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문제 정의
- coli 유래의 생산물-저항성(product- resistant) CPL의 도입, shikimate 경로의 유전자 과발현, quinate/shikimate 분해경로의 차단, Methanocaldococcus jannaschii 유래의 shikimate-저항성 AroK 도입을 통해 5-L 발효조에서 19 g/l 4-HBA를 생산하는 APS809를 개발하였다[14]. 본 연구에서는 4-HB alcohol의 전구물질인 4- HBA를 과량 생산하는 APS809에 N. iowensis 유래의 carboxylic acid reductase 유전자 car를 합성하여 발현을 최적화하여, 천마 구근으로부터 매우 소량 얻을 수 있는 기능성 방향족 화합물인 4-HB alcohol을 생산하는 C. glutamicum GAS355를 대사공학 기법으로 개발하여 보고한다(Fig. 1).
제안 방법
- 최근 본 연구진은 C. glutamicum ATCC 13032에 방향족 아미노산 합성경로의 차단, 4-hydroxybenzoate (4-HBA) 분해경로의 차단, E. coli 유래의 생산물-저항성(product- resistant) CPL의 도입, shikimate 경로의 유전자 과발현, quinate/shikimate 분해경로의 차단, Methanocaldococcus jannaschii 유래의 shikimate-저항성 AroK 도입을 통해 5-L 발효조에서 19 g/l 4-HBA를 생산하는 APS809를 개발하였다[14]. 본 연구에서는 4-HB alcohol의 전구물질인 4- HBA를 과량 생산하는 APS809에 N.
- glutamicum APS809를 사용하였다. 유전자 발현을 위한 플라스미드는 pCXM48 유래의 pCX-series 발현벡터들을 사용하였으며, C. glutamicum 염색체 조작은 pK19mobsacB 벡터를 이용하였다[15, 16]. 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 통해 DNA를 증폭하여 EZ-fusion cloning kit (Enzymomics, Korea) 또는 Quick ligation kit (NEB, USA)를 사용하여 플라스미드에 클로닝하였으며, 삽입된 DNA 단편은 염기서열을 분석하여 확인하였다.
- glutamicum 염색체 조작은 pK19mobsacB 벡터를 이용하였다[15, 16]. 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 통해 DNA를 증폭하여 EZ-fusion cloning kit (Enzymomics, Korea) 또는 Quick ligation kit (NEB, USA)를 사용하여 플라스미드에 클로닝하였으며, 삽입된 DNA 단편은 염기서열을 분석하여 확인하였다. C.
- Nocardia iowensis 유래의 car 유전자는 GenScript (USA)에 의뢰하여 C. glutamicum에서 발현에 적합한 최적의 코돈(codon)을 선정하여 유전자를 합성 후 pUC57 벡터에 클로닝된 형태로 입수하였다(Table 1; Table S2). pUC57-CAR을 주형 DNA로 하고 프라이머 P1과 P2를 이용하여 PCR하여 얻은 단편을 정제한 뒤 EcoRI과 HindⅢ 효소로 처리하여 약 3.
- glutamicum에서 발현에 적합한 최적의 코돈(codon)을 선정하여 유전자를 합성 후 pUC57 벡터에 클로닝된 형태로 입수하였다(Table 1; Table S2). pUC57-CAR을 주형 DNA로 하고 프라이머 P1과 P2를 이용하여 PCR하여 얻은 단편을 정제한 뒤 EcoRI과 HindⅢ 효소로 처리하여 약 3.5 kb의 car 단편을 얻었다. 발현 벡터인 pCXS30, pCXS35, pCXI40, pCXI43, pCXI45를 EcoRI/ HindⅢ로 절단한 후 car 단편과 각각 DNA 접합(ligation)하여, 최종적으로 pSCA3035, pSCA3535, pICA4035, pICA4335, pICA4535를 제작하였다(Fig.
- 75 kb의 단편을 얻어 T-blunt 벡터에 도입하였다. 염기서열을 확인 후 EcoRI과 HindⅢ로 처리하고 pCX-series 벡터와 접합하여, 최종적으로 pSCreG35, pICreG43, pECreG50를 제작하였다(Supplementary Fig. S1B).
- M. jannaschii 유래의 aroK 유전자를 C. glutamicum 염색체에 삽입하기 위한 벡터를 제작하기 위해 P23-P24, P25- P26을 이용하여 NCgl2922 유전자의 상류 부위(upstream region)와 하류 부위(downstream region)의 0.6 kb DNA를각각 PCR하여 얻은 단편과, aroK 유전자를 함유한 pMSK16 을 XbaI/KpnI으로 절단하고 정제하여 얻은 1.57 kb 단편과, pK19mobsacB/HindⅢ/EcoRI을 혼합하고 Gibson assembly법으로 클로닝하여, 최종적으로 pK19-ΔNCgl2922::Ptuf-aroK를 제작하였다(Fig. S1C)[18]. 이 벡터를 C.
- S1C)[18]. 이 벡터를 C. glutamicum APS809에 형질전환하여 1단계로 상동성 재조합(homologous recombination)을 통해 염색체에 삽입된 kanamycin (Kn) 내성주를 선별한 후, LB액체배지에 접종하여 밤새 배양한 다음 생리식염수로 10−100배 희석하여 10% sucrose를 함유한 LB한천배지에 도말하여 sucrose 내성균을 얻었다. LB한천배지와 Kn을 함유한 LB한천배지에 이쑤시개로 각각 100 개의 콜로니를 접종하여 Kn 감수성 콜로니를 취하여 프라이머 P28-P29, P27-P29로 PCR하여 NCgl2922가 결손된 부위에 Ptuf-aroK-Trnn이 삽입된 APS963을 최종적으로 선별하였다.
- glutamicum APS809에 형질전환하여 1단계로 상동성 재조합(homologous recombination)을 통해 염색체에 삽입된 kanamycin (Kn) 내성주를 선별한 후, LB액체배지에 접종하여 밤새 배양한 다음 생리식염수로 10−100배 희석하여 10% sucrose를 함유한 LB한천배지에 도말하여 sucrose 내성균을 얻었다. LB한천배지와 Kn을 함유한 LB한천배지에 이쑤시개로 각각 100 개의 콜로니를 접종하여 Kn 감수성 콜로니를 취하여 프라이머 P28-P29, P27-P29로 PCR하여 NCgl2922가 결손된 부위에 Ptuf-aroK-Trnn이 삽입된 APS963을 최종적으로 선별하였다.
- car 유전자를 C. glutamicum 염색체에 삽입하기 위한 벡터를 제작하기 위해 P5-P6, P7-P8을 이용해 NCgl1112 유전자의 291번째 염기의 상류 부위와 772번째 염기의 하류 부위 1 kb DNA를 각각 PCR하여 얻은 단편과 pK19mobsacB/ HindⅢ/EcoRI DNA를 Gibson assembly법으로 클로닝하여 NCgl1112 1, 071 염기 쌍 중에서 480 염기 쌍이 제거된 pK19-ΔNCgl1112를 제작하였다. car를 함유한 pICA4335를 NotI/NheI으로 절단하고 정제하여 얻은 4.
- S1D). 이를 APS963에 형질전환하고 얻어진 colony를 PCR하여 NCgl1112 의 일부가 결손된 부위에 Pilvc-M1-car ORF-TrrnB가 삽입된 GAS177을 최종적으로 선별하였다.
- GAS177균주로부터 creG 유전자를 결손하기 위한 벡터를 제작하기 위해 P11-P12, P13-P14를 이용해 creG (NCgl0527) 유전자의 상류 부위와 하류 부위의 단편 0.4 kb를 각각 PCR 하여 얻은 다음, Gibson assembly법으로 pK19mobsacB/ HindⅢ/EcoRI에 삽입하여 pK19-ΔcreG를 제작하였다(Fig. S1E). 이를 GAS177에 형질전환하고 creG 결손을 P15-P16 로 PCR하여 확인하였으며, 최종적으로 선별된 균은 GAS225 로 명명하였다.
- S1E). 이를 GAS177에 형질전환하고 creG 결손을 P15-P16 로 PCR하여 확인하였으며, 최종적으로 선별된 균은 GAS225 로 명명하였다.
- 변이 CPL을 암호화하는 유전자 ubiCpr을 GAS225 염색체에 도입하기 위한 벡터를 제작하기 위해 P17-P18, P19-P20 을 이용해 pcaH 유전자의 상류 부위 0.4 kb와 pcaG 유전자의 97번째 염기부터 하류 부위 0.4 kb를 각각 PCR하여 얻은 다음, Gibson assembly법으로 pK19mobsacB/HindⅢ/ EcoRI에 삽입하여 pK19-ΔpcaHG를 제작하였다. 변이 ubiC 유전자를 함유한 플라스미드 pUMF29를 XbaI/EcoRV로 절단하고 정제하여 얻은 1 kb단편과 pK19-ΔpcaHG/XbaI/ EcoRV와 접합하여 최종적으로 pK19-ΔpcaHG::Psod-ubiCpr 를 제작하였다(Fig.
- 4 kb를 각각 PCR하여 얻은 다음, Gibson assembly법으로 pK19mobsacB/HindⅢ/ EcoRI에 삽입하여 pK19-ΔpcaHG를 제작하였다. 변이 ubiC 유전자를 함유한 플라스미드 pUMF29를 XbaI/EcoRV로 절단하고 정제하여 얻은 1 kb단편과 pK19-ΔpcaHG/XbaI/ EcoRV와 접합하여 최종적으로 pK19-ΔpcaHG::Psod-ubiCpr 를 제작하였다(Fig. S1F). 이를 사용하여 GAS225에 도입하고 P21-P22를 사용하여 PCR하여 pcaHG 영역에서 0.
- S1F). 이를 사용하여 GAS225에 도입하고 P21-P22를 사용하여 PCR하여 pcaHG 영역에서 0.82 kb 결손된 부위에 1 kb의 Psod-ubiC-TT7이 삽입된 것을 확인하여 GAS355를 선별하였다.
- 2 mM NAD+, 조효소액 100 µl를 사용하였다. 조효소액을 첨가한 후 환원되는 NADH를 UV 분광광도계(Shimadzu UV-1800, Japan)를 사용하여 340 nm에서 30초 간격으로 3분간 측정하였다[19].
- 세포 OD는 분광광도계(UV-2550, Shimadzu)를 사용하여 600 nm에서 측정하였으며, 포도당은 ACCU-CHEK (Korea) 을 사용하여 측정하였다. 발효 배양액에 존재하는 4-HBA, 4-HB aldehyde, 4-HB alcohole HPLC (high performance liquid chromatography)로 분석하였다.
- 사용하여 측정하였다. 발효 배양액에 존재하는 4-HBA, 4-HB aldehyde, 4-HB alcohole HPLC (high performance liquid chromatography)로 분석하였다. 발효 배양액 1 ml을 10분간 원심 분리하여 상등액을 얻은 후, 100 µl 상등액과 900 µl acid-methanol (1 ml methanol, 4 µl 5N HCl)을 섞어 10분간 흔들어준 후 15분 동안 11, 400 ×g에서 원심 분리한 다음 상등액을 0.
- iowensis 유래의 CAR이다 [21, 22]. 4-HBA로부터 4-HB aldehyde를 생산하는 C. glutamicum을 개발하기 위해 N. iowensis 유래의 car 유전자를 Corynebacterium에서 잘 작동하는 pCX-series 발현 벡터에 클로닝 후, ATCC 13032에 형질전환하고 조효소액을 제조하여 SDS-PAGE를 수행하여 단백질 발현을 분석하였다. 그 결과, 분자량이 약 130 kDa 위치에서 PilvC, PilvC-M1, PilvC-M2 promoter에서 CAR 단백질이 상대적으로 잘 생산되었으며, 특히 PilvC-M1을 함유한 pICA4335에서 가장 높은 발현을 확인하였다(Fig.
- 3A). car 유전자를 염색체에 삽입하기 위해 pK19-ΔNCgl1112::PilvC-M1-car를 사용하여 APS963에 도입하여 GAS177을 개발하였다. NCgl1112 유전자 중에서 0.
- 따라서, 4-HB alcohol을 더 많이 생산하는 균을 개발하기 위해 염색체상에서 creG 유전자를 결손하는 것이 바람직하다고 판단된다. 제작된 벡터 pK19-ΔcreG를 GAS177에 도입하여 creG가 결손된 GAS225를 개발하였다. Fig.
- 8 kb 정도 DNA 크기가 감소하는 것을 확인하였다. 한편, 변이 ubiC 유전자 발현을 플라스미드 형태로 하는 것보다는 염색체에 삽입하여 발현하여 세포에 대한 부담을 줄이고 4-HB alcohol 생산을 안정적으로 하기 위한 목적으로, pK19-ΔpcaHG::Psod-ubiCpr를 GAS225 에 형질전환하여 0.82 kb pcaHG의 결손 (pcaH 전체 유전자결손 및 pcaG 96 염기 쌍의 결손) 및 1 kb Psod-ubiCpr-TT7 삽입을 PCR로 확인하여 최종적으로 GAS355를 개발하였다 (Fig. 2D).
- 염색체에 car 유전자가 삽입된 GAS177 균주와 모균주인 APS963에 ubiCpr를 함유한 pUMF29 플라스미드를 각각 도입한 후 삼각 플라스크에서 42−48시간 발효하여 첨가된 포도당을 모두 소비하면서 생산농도를 비교하였다(Table 2) [14, 23]. GAS177/pUMF29의 경우, 0.
대상 데이터
- E. coli와 C. glutamicume Luria Bertani (LB) 배지를 사용하여 37℃, 32℃에서 각각 배양하였다. 항생제를 첨가할 경우, E.
- 5 kb의 car 단편을 얻었다. 발현 벡터인 pCXS30, pCXS35, pCXI40, pCXI43, pCXI45를 EcoRI/ HindⅢ로 절단한 후 car 단편과 각각 DNA 접합(ligation)하여, 최종적으로 pSCA3035, pSCA3535, pICA4035, pICA4335, pICA4535를 제작하였다(Fig. S1A). creG 유전자는 C.
- glutamicum 염색체에 삽입하기 위한 벡터를 제작하기 위해 P5-P6, P7-P8을 이용해 NCgl1112 유전자의 291번째 염기의 상류 부위와 772번째 염기의 하류 부위 1 kb DNA를 각각 PCR하여 얻은 단편과 pK19mobsacB/ HindⅢ/EcoRI DNA를 Gibson assembly법으로 클로닝하여 NCgl1112 1, 071 염기 쌍 중에서 480 염기 쌍이 제거된 pK19-ΔNCgl1112를 제작하였다. car를 함유한 pICA4335를 NotI/NheI으로 절단하고 정제하여 얻은 4.235 kb 단편과 pK19-ΔNCgl1112/NotI/XbaI과 접합하여 최종적으로 pK19- ΔNCgl1112::PilvC-M1-car를 제작하였다(Fig. S1D). 이를 APS963에 형질전환하고 얻어진 colony를 PCR하여 NCgl1112 의 일부가 결손된 부위에 Pilvc-M1-car ORF-TrrnB가 삽입된 GAS177을 최종적으로 선별하였다.
- 45 µm 필터로 여과하여 분석하였다. Columne Eclipse XDB-C18 (4.6 × 250 mm, 5 µm, Agilent) 를 사용하였으며, 이동상은 25 mM potassium phosphate 완충액(pH 2.8)과 acetonitrile을 9:1 [vol:vol] 비율로 혼합하여 사용하였으며, 50℃, 210 nm 파장에서 0.6ml/min 유속으로 분석하였다. 세포의 파쇄 및 단백질 농도분석은 이전 논문에 기술된 방법으로 수행하였다[20].
- glutamicum 개발모균주인 4-HBA 생산 APS809를 이용하여 4-HB alcohol 을 생산하는 균을 개발하기 이전에 플라스미드에 존재하는 aroK 유전자를 염색체에 삽입할 필요가 있다. 벡터 pK19- ΔNCgl2922::Ptuf-aroK를 APS809에 도입하여 APS963을 선별하였다. Fig.
이론/모형
- 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 통해 DNA를 증폭하여 EZ-fusion cloning kit (Enzymomics, Korea) 또는 Quick ligation kit (NEB, USA)를 사용하여 플라스미드에 클로닝하였으며, 삽입된 DNA 단편은 염기서열을 분석하여 확인하였다. C. glutamicum의 컴피턴트 세포(competent cell) 제조와 전기천공법(electroporation)은 논문에 기술된 방법에 준해 수행하였다[17].
- 5 µg/ml chloramphenicol을 첨가하였다. 4-HB alcohol 생산을 위한 플라스크 발효배지는 이전 논문에 기술된 방법에 준하여 제조하였다[11, 14]. 항생제가 첨가된 LB 한천배지에서 밤새 키운 균을 25 ml 발효배지를 함유한 250 ml 삼각플라스크에 백금이로 접종한 다음 진탕 배양기에서 32℃, 240 rpm으로 42−48시간 배양하였으며, 모든 실험은 3회 반복 실시하였다.
성능/효과
- 현재, 시스템 대사공학(systems metabolic engineering)을 기반으로 Corynebacterium을 이용한 다양한 화학물질, 바이오 연료, 식물유래 기능성물질, 단백질 등의 생산연구가 매우 광범위하게 진행되고 있다[13]. 따라서, 기존에는 천마 구근에서 매우 소량 생산되는 이들 방향족 화합물을 GRAS 미생물인 C. glutamicum을 이용하여 생산하는 연구는 매우 가치가 있다고 사료된다.
- 벡터 pK19- ΔNCgl2922::Ptuf-aroK를 APS809에 도입하여 APS963을 선별하였다. Fig. 2A에서 보는 것처럼 P28-P29로 PCR하여 확인한 결과 NCgl2922가 결손 안된 APS809의 경우 약 2.72 kb에 위치하며(A, lane 1), NCgl2922의 결손 및 Ptuf-aroK- Trnn이 삽입된 APS963의 경우 약 2.98 kb에 위치함을 확인하였다(A, 2). 추가적 확인을 위해 aroK 유전자와 연결된 tuf promoter 중간 프라이머 P27과 NCgl2922 하위부위에 위치한 프라이머 P29로 PCR하여 확인한 결과, APS809의 경우 삽입이 안되었기 때문에 DNA band가 보이질 않았으며(A, 3), APS963은 약 2 kb 단편이 확인되어 Ptuf-aroK-Trnn의 삽입을 확인하였다(A, 4).
- 98 kb에 위치함을 확인하였다(A, 2). 추가적 확인을 위해 aroK 유전자와 연결된 tuf promoter 중간 프라이머 P27과 NCgl2922 하위부위에 위치한 프라이머 P29로 PCR하여 확인한 결과, APS809의 경우 삽입이 안되었기 때문에 DNA band가 보이질 않았으며(A, 3), APS963은 약 2 kb 단편이 확인되어 Ptuf-aroK-Trnn의 삽입을 확인하였다(A, 4). 삼각 플라스크에서 배양한 결과 모 균주인 APS809/pUMF29/pSMK16은 4.
- 추가적 확인을 위해 aroK 유전자와 연결된 tuf promoter 중간 프라이머 P27과 NCgl2922 하위부위에 위치한 프라이머 P29로 PCR하여 확인한 결과, APS809의 경우 삽입이 안되었기 때문에 DNA band가 보이질 않았으며(A, 3), APS963은 약 2 kb 단편이 확인되어 Ptuf-aroK-Trnn의 삽입을 확인하였다(A, 4). 삼각 플라스크에서 배양한 결과 모 균주인 APS809/pUMF29/pSMK16은 4.66 g/l 4-HBA,0.22g/l shikimate, 0.11 g/l dehydroskimiate를 생산하였으며, 개발된 균주인 APS963/pUMF29는 4.02 g/l 4-HBA, 0.23 g/l shikimate, 0.2 g/l dehydroshikimate를 생산하였다(Table 2). 비록 4-HBA는 약 13% 감소하였지만, shikimate 에 대한 효소의 활성 저해가 해제된 M.
- iowensis 유래의 car 유전자를 Corynebacterium에서 잘 작동하는 pCX-series 발현 벡터에 클로닝 후, ATCC 13032에 형질전환하고 조효소액을 제조하여 SDS-PAGE를 수행하여 단백질 발현을 분석하였다. 그 결과, 분자량이 약 130 kDa 위치에서 PilvC, PilvC-M1, PilvC-M2 promoter에서 CAR 단백질이 상대적으로 잘 생산되었으며, 특히 PilvC-M1을 함유한 pICA4335에서 가장 높은 발현을 확인하였다(Fig. 3A). car 유전자를 염색체에 삽입하기 위해 pK19-ΔNCgl1112::PilvC-M1-car를 사용하여 APS963에 도입하여 GAS177을 개발하였다.
- car 유전자를 염색체에 삽입하기 위해 pK19-ΔNCgl1112::PilvC-M1-car를 사용하여 APS963에 도입하여 GAS177을 개발하였다. NCgl1112 유전자 중에서 0.48 kb 단편의 결손과 4.24 kb 단편의 PilvC-M1-car-Trrn의 삽입에 의해 GAS177 균주는 대조균주 대비 DNA 단편이 약 3.76 kb 증가한 것을 PCR을 통해 확인하였다(Fig. 2B).
- glutamicum에는 4-HB alcohol을 4-HB aldehyde로 산화를 촉매하는 효소인 CreG (NAD+-dependent dehydrogenase,NCgl0527)가 알려져 있다[19]. 효소 활성을 확인하기 위해 creG 유전자를 pCX-series 발현 벡터에 각각 클로닝하고 C. glutamicum에서 단백질의 발현 정도를 분석한 결과, 예측된 분자량인 25.7 kDa 보다 약간 낮은 위치에서 단백질 band 를 확인하였다(Fig. 3B). 대조군과 비교하였을 때, tuf 프로모터에 연결된 pECreG50에서 CreG 단백질의 생산이 가장 우수하였다.
- 3B). 대조군과 비교하였을 때, tuf 프로모터에 연결된 pECreG50에서 CreG 단백질의 생산이 가장 우수하였다. 기질로 4-HB alcohol과 vanillyl alcohol을 사용하여 효소활성을 측정한 결과, 4-HB alcohol과 vanillyl alcohol을 모두 산화하는 활성을 가지며, 4-HB alcohol을 더잘 산화하는 것을 확인하였다(Table 3).
- 대조군과 비교하였을 때, tuf 프로모터에 연결된 pECreG50에서 CreG 단백질의 생산이 가장 우수하였다. 기질로 4-HB alcohol과 vanillyl alcohol을 사용하여 효소활성을 측정한 결과, 4-HB alcohol과 vanillyl alcohol을 모두 산화하는 활성을 가지며, 4-HB alcohol을 더잘 산화하는 것을 확인하였다(Table 3). 따라서, 4-HB alcohol을 더 많이 생산하는 균을 개발하기 위해 염색체상에서 creG 유전자를 결손하는 것이 바람직하다고 판단된다.
- 제작된 벡터 pK19-ΔcreG를 GAS177에 도입하여 creG가 결손된 GAS225를 개발하였다. Fig. 2C에서 보는 것처럼 creG 결손에 의해 GAS225에서 약 0.8 kb 정도 DNA 크기가 감소하는 것을 확인하였다. 한편, 변이 ubiC 유전자 발현을 플라스미드 형태로 하는 것보다는 염색체에 삽입하여 발현하여 세포에 대한 부담을 줄이고 4-HB alcohol 생산을 안정적으로 하기 위한 목적으로, pK19-ΔpcaHG::Psod-ubiCpr를 GAS225 에 형질전환하여 0.
- glutamicum 세포 안에 존재하는 다양한 종류의 alcohol dehydrogenases (ADHs), oxidoreductases, putative aromatic aldehyde reductases (AARs) 등의 작용 때문인 것으로 추정된다. 4-HB alcohol을 더 많이 생산하기 위한 목적으로 creG 가 결손된 GAS225/pUMF29균주와 모균주인 GAS177/ pUMF29를 플라스크에서 배양하며 평가한 결과, 3가지 화합물의 생산농도는 두 균주 모두 거의 유사하여 4HB alcohol 의 농도가 향상되지 않았다(Table 2). 이는 위에서 언급한 다양한 ADHs 및 관련 효소들이 일반적으로 정반응인 환원 반응뿐만 아니라 효소역가는 약하지만 역반응인 산화반응도 촉매하기 때문에, GAS225에 CreG 효소가 없더라도 역반응이 일어날 수 있어 4-HB alcohol의 산화가 일정 수준 진행되기 때문에 4-HB alcohol의 생산 농도가 더 향상되지 않는 것으로 사료된다[24].
- 이는 위에서 언급한 다양한 ADHs 및 관련 효소들이 일반적으로 정반응인 환원 반응뿐만 아니라 효소역가는 약하지만 역반응인 산화반응도 촉매하기 때문에, GAS225에 CreG 효소가 없더라도 역반응이 일어날 수 있어 4-HB alcohol의 산화가 일정 수준 진행되기 때문에 4-HB alcohol의 생산 농도가 더 향상되지 않는 것으로 사료된다[24]. 마지막으로, ubiCpr가 pcaHG에 도입된 GAS355를 발효한 결과, 0.32 g/l 4-HBA, 0.3 g/l 4-HB aldehyde, 2.3g/l 4-HB alcohol을 생산하였다. 이는 대조 균인 GAS225/pUMF29와 비교하여 4-HBA는 약간 저하되며 4-HB aldehyde 및 alcohole 거의 유사한 수준으로, ubiCpr 를 플라스미드 대신 염색체에 삽입하더라도 4-HB aldehyde 및 alcohol의 생산이 저하되지 않음을 보여주었다.
후속연구
- coli에서 340mg/l 생산된 것이 가장 높은 수준이다[3]. 따라서 본 연구를 통해 2.3 g/l 4-HB alcohol이 생산된 것은 매우 높은 수준으로, 향후 대사공학기법을 통해 더 우수한 균을 개발할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 4-HB aldehyde의 환원에 직접적으로 관련된 유전자를 찾아 결손하면 기능성 물질인 4- HB aldehyde도 높은 수준으로 생산할 수 있는 균주를 개발할 수 있을 것으로 기대된다.
- 3 g/l 4-HB alcohol이 생산된 것은 매우 높은 수준으로, 향후 대사공학기법을 통해 더 우수한 균을 개발할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 4-HB aldehyde의 환원에 직접적으로 관련된 유전자를 찾아 결손하면 기능성 물질인 4- HB aldehyde도 높은 수준으로 생산할 수 있는 균주를 개발할 수 있을 것으로 기대된다.
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