosinase, anti-TRP -1, anti-TRP -2, anti-SOD -2, anti-SOD -3, anti-catalase, anti-beta-actin (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, USA))를 처리한 다음 2차 항체를 처리 후, chemiluminescent ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, USA)를 사용하여 목적단백질을 검출하였다. Western blot의 band는 LAS3000 ®image analyzer (Fuji film Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.
- 그 다음에 세포 내의 DOPA산화로 melanin생성을 촉진 시키는 SBEEP로 melanocyte의 melanin 합성 기전을 단백질 수준에서 보다 자세히 조사해보았다. 실험에 사용된 양성 대조군인 α-melanocyte stimulating hormone(α-MSH)은 melanin 생성기전에서 melanocortein 1 receptor (MC1R)과 결합하여 cyclic adenosine monophosphate (cAMP)가 cAMP-responsive element binding protein (CREB)을 인산화 시켜 최종적으로 melanocyte내의 tyrosine, TRP-1, TRP-2과 MITF의 발현을 촉진 시킨다고 알려져 있다[17].
- 따라서 250μM의 H2O2를 처리하여 melanin 형성 능력을 저하시킨 B16F1 세포에 DOPA로 melanin 생성을 자극하여 melanin 함량을 측정하였다.
- 백발을 유발시키는 조건으로 H2O2를 이용했는데, 그 시험 농도는 B16F1 세포에서 SA-β-Gal staining실험을 통하여 노화가 가장 효과적으로 나타난 결과를 참고하여 결정하였다.
- 세척·건조된 흑임자를 믹서기로 분쇄하여 분말로 제조 후 주정에 3일간 추출하고 여과하였다.
- 시료 내 폴리페놀 함량 측정은 Folin-Ciocalteu 방법[29]을 변형하여 Gallic acid를 이용해 표준 물질로 사용하였다. 분광광도계의 측정 가능한 범위 안에서 시료를 희석하여 사용하였다.
- Behring,Germany)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료 색소의 영향을 보정하기 위하여 효소와 기질을 첨가한 군의 흡광도 값에서 tyrosinase 효소를 첨가하지 않고 시료만 첨가한 흡광도 값을 뺀 값을 공시험군으로 설정하여 상대적인 시료 처리군의 흡광도 비를 % 값으로 환산하여 나타내었다.
- 1A는 gallic acid를 이용한 표준 곡선을 보여주었다. 시료의 시험농도에서는 흡광도가 검출되지 않아 시험농도보다 1,000배 농축된 시료를 사용하여 흡광도를 측정하였다. Fig.
- 세포를 DMEM 배지에 DCFH-DA를 20 μM 농도로 제조하여 37℃에서 20분 방치하여 DCFH-DA가 세포 내로 침투시킨다. 여기에 각각 SBEEO와 SBEEP를 시험 농도로 1시간 동안 처리하였다. 세척 후 H2O2를 500 μM 농도를 함유한 HBSS 완충 용액 100 μl를 세포에 처리하였다.
- 와 반응하여 녹색 형광을 띠는 DCFH-DA를 사용하였다. 이 형광의 세기를 측정하여 시료의 H2O 소거 능력을 알아보았다. Fig.
- 세포 내에서 H2O2는 DCFH-DA와 반응하여 형광을 띄는 DCF를 생성한다. 이를 multi-detection microplate reader (SynergyHtx)를 이용하여 excitation: 488 nm, emission: 530 nm 조건에서 형광 정도를 측정하였다.
- 흑임자 주정 추출물로 부터 항산화 효능을 나타내는 SBEEP 와 SBEEO의 총 폴리페놀함량을 측정하였다. Fig.
- 본 연구는 모낭에서 melanin을 합성하는 melanocyte인 B16F1 세포를 사용하여 melanocyte의 melanin 생성을 저해시키는 활성산소의 억제와 melanin 합성 촉진 효과를 흑임자를 이용하여 조사하였다. 흑임자를 주정 추출하여 두 가지 분획물인 흑임자 주정 침전분획(SBEEP) 및 흑임자 기름 상등분획(SBEEO)을 획득하였다. SBEEP 및 SBEEO의 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과 SBEEP가 SBEEO보다 월등히 폴리페놀함량이 높은 것으로 나타났다.
대상 데이터
- α-melanocyte-stimulating hormone (α-MSH), imatinib mesylate, 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) reagent와 기타시약은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)로 부터 구입하였다.
- 세포 배양을 위한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Trypsin-EDTA, penicillin (10,000 U/ml) / streptomycin (10,000 μg/ml) / amphotericin (2,500 μg/ml), fetal bovine serum (FBS) 시약은 Gibco BRL, Life Technologies (Paisley, Scotland)로 부터 구입하였다. B16F1 cell line은 ATCC (American Type Culture Collection, USA)로부터 구입하였다. α-melanocyte-stimulating hormone (α-MSH), imatinib mesylate, 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) reagent와 기타시약은 Sigma Chemical Co.
- 세포 배양을 위한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Trypsin-EDTA, penicillin (10,000 U/ml) / streptomycin (10,000 μg/ml) / amphotericin (2,500 μg/ml), fetal bovine serum (FBS) 시약은 Gibco BRL, Life Technologies (Paisley, Scotland)로 부터 구입하였다.
- 여기에 10% TCA 용액 1 ml를 가하여 13,500× g에서 15분 동안 원심분리하여 얻은 상등액 1 ml에 증류수 및 ferric chloride 각 1 ml를 가하여 혼합한 후 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로 0.01% vitamin C를 사용하였다. 시료의 환원력은 시료 처리군와 대조군의 흡광도 비를 % 값으로 환산하여 나타내었다.
- 각 여과된 여액을 감압 농축하고 동결 건조를 통해 시료 내 잔여 용매를 완전 휘발 시킨 후 4,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 침전물에서 극성의 흑임자추출물을 획득하고 상등액에서 비극성의 흑임자추출물을 획득하였다. 이러한 방법으로 분리된 기름층(SBEEO)과 침전층(SBEEP) 시료를 dimethyl sulfoxide (DMSO) 로 용해시킨 후 시험 농도로 희석하여 본 연구에 사용하였다.
데이터처리
- Level of significance was identified (*, p<0.05; **, p<0.01) using Student’s t test.
- Level of significance was identified using Student’s t test.
- 각 시료농도군에 대한 유의차 검정은 대조군과 비교하여 Student’s test한 후 p<0.05 값을 통계적으로 유의성 있는 결과로 간주하였다.
- 각 실험은 3회 이상 반복실험을 통하여 그 결과를 얻어 각각의 시료농도에 대해 평균±표준편차로 나타내었다.
이론/모형
- Hansen [11]의 방법에 따라 B16F1 세포에 대한 SBEEO와 SBEEP의 세포독성을 MTT (3-(4,5-dimethyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 이용하여 측정하였다.
- Oyaizu [15]의 방법에 따라 측정하였다. 각각의 SBEEO와 SBEEP 1 ml에 pH 6.
- SBEEP와 SBEEO가 B16F1의 세포 독성을 조사하기 위해 MTT assay를 수행하였다. Fig.
- SBEEP와 SBEEO의 환원력의 정도를 알아 보기 위해 potassium ferricyanide와 ferric chloride의 산화환원 원리를 이용 하였다. Fig.
성능/효과
- Fig. 3에서 보는 바와 같이 양성 대조군으로 사용된 0.001% 농도의 viramin C에서 공시험군과 비교하여 198%의 환원력을 보여준 반면, SBEEP은 공시험군과 비교했을 때 최고 농도인 64 μg/ml 이하의 농도에서 환원력에 대한 효과가 나타나지 않았으나 SBEEO는 64 μg/ml 농도에서 공시험군에 비해 12%의 환원력을 보여주었다.
- Fig. 5에서 보는 바와 같이 SBEEP은 64 μg/ml 농도에서 공시험군과 비해 7% L-DOPA 산화에 의하여 melanin합성 촉진 효과를 보여주었고 SBEEO은 4 μg/ml 이상의 농도에서 24% 이상 L-DOPA 산화에 의하여 melanin합성을 촉진시켰다.
- Fig. 9C에서 보는 바와 같이 SBEEO은 32 μg/ml 에서 대조군에 비해 melanin 생성 효과가 19% 증가되었다.
- H2O2로 처리된 B16F1 세포에서 SA-β-Gal staining을 수행한 결과 Fig. 9A에서 보는 바와 같이 B16F1 세포에 H2O2를 농도별로 처리하였을 때 공시험군과 비교하여 250 μM 농도에서 SA-β-Gal staining이 다른 농도에 비해 증가함을 확인하였다.
- 백혈병 치료제로 알려져 있는 imatinib mesylate는 약의 부작용으로 백발을 흑발로 melanin을 재합성 시키는 것으로 알려져 있다[10]. H2O2를 처리해 melanin 생성능력을 억제시킨 후 SBEEP를 처리한 결과 tyrosinase와, SOD-3의 단백질 발현은 아무런 효과를 보이지 않았고 TRP-1, MITF의 단백질 발현을 감소시켰다. 반면에 TRP-2의 단백질 발현이 증가하는 것으로 나타내었다.
- 흑임자를 주정 추출하여 두 가지 분획물인 흑임자 주정 침전분획(SBEEP) 및 흑임자 기름 상등분획(SBEEO)을 획득하였다. SBEEP 및 SBEEO의 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과 SBEEP가 SBEEO보다 월등히 폴리페놀함량이 높은 것으로 나타났다. 항산화연구에서 SBEEP 및 SBEEO의 DPPH radical 소거 활성이 나타나지 않았고 SBEEP은 환원력에 대한 효과가 나타나지 않았으나 SBEEO는 고농도에서 환원력을 보여주었다.
- SBEEP은 64 μg/ml 농도에서 공시험군에 비해 10%의 tyrosinase 활성 촉진효과가 나타났다.
- 0005 μg/ml 함유되어 있다는 것을 알 수 있었다. 결론적으로 SBEEP의 총 폴리 페놀함량이 SBEEO보다 높았다.
- 뿐만 아니라 SBEEO는 농도의존적으로 melanin 생성 촉진 효과를 보여주었다. 그러므로 SBEEP가 SBEEO보다 세포내 melanin 생성 촉진 효과가 우수하다는 것을 나타내었다.
- 9C에서 보는 바와 같이 SBEEO은 32 μg/ml 에서 대조군에 비해 melanin 생성 효과가 19% 증가되었다. 그러므로 SBEEP가 SBEEO에 비해 H2O2를 처리하여 melanin 형성 능력을 저하시킨 세포에서 melanin 생성을 촉진하는 효과가 우수하였다.
- 그러므로, SBEEP의 시험 최고 농도인 64 μg/ml에서 총 폴리페놀함량은 0.51875±0.0018 μg/ ml 함유되어 있고, SBEEO에서는 0.09562±0.0005 μg/ml 함유되어 있다는 것을 알 수 있었다.
- 이전 보고에서도 참깨는 세포에서 과산화수소에 의해 발생되는 손상을 보호한다는 보고가 있었다[4]. 그리고 melanin 생성과 관련 있는 tyrosinase 활성 측정과 DOPA assay를 수행한 결과 SBEEP와 SBEEO는 tyrosinase 활성촉진효과를 나타내었고 DOPA의 산화를 촉진시켰다. 특히 SBEEO가 SBEEP에 비해 tyrosinase와 DOPA 산화능력이 높아 흑임자 주정추출물이 체내 모낭의 melanin 합성 기전 중 하나인 tyrosine과 tyrosinase 반응으로 3,4-dihydroxy phenylalanine (DOPA)합성이 촉진될 것으로 기대된다.
- 를 이용했는데, 그 시험 농도는 B16F1 세포에서 SA-β-Gal staining실험을 통하여 노화가 가장 효과적으로 나타난 결과를 참고하여 결정하였다. 다음 실험에서는 DCFH-DA를 이용한 실험에서 SBEEP와 SBEEO 가 생체 내 생성되는 과산화수소의 억제 한 것이 세포사멸에 의한 효과인지 아니면 과산화수소를 소거한 효과인지를 조사하기 위하여 H2O2를 처리한 후 SBEEP와 SBEEO를 세포에 후 처리하여 melanin 생성을 조사한 결과 SBEEP가 앞의 세포내 melanin생성 실험결과와 유사하게 SBEEO보다 melanin 생성을 촉진하는 효과가 우수하였다. 이러한 결과는 SBEEP가 SBEEO보다 흑모와 관련된 melanin 생성을 촉진 시키는데 더 큰 역할을 할 수 있다는 것을 나타낸다.
- SBEEO은 32 μg/ml 농도에서 39%의 tyrosinase의 활성을 촉진 시켰다. 본 실험결과 SBEEO가 SBEEP보다 tyrosinase 활성 촉진의 효과가 우수하였다.
- 본 연구에서 살아있는 세포에서 SBEEP 및 SBEEO의 세포 내의 활성산소 소거능력을 조사한 결과 세포내 과산화수소의 소거능력을 보여주었다. 이러한 결과는 흑임자 주정추출물이 백발의 원인으로 알려진 과산화수소를 모낭에서 감소시킬 가능성이 있다는 것을 시사하고 있다.
- 다음 실험에서는 DCFH-DA를 이용한 실험에서 SBEEP와 SBEEO 가 생체 내 생성되는 과산화수소의 억제 한 것이 세포사멸에 의한 효과인지 아니면 과산화수소를 소거한 효과인지를 조사하기 위하여 H2O2를 처리한 후 SBEEP와 SBEEO를 세포에 후 처리하여 melanin 생성을 조사한 결과 SBEEP가 앞의 세포내 melanin생성 실험결과와 유사하게 SBEEO보다 melanin 생성을 촉진하는 효과가 우수하였다. 이러한 결과는 SBEEP가 SBEEO보다 흑모와 관련된 melanin 생성을 촉진 시키는데 더 큰 역할을 할 수 있다는 것을 나타낸다.
- 그리고 SBEEO은 32 μg/ml의 농도에서 46%의 세포독성 효과를 나타내었다. 이상의 결과에서 SBEEO는 SBEEP보다 세포독성이 더 높은 것으로 나타났다.
후속연구
- 세포독성이 있는 시료의 농도에서 melanin 합성이 증가되는 이유는 정확하게 설명하기 어려우나, 시료의 함량이 증가함에 따라 melanin 생성을 증가시키는 유효성분의 증가와 함께 새포독성을 유발하는 성분의 함량도 동시에 증가하는 것으로 판단된다. 따라서, 향후에 melanin 생성을 촉진시키는 유효 성분을 분리정제하여 melanin 생성효능을 실험하는 것이 요구된다.
- 그리고 melanin 생성과 관련 있는 tyrosinase 활성 측정과 DOPA assay를 수행한 결과 SBEEP와 SBEEO는 tyrosinase 활성촉진효과를 나타내었고 DOPA의 산화를 촉진시켰다. 특히 SBEEO가 SBEEP에 비해 tyrosinase와 DOPA 산화능력이 높아 흑임자 주정추출물이 체내 모낭의 melanin 합성 기전 중 하나인 tyrosine과 tyrosinase 반응으로 3,4-dihydroxy phenylalanine (DOPA)합성이 촉진될 것으로 기대된다. 뿐만 아니라 SBEEP는 세포 내에서는 SBEEO보다 melanin 촉진 효과가 있는 것으로 나타났다.
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