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문제 정의
- 본 연구에서는 해수로부터 육상 및 해양식물을 분해할 수 있는 신규의 세균을 발굴하였고, 이 세균이 생산하는 cellulase 효소가 cellulose로부터 고부가가치의 cellooligosaccharide를 생산할 수 있음을 검증하였다.
가설 설정
- of the 16S rRNA sequences are given in parentheses. (B) DNA-DNA hybridization of S2-3 with the five phylogenetically close type strains. (1) S2-3, (2) Seonamheaicola algicola KCTC 42396, (3) Seonamheaicola aphaedonensis KCTC 32578, (4) Aestuariibaculum scopimerae KCTC 32459, (5) Aestuariibaculum suncheonense KACC 16186, (6) Gaetbulibacter aestuarii KACC 17489, (7) Lactobacillus acidophilus KCCM 32820.
제안 방법
- AZCLcellulose 기질은 효소에 의해 분해되면 푸른색을 나타내어 분해효소 생산 여부를 육안으로 식별이 가능함으로, 콜로니 주변에 푸른색을 형성하는 균만을 회수하여 새로운 고체배 지에 계대한 후 배양하였다. 3차례 이상의 계대 배양을 통해 순수한 콜로니를 회수하였다. 순수 분리된 콜로니는 0.
- API ZYM kit, Staph kit (Biomérieux, France)를 사용하여, 제조사의 제시된 방법에 따라 미생물 균주가 생산하는 세포 외 효소 생산능력, 기질이용능력, 유기산 생산능력에 관한 생리적 특성을 판별하였다.
- 탐침용 DNA 준비 및 hybridization 반응은 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II (Roche Applied Science, Germany)를 사용하여 수행하였다. Hybridization signale Quantity One Program (Bio-rad, USA)으로 측정하였고, S2-3의 signal을 100%로 하여 hybridization 정도를 환산하였다. 각 균주들에 대한 hybridization 값은 세 번의 반복 실험을 통하여 얻은 평균값으로 표시하였다.
- 선발된 균주는 Gram stain kit (BD, USA)를 사용하여 염색 후 현미경으로 관찰하였다. MA 배지에서 24시간 배양된 균체를 1% phosphotungstic acid (PTA)로 염색한 후 투과 전자현미경(JEM1010, Jeol, Japan)을 사용하여 균체 크기, 모양, 편모의 유무를 관찰하였다.
- 선발된 미생물주의 지방산 함량 및 polar lipid 등의 생화학적 특성 분석은 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 의뢰하여 수행하였다. S2-3과 16S rRNA 유전자 염기서열 상동성 및 N-J tree 로부터 계통분석발생적 유연관계가 가장 높은 표준균주를 선발하여 비교분석에 사용하였다. 표준균주는 Seonamhaeicola algicola KCTC 42396, Aestuariibaculum scopimarae KCTC 32459, Seonamhaeicola aphaedonensis KCTC 42396, Gaetbulibacter aestuarii KACC 17489, Aestuariibaculum suncheonense KACC 16186을 선정하였다.
- 22 µm syringe filter (Millipore, USA)를 이용하여 여과한 후 amicon ultracentrifugal filter (Millipore)로 농축하여 최종 2 ml의 배양여액을 준비하였다. S2-3이 세포 외부로 분비하는 cellulase에 의한 분해산물을 분석하기 위해서, 준비된 배양여액과 carboxylmethylcellulose (Sigma), cellobiose, cellotriose, cellotetraose, cellopentaose, cellohexaose (Megazyme, USA)를 기질로 하여 효소 반응을 수행하였다. 농축액 100 µl를 동량의 기질액(0.
- 5간격)의 고체 배지에 접종하여 30℃에서 48시간 동안 배양하면서 pH 변화에 따른 균체의 성장을 관찰하였다. 균주의 성장에 필요한 온도 조건을 알아보기 위해 4, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50℃의 조건에서 48시간 동안 배양하면서 성장 유무를 관찰 하였다.
- 각 반응액 10 µl를 Silica gel 60 plate (Merck, USA)에 스폿팅 한 후 이동상(n-부탄올 : 아세트산:증류수 = 2:1:2) 용액으로 전개하였다. 분리된 spote 발색시약(에탄올: 황산 = 9:1)을 스프레이로 plate 위에 골고루 뿌린 후 120℃에서 색이 나타날 때까지 가열하여 확인하였다.
- 선발된 균주는 Gram stain kit (BD, USA)를 사용하여 염색 후 현미경으로 관찰하였다. MA 배지에서 24시간 배양된 균체를 1% phosphotungstic acid (PTA)로 염색한 후 투과 전자현미경(JEM1010, Jeol, Japan)을 사용하여 균체 크기, 모양, 편모의 유무를 관찰하였다.
- 선발된 균주는 pH 4.5-11.0 (pH 0.5간격)의 고체 배지에 접종하여 30℃에서 48시간 동안 배양하면서 pH 변화에 따른 균체의 성장을 관찰하였다. 균주의 성장에 필요한 온도 조건을 알아보기 위해 4, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50℃의 조건에서 48시간 동안 배양하면서 성장 유무를 관찰 하였다.
- 3차례 이상의 계대 배양을 통해 순수한 콜로니를 회수하였다. 순수 분리된 콜로니는 0.3% carboxylmethylcelluose (CMC)가 포함된 MA 배지에 배양 후 congo red로 염색하여 효소 활성을 다시 확인하였다. Cellulose 분해 활성을 갖는 콜로니들 중에서 S2-3 균주를 선택하여 선택하여 다음 실험에 사용하였다.
- 4). 액체 배양 48시간 배양액 으부터 배양여액을 제조하여, cellulose 및 cellooligosaccharides 기질과 반응시킨 후 분해산물의 TLC 분석을 실시하였다. 그 결과, Seonamhaeicola sp.
- S2-3을 MB 액체 배지에서 24시간 진탕배양한 후 100 ml MB 액체배지가 들어있는 500 ml flask에 1%가 되도록 접종하여 96시간 동안 추가 배양하였다. 접종 후 24시간까지 는 6시간과 12시간에 샘플링하였으며, 24시간 이후부터는 24시간 간격으로 샘플링하였다. 각 샘플의 세포농도는 분광광도계를 이용하여 600 nm에서 측정하였고, cellulase 활성은 carboxylmethylcellulose (Sigma, USA)를 기질로 하여 DNS 법으로 측정하였다.
- 16S rRNA 유전자는 genomic DNA를 주형으로 하는 polymerase chain reaction (PCR) 법으로 증폭하였고[15], 프라이머는 bacterial universal primer (27F와 1492R)를 사용하였다 [16]. 증폭된 유전자 단편의 염기서열 분석은 바이오닉스(Korea)에 의뢰하여 수행하였다. 16S rRNA 유전자 염기서열의 상동성 검사는 BLAST program을 사용하였고, 표준 균주(type strain)들과의 유사성(similarity) 조사 및 16S rRNA 유전자 염기서열의 확보는 Ezbiocloud server (http://www.
- S2-3 및 표준균주는 MA 배지에서 배양하고 각 균체로부터 genomic DNA를 DNA Extraction Kit로 추출하여 준비하였다. 탐침용 DNA 준비 및 hybridization 반응은 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II (Roche Applied Science, Germany)를 사용하여 수행하였다. Hybridization signale Quantity One Program (Bio-rad, USA)으로 측정하였고, S2-3의 signal을 100%로 하여 hybridization 정도를 환산하였다.
- 미생물 균주의 콜로니를 Marine broth (MB) 배지에 접종하여 48시간 진탕배양(150 rpm, 30℃) 한 후, 배양액을 10,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 genomic DNA Extraction kit (DyneBio, Korea)를 사용하여 genomic DNA를 추출하 는데 사용하였다. 16S rRNA 유전자는 genomic DNA를 주형으로 하는 polymerase chain reaction (PCR) 법으로 증폭하였고[15], 프라이머는 bacterial universal primer (27F와 1492R)를 사용하였다 [16].
대상 데이터
- 3% carboxylmethylcelluose (CMC)가 포함된 MA 배지에 배양 후 congo red로 염색하여 효소 활성을 다시 확인하였다. Cellulose 분해 활성을 갖는 콜로니들 중에서 S2-3 균주를 선택하여 선택하여 다음 실험에 사용하였다.
- 각 균주들에 대한 hybridization 값은 세 번의 반복 실험을 통하여 얻은 평균값으로 표시하였다. Negative standard 균주는 Lactobacillus acidophilus KCCM 32820균주를 사용하였다.
- 제주도 연안해수로부터 cellulose 분해 활성을 갖는 해양미생물 균주 S2-3을 분리하여, Korean Agricultural Culture collection (KACC)에 기탁(기탁번호 : KACC 19205) 하였다. S2-3은 그람 음성균으로서 콜로니에 짙은 노란색을 띄고, 매끈한 표면의 콜로니를 형성하였다(Fig.
- S2-3과 16S rRNA 유전자 염기서열 상동성 및 N-J tree 로부터 계통분석발생적 유연관계가 가장 높은 표준균주를 선발하여 비교분석에 사용하였다. 표준균주는 Seonamhaeicola algicola KCTC 42396, Aestuariibaculum scopimarae KCTC 32459, Seonamhaeicola aphaedonensis KCTC 42396, Gaetbulibacter aestuarii KACC 17489, Aestuariibaculum suncheonense KACC 16186을 선정하였다. 모든 균주는 MA 배지에서 동일 조건으로 배양하였고, 지방산 분석은 Miller 등[19]의 방법에 준하여 methyl ester화 시킨 fatty acid methyl esters (FAME) mixture를 제작한 후, microbial identification system (MIDI)의 지침에 따라 gas chromatography (GC)를 사용하였다 [20].
데이터처리
- net/eztaxon)에서 수행하였다 [17]. Multialignment, 5’ 및 3’의 gap의 편집 및 phylogenetic tree 제작은 Mega 6 프로그램(https://www.megasoftware. net/)을 사용하여 수행하였으며, bootstrap value는 1,000회의 재구성된 자료로부터 계산되었다. evolutionary distance matrices는 Kimura’s two-parameter model의 algorithm에 따라서 계산하였다 [18].
- Hybridization signale Quantity One Program (Bio-rad, USA)으로 측정하였고, S2-3의 signal을 100%로 하여 hybridization 정도를 환산하였다. 각 균주들에 대한 hybridization 값은 세 번의 반복 실험을 통하여 얻은 평균값으로 표시하였다. Negative standard 균주는 Lactobacillus acidophilus KCCM 32820균주를 사용하였다.
이론/모형
- 증폭된 유전자 단편의 염기서열 분석은 바이오닉스(Korea)에 의뢰하여 수행하였다. 16S rRNA 유전자 염기서열의 상동성 검사는 BLAST program을 사용하였고, 표준 균주(type strain)들과의 유사성(similarity) 조사 및 16S rRNA 유전자 염기서열의 확보는 Ezbiocloud server (http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)에서 수행하였다 [17]. Multialignment, 5’ 및 3’의 gap의 편집 및 phylogenetic tree 제작은 Mega 6 프로그램(https://www.
- 회수된 균체는 genomic DNA Extraction kit (DyneBio, Korea)를 사용하여 genomic DNA를 추출하 는데 사용하였다. 16S rRNA 유전자는 genomic DNA를 주형으로 하는 polymerase chain reaction (PCR) 법으로 증폭하였고[15], 프라이머는 bacterial universal primer (27F와 1492R)를 사용하였다 [16]. 증폭된 유전자 단편의 염기서열 분석은 바이오닉스(Korea)에 의뢰하여 수행하였다.
- 모든 균주는 MA 배지에서 동일 조건으로 배양하였고, 지방산 분석은 Miller 등[19]의 방법에 준하여 methyl ester화 시킨 fatty acid methyl esters (FAME) mixture를 제작한 후, microbial identification system (MIDI)의 지침에 따라 gas chromatography (GC)를 사용하였다 [20]. Polar lipid 분석은 Minikin 등[21]의 방법에 따라 시료 준비 및 high performance TLC (HPTLC plate, 10 cm × 10 cm, Merck)를 수행하였다.
- S2-3과 선발된 5종의 표준균주와의 DNA-DNA hybridization (DDH) 분석을 한국미생물 보존센터(KCCM)에 의뢰하여 수행하였다. S2-3 및 표준균주는 MA 배지에서 배양하고 각 균체로부터 genomic DNA를 DNA Extraction Kit로 추출하여 준비하였다.
- net/)을 사용하여 수행하였으며, bootstrap value는 1,000회의 재구성된 자료로부터 계산되었다. evolutionary distance matrices는 Kimura’s two-parameter model의 algorithm에 따라서 계산하였다 [18].
- 5)에 섞은 후 37℃ 에서 24시간 반응시켰다. 각 기 질에 대한 효소 반응액의 산물eTLC(박층 크로 마토그래피) 방법으로 분석하였다. 각 반응액 10 µl를 Silica gel 60 plate (Merck, USA)에 스폿팅 한 후 이동상(n-부탄올 : 아세트산:증류수 = 2:1:2) 용액으로 전개하였다.
- 접종 후 24시간까지 는 6시간과 12시간에 샘플링하였으며, 24시간 이후부터는 24시간 간격으로 샘플링하였다. 각 샘플의 세포농도는 분광광도계를 이용하여 600 nm에서 측정하였고, cellulase 활성은 carboxylmethylcellulose (Sigma, USA)를 기질로 하여 DNS 법으로 측정하였다. 효소 반응은 50 mM Tris-Cl (pH 7.
- 표준균주는 Seonamhaeicola algicola KCTC 42396, Aestuariibaculum scopimarae KCTC 32459, Seonamhaeicola aphaedonensis KCTC 42396, Gaetbulibacter aestuarii KACC 17489, Aestuariibaculum suncheonense KACC 16186을 선정하였다. 모든 균주는 MA 배지에서 동일 조건으로 배양하였고, 지방산 분석은 Miller 등[19]의 방법에 준하여 methyl ester화 시킨 fatty acid methyl esters (FAME) mixture를 제작한 후, microbial identification system (MIDI)의 지침에 따라 gas chromatography (GC)를 사용하였다 [20]. Polar lipid 분석은 Minikin 등[21]의 방법에 따라 시료 준비 및 high performance TLC (HPTLC plate, 10 cm × 10 cm, Merck)를 수행하였다.
- 선발된 미생물주의 지방산 함량 및 polar lipid 등의 생화학적 특성 분석은 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 의뢰하여 수행하였다. S2-3과 16S rRNA 유전자 염기서열 상동성 및 N-J tree 로부터 계통분석발생적 유연관계가 가장 높은 표준균주를 선발하여 비교분석에 사용하였다.
- 제주도 성산 연안해수를 채취하여 멸균수에 10-1−10-5으 로 serial dilution 법으로 희석하였다. 희석액을 각각 200 μl 씩 Marine agar (MA) 배지에 도말한 후, 30℃에서 48시간 배양하였다.
성능/효과
- 16S rRNA 유전자 염기서열 상동성 검색 결과를 토대로 하는 N-J 계통 수 제작을 통한 계통 발생적 연관성 분석 결과, 균주 S2-3은 S. algicola Gy8와 S. aphaedonensis AH-M5와 가장 가까운 연관 관계를 형성하고 있는 것으로 분석되었다 (Fig. 2A).
- 그 결과, Seonamhaeicola sp. S2-3가 세포 외부로 분비하는 cellulase는 polysaccharide 인 cellulose를 분해하여 다양한 길이의 cellooligosaccharides를 생산하며, triose 이상의 cellooligosaccharide를 biose까지 분해하는 것을 확인하였다(Fig. 5). 이러한 TLC patterne 일반적인 endo-type cellulase의 가수분해 활성 특성과 일치한다.
- S2-3을 탐침으로하는 DDH 결과에서 S. algicola Gy8와 가장 높은 32%의 hybridization 수치를 보였으며, S. algicola Gy8을 탐침으로 하는 DDH 실험에서는 33%의 hybridization 수치를 보였다. 그 외의 표준균들과는 24− 26%의 hybridization 수치를 보였다(Fig.
- S2-3의 16S rRNA 유전자의 염기서열 정보를 토대로 NCBI와 Ezbiocloud 서버에서 상동성 검색을 수행하여 Seonamhaeicola algicola Gy8, Hyunsoonleella udonensis JG48, Aestuariibaculum scopimerae I-15, Aestuariibaculum suncheonense SC17, Seonamhaeicola aphaedonensis AHM5, Gaetbulibacter aestuarii KYW382, Hyunsoonleella pacifica SW033, Gaetbulibacter aquiaggeris KEM-8 등과 각각 97.08, 95.01, 94.86, 94.778, 94.72, 94.72, 94.60, 94.58%의 높은 상동성을 보였다.
- 2B). 이러한 결과를 토대로 S2-3은 Seonamhaeicola 속의 한 종으로서 신종일 것으로 판단되었다. 이후 본 논문에서는 균주 S2-3을 Seonamhaeicola sp.
- Seonamhaeicola 속 균주는 그람 음성균으로 주요 퀴논으로 menaquinone-6 (MK-6)을 포함하고 있고 주요 세포지방산으로 iso-C15:0으로 구성되어 있으며, 유전체 DNA G+C 농도는 약 33−36 mol%로 알려져 있다. 이번 연구로부터 분리된 균주 S2-3은 형태적, 생리적, 유전적 특성 분석을 통해 Seonamhaeicola 속에 속하는 새로운 종으로 분류되었다.
- 1B). 전자현미경 분석 결과, S2-3 세포는 긴 막대기 형태이며 균체의 크기는 2.85 × 0.25 um (가로 × 세로)이고, 편모를 갖지 않는 것으로 관찰되었다(Fig. 1C). S2-3은 10−45℃의 범위에서 성장이 가능하고 30−35℃에서 가장 잘 자랐으며, pH 5.
후속연구
- Seonamhaeicola sp. S2-3 유래의 cellulase가 어떤 생화학적 특성을 갖는지는 추후 연구가 필요하며, 이러한 연구를 통해 지구상의 탄소재 순환을 위한 해결책이 마련되길 기대한다.
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