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문제 정의
- 멜라닌 탈색을 촉매하는 laccase의 최적 생산을 위하여 MNM 배지 속에서 다양한 질소원의 효과를 조사하였다. MNM 배지에는 따로 질소원 성분이 없기 때문에 각 종류별 질소원을 각각 0.
- 멜라닌 탈색을 촉매하는 laccase의 최적 생산을 위하여 MNM 배지 속에서 다양한 탄소원의 효과를 조사하였다. MNM 배지의 조성으로부터 glucose를 제거하고 각 종류별 탄소원을 각각 2%씩 첨가하여 균사체를 배양한 후 효소활성을 측정하였다.
- 본 연구에서는 사람 머리카락 유래의 천연 멜라닌 및 합성 멜라닌에 대하여 탈색 효능을 나타내는 새로운 진균류를 선별하고, 진균류가 생산하는 멜라닌 탈색효소의 최적생산 조건을 검토하였다.
제안 방법
- Peniophora sp. JS17 균사체로부터 멜라닌 탈색 효소를 생산하기 위한 배지 조건을 조사하였다. 다양한 합성 배지 중에서 minimal medium (2% glucose, 0.
- Peniophora sp. JS17 균사체로부터 멜라닌 탈색 효소의 최적 생산을 위한 배지조성을 조사하기 위해 Coriolus versicolor medium (CVM), Czapex dox medium (CDM), Lentinus edodes medium (LEM), mushroom complete medium (MCM), malt yeast glucose medium (MYGM), yeast malt extract medium (YM), laccase production medium (LPM), YpSs medium (YSM), Minimal medium (MNM)을 사용하였으며, 각 배지의 조성은 Table 1에 나타내었다. Peniophora sp.
- Peniophora sp. JS17 균사체로부터 멜라닌 탈색에 관여하는 효소를 동정하기 위하여 Table 1에 제시한 여러 종류의 복합배지를 사용하여 25℃로 12일간 균사체를 배양한 후 배양 상등액을 대상으로 laccase, manganese peroxidase, lignin peroxidase 활성을 조사하였다. 그 결과 Peniophora sp.
- JS17 균주를 앞의 실험에서 밝혀낸 laccase 최적 생산 배지(2% xylose, 0.2% malt extract, 0.4% tryptone, 0.1% KH2PO4 , 0.4% MgSO4·7H2O)에서 7일동안 배양한 후, 배양 상등액의 효소를 ammonium sulfate 침전 및 Hitrap Q sepharose column을 이용하여 정제하였다.
- Peniophora sp. JS17 균주의 배양상등액으로 부터 정제된 laccase에 대하여 멜라닌 탈색 활성을 조사하기 위해 정제된 효소와 합성 멜라닌을 함께 반응하고, 여기에 mediator 로서 HBT 또는 syringaldehyde를 첨가하여 멜라닌 탈색율을 조사하였다. 그 결과 효소 단독으로 멜라닌과 반응한 경우에는 반응시간이 경과함에 따라 멜라닌 탈색율이 아주 조금씩 증가하여 48시간 만에 약 9%의 탈색율을 나타내었다 (Fig.
- 4% MgSO4·7H2O)이 가장 높은 laccase 활성을 나타내었다. Laccase 생산에 대한 배양 조건을 최적화하기 위하여 minimal medium의 조성 중에서 탄소원 및 질소원에 대한 영향을 조사하였다. 다양한 탄소원 및 질소원 중에서 각각 2% xylose 및 0.
- Laccase 최적 생산 배지(2% xylose, 0.2% malt extract, 0.4% tryptone, 0.1% KH2PO4 , 0.4% MgSO4 ·7H2O)에서 7일간 배양한 배양액을 membrane filter (pore size, 7 μm) 을 통과시켜 균사체를 제거하고 원심분리(10,000 ×g, 10 min) 한 후 상등액을 회수하였다.
- 멜라닌 탈색을 촉매하는 laccase의 최적 생산을 위하여 MNM 배지 속에서 다양한 질소원의 효과를 조사하였다. MNM 배지에는 따로 질소원 성분이 없기 때문에 각 종류별 질소원을 각각 0.4%씩 첨가하여 균사체를 배양한 후 효소활성을 측정하였다. 그 결과 tryptone을 첨가하였을 때 원래의 MNM 배지보다 효소활성이 1.
- 멜라닌 탈색을 촉매하는 laccase의 최적 생산을 위하여 MNM 배지 속에서 다양한 탄소원의 효과를 조사하였다. MNM 배지의 조성으로부터 glucose를 제거하고 각 종류별 탄소원을 각각 2%씩 첨가하여 균사체를 배양한 후 효소활성을 측정하였다. 그 결과 xylose를 탄소원으로 첨가 하였을 때 laccase 활성이 가장 우수하였고, 원래 성분인 glucose와 비교하여 약 2.
- 0)로 투석하였다. 단백질의 정제도는 SDS-PAGE (10% acrylamide gel)을 통하여 확인하였고, 전기영동 밴드는 coomassie를 사용하여 염색하였다.
- 경상남도 삼림 지역의 토양, 썩은 나무 등에서 채취한 100 여개의 샘플을 phosphate buffered saline (PBS)와 혼합한 후 potato dextrose agar (PDA) 평판배지 상에 접종하여 25℃에서 5일 동안 배양하였다. 멜라닌 탈색능을 가진 균주를 선별하기 위하여 배양된 PDA 평판배지 상의 균사를 직경 5 mm의 cork borer로 agar plug를 만들어 human hair melanin (0.6 g/l)을 첨가한 malt extract dextrose (MDB) 배지(glucose 4 g/l, malt extract 10 g/l, peptone 4 g/l, agar 15 g/l)에 접종하고 25℃에서 30일 동안 배양하였다. 투명환을 형성하는 균주는 동일한 배지에 계대 배양하여 4℃에 보관하였고, 18s rRNA 서열 분석을 통하여 계통학적으로 동정하였다.
- 배양액 중에 생산된 laccase의 존재유무를 알아보기 위하여 조효소액을 10% Native-PAGE를 사용하여 비변성 조건에서 전기영동한 후 활성염색법을 수행하였다. 전기영동한겔은 0.
- 본 균주를 가장 높은 laccase 활성과 비교적 높은 manganese peroxidase 활성을 나타낸 MNM 배지에서 배양 하면서 배양시간에 따른 건조 균체량, laccase 및 manganese peroxidase 활성, synthetic melanin (sigma)의 탈색율을 검토 하였다. 그 결과, laccase 활성과 멜라닌 탈색율은 대수증 식기(exponential phase)에 동시에 증가하기 시작하여 6−7 일 만에 최대 활성을 나타내었고, 그 이후 거의 일정하게 유지되었다(Fig.
- 0 M의 NaCl로 농도구배를 주어 결합된 단백질을 용출하였다. 용출된 획분은 laccase 활성을 측정하여 활성이 있는 획분을 모아 Amicon filter (Milipore, USA)로 농축한 다음 20 mM sodium acetate (pH 5.0)로 투석하였다. 단백질의 정제도는 SDS-PAGE (10% acrylamide gel)을 통하여 확인하였고, 전기영동 밴드는 coomassie를 사용하여 염색하였다.
- 4A). 이 밴드의 laccase 활성을 확인하기 위하여 정제된 효소를 NativePAGE로 전기영동 한 후 기질인 ABTS를 사용하여 활성염색을 수행하였다. 그 결과 SDS-PAGE의 결과와 비슷한 위치에서 폭넓게 밴드가 확인되었다(Fig.
- 4)에서 30분간 방치한 후새로운 buffer로 교환하는 과정을 3회 반복하였다. 이후에 전기영동 겔은 0.5 M citrate buffer (pH 3.4)에서 조제한 2 mM ABTS 용액과 37℃에서 2분간 반응시켜 생성되는 단백질 band를 확인하였다.
- JS17을 PDA 평판배지 상에 접종하여 25℃에서 5일 동안 배양한 후 한천배지 상의 균사를 직경 5 mm의 cork borer로 agar plug를 만들어 각각의 액체배지 100 ml에 접종하여 25℃에서 100 rpm으로 12일간 진탕 배양 하였다. 탄소원 및 질소원의 영양원에 따른 효소 생산량을 조사하기 위하여 복합배지 중 가장 높은 laccase 활성을 나타내는 MNM 배지의 조성으로부터 해당 영양원을 제거하고 2% 탄소원 및 0.4% 질소원을 각각 첨가하여 실험하였다.
- 6 g/l)을 첨가한 malt extract dextrose (MDB) 배지(glucose 4 g/l, malt extract 10 g/l, peptone 4 g/l, agar 15 g/l)에 접종하고 25℃에서 30일 동안 배양하였다. 투명환을 형성하는 균주는 동일한 배지에 계대 배양하여 4℃에 보관하였고, 18s rRNA 서열 분석을 통하여 계통학적으로 동정하였다.
- 투석된 단백질은 ÄKTAprime (GE Healthcare, USA)을 이용하여 HiTrap Q HP column에 로딩한 후 0−1.0 M의 NaCl로 농도구배를 주어 결합된 단백질을 용출하였다.
대상 데이터
- 경상남도 삼림 지역의 토양, 고목 등에서 채취한 100여개의 샘플에 대하여 사람 머리카락 유래 천연 멜라닌을 첨가한 MDB 고체 배지상에서 균사체를 배양하면서 투명환을 형성하는 균주를 선별하였다. 그 결과 고목에서 분리한 진균류 1종에서 투명환이 확인되었고, 배양을 시작한 후 23일째에 지름 5.
- 경상남도 삼림 지역의 토양, 썩은 나무 등에서 채취한 100 여개의 샘플을 phosphate buffered saline (PBS)와 혼합한 후 potato dextrose agar (PDA) 평판배지 상에 접종하여 25℃에서 5일 동안 배양하였다. 멜라닌 탈색능을 가진 균주를 선별하기 위하여 배양된 PDA 평판배지 상의 균사를 직경 5 mm의 cork borer로 agar plug를 만들어 human hair melanin (0.
이론/모형
- (B) Phylogenetic tree. The tree was constructed using the neighbor joining method. The bar represents 0.
- 천연 melanin은 사람 머리카락으로부터 Krol and Libler [18]의 방법을 사용하여 분리하였다. 머리카락(15 g)을 작은 조각으로 자르고 1 M NaOH 500 ml을 첨가하고 24시간 stirrer로 교반하였다.
성능/효과
- 그 결과 Peniophora sp. JS17의 배양 상등액에서 lignin peroxidase 활성은 보이지 않는 반면, MNM 배지에서는 가장 높은 laccase 활성(19.9 U/ml)을 나타내었고, CVM 배지에서는 가장 높은 manganese peroxidase 활성(74 U/ml)을 보이는 것으로 나타났다(Table 1).
- 이 밴드의 laccase 활성을 확인하기 위하여 정제된 효소를 NativePAGE로 전기영동 한 후 기질인 ABTS를 사용하여 활성염색을 수행하였다. 그 결과 SDS-PAGE의 결과와 비슷한 위치에서 폭넓게 밴드가 확인되었다(Fig. 4B). Peniophora cinerea가 생산하는 laccase의 경우에는 26.
- 4%씩 첨가하여 균사체를 배양한 후 효소활성을 측정하였다. 그 결과 tryptone을 첨가하였을 때 원래의 MNM 배지보다 효소활성이 1.16배 정도 높았고, 다른 질소원을 첨가한 경우에는 오히려 효소 활성이 감소하였다(Table 3). 지금까지 보고된 바에 의하면, Botryosphaeria sp.
- MNM 배지의 조성으로부터 glucose를 제거하고 각 종류별 탄소원을 각각 2%씩 첨가하여 균사체를 배양한 후 효소활성을 측정하였다. 그 결과 xylose를 탄소원으로 첨가 하였을 때 laccase 활성이 가장 우수하였고, 원래 성분인 glucose와 비교하여 약 2.4배 정도 효소 활성이 증가하였다(Table 2). Coriolopsis gallica [22], Hypsizygus ulmarius [23], Ganoderma lucidum [24]의 경우, laccase를 생산하기 위한 탄소원 중에서 xylose가 가장 우수한 효과를 나타낸다고 보고된 바 있어, 본 연구의 결과와 일치하였다.
- 경상남도 삼림 지역의 토양, 고목 등에서 채취한 100여개의 샘플에 대하여 사람 머리카락 유래 천연 멜라닌을 첨가한 MDB 고체 배지상에서 균사체를 배양하면서 투명환을 형성하는 균주를 선별하였다. 그 결과 고목에서 분리한 진균류 1종에서 투명환이 확인되었고, 배양을 시작한 후 23일째에 지름 5.5 cm의 투명환을 형성하여 30일째에는 지름 8.0 cm 의 투명환이 확인되었다(Fig. 1). 투명환을 형성한 균주를 동정하기 위하여 18s rRNA의 염기서열을 분석하고 BLAST program을 이용하여 상동성을 분석한 결과 99%의 신뢰도로 Peniophora sp.
- JS17 균주의 배양상등액으로 부터 정제된 laccase에 대하여 멜라닌 탈색 활성을 조사하기 위해 정제된 효소와 합성 멜라닌을 함께 반응하고, 여기에 mediator 로서 HBT 또는 syringaldehyde를 첨가하여 멜라닌 탈색율을 조사하였다. 그 결과 효소 단독으로 멜라닌과 반응한 경우에는 반응시간이 경과함에 따라 멜라닌 탈색율이 아주 조금씩 증가하여 48시간 만에 약 9%의 탈색율을 나타내었다 (Fig. 5). 반면 mediator로서 HBT를 첨가한 경우의 멜라닌 탈색율은 48시간 만에 77%를 나타내었고, syringaldehyde 를 첨가한 경우에는 55%의 멜라닌 탈색 효능을 보이는 것으로 확인되었다(Fig.
- 그 결과, laccase 활성과 멜라닌 탈색율은 대수증 식기(exponential phase)에 동시에 증가하기 시작하여 6−7 일 만에 최대 활성을 나타내었고, 그 이후 거의 일정하게 유지되었다(Fig. 3).
- Ammonium sulfate 침전 및 Hitrap Q Sepharose column을 이용하여 정제한 효소는 SDS-PAGE에서 약 70 kDa의 분자량 부근에 2종류의 isozyme 형태로 존재 하였다. 멜라닌 탈색율은 HBT 및 syringaldehyde의 존재 하에서 48시간 만에 각각 77% 및 55%를 나타내었고, mediator가 없는 조건에서는 9%의 멜라닌 탈색율을 나타내었다.
- 5). 반면 mediator로서 HBT를 첨가한 경우의 멜라닌 탈색율은 48시간 만에 77%를 나타내었고, syringaldehyde 를 첨가한 경우에는 55%의 멜라닌 탈색 효능을 보이는 것으로 확인되었다(Fig. 5). 이와 같이, melanin 탈색은 효소 단독으로는 효율이 낮기 때문에 mediator의 종류 및 농도에 따라 melanin 탈색 효능이 크게 달라질 수 있다.
- JS17 균주는 laccase 및 manganese peroxidase 활성을 나타냈지만 lignin peroxidase 활성은 나타내지 않았다. 본 균주를 회분배양한 결과 멜라닌 탈색 활성은 laccase 활성으로부터 유래하는 것으로 확인되었다. Peniophora sp.
- 반면, manganese peroxidase 활성은 정지기 이후에 증가하기 시작하여 멜라닌 탈색율이 나타나는 배양시간과 일치하지 않았다. 이와 같이 배양시간에 따른 laccase 생산량과 멜라닌 탈색율은 균체량과 함께 비례하였기 때문에 본 균주의 멜라닌 탈색능은 laccase의 촉매 반응에서 유래하는 것으로 예상되었다. Laccase는 종류별로 다양한 기질 특이성을 가지기 때문에 곰팡이에서만 약 100여종 이상의 종류가 보고되었지만[21], 현재까지 멜라닌을 탈색시키는 laccase는 Phlebia radiata BP-11-2 [10], Lentinus polychrous Lév [12], Trametes versicolor [16]의 단지 3종에서만 확인되었다.
- 4% MgSO4·7H2O)에서 7일동안 배양한 후, 배양 상등액의 효소를 ammonium sulfate 침전 및 Hitrap Q sepharose column을 이용하여 정제하였다. 정제된 효소를 SDS-PAGE로 확인한 결과 약 70 kDa 부근에서 2개의 밴드가 확인되었다(Fig. 4A). 이 밴드의 laccase 활성을 확인하기 위하여 정제된 효소를 NativePAGE로 전기영동 한 후 기질인 ABTS를 사용하여 활성염색을 수행하였다.
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