[논문]한우 태아기 6, 9개월령 등심 조직의 전사체 분석을 통한 근생성 및 지방생성 관여 유전자 발굴

정태준; 정기용; 박원철; 손주환; 박종은; 채한화; 권응기; 안준상; 이지웅; 임다정

doi:10.5352/jls.2020.30.1.45

한우 태아기 6, 9개월령 등심 조직의 전사체 분석을 통한 근생성 및 지방생성 관여 유전자 발굴
Transcriptome Analysis of Longissimus Tissue in Fetal Growth Stages of Hanwoo (Korean Native Cattle) with Focus on Muscle Growth and Development 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.30 no.1, 2020년, pp.45 - 57

정태준 (국립축산과학원 동물유전체과) , 정기용 (국립한국농수산대학 한우학과) , 박원철 (국립축산과학원 동물유전체과) , 손주환 (국립축산과학원 동물유전체과) , 박종은 (국립축산과학원 동물유전체과) , 채한화 (국립축산과학원 동물유전체과) , 권응기 (국립축산과학원 동물유전체과) , 안준상 (국립축산과학원 동물유전체과) , (국립축산과학원 동물유전체과) , 이지웅 (전남대학 동물공학과) , 임다정 (국립축산과학원 동물유전체과)

초록
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동물의 근섬유는 배아기와 태아기를 거치며 형성하게 되며 출생 후에는 상처 치유를 위한 것 외에 근섬유 수를 늘리는 순수한 근섬유 형성은 없으며, 이미 존재하고 있는 근섬유의 비대로 근육의 성장이 이뤄진다. 따라서 태아기의 근육의 성장과 발달이 성체의 근육량 및 조성에 미치는 영향이 매우 크며 이 시기에 발현되는 유전자 및 기능을 구명하는 것은 최종적으로 육질, 육량에 개선시키기 위한기초 자료로 활용될 수 있을 것이다. 하지만 한우에서의 연구는 전무한 실정이다. 본 연구는한우 태아기 성장 단계별 근육의 성장과 발달에 관여하는 유전자를 찾기 위한 전사체 분석을 수행하였다. 한우 태아기 6, 9개월령 등심 조직 시료에서 생산한 전사체 자료를 대상으로 DESeq2와 edgeR을 활용하여 성장단계별 유전자의 발현량을 분석하여 차등발현유전자군을 추출했으며, 2개 소프트웨어서 공통적으로 추출된 유전자군(6개월령 특이 발현 유전자 913개, 9개월령 특이 발현 유전자 233개)을 차등발현유전자로 구명 하였다. 차등발현유전자군으로 분류하였다. 차등발현유전자군을 활용하여공발현 유전자 네트워크 분석을 구성하였으며, 유사한 발현 양상을 보이는 유전자들을 그룹화하여 6개월령 특이 발현 유전자군 5개, 9개월령 특이 발현 유전자군 2개의 모듈로 분류했다. 각 모듈은 Gene Ontology (GO) 및 KEGG pathway 분석으로 유의한 기능을 확인하였다. 그 결과, 한우 태아기 6, 9개월령 특이 발현 유전자 네트워크 중, 근육과 지방생성 대사회로와 관련된 2개의 모듈에 대해 네트워크 내에 허브 유전자를 선정할 수 있었다. STRING을 활용하여 단백질 상호작용 네트워크를 구성하고, MCC (maximal clique centrality) 점수를 활용하여 상위 10%의 유전자들을 공발현 분석의 모듈내 허브 유전자로 선정하였다. 그 결과 6개월령 특이 발현 유전자군의 모듈에서는 axin1(AXIN1) 유전자, 9개월령 특이 발현 유전자군 모듈에서는 succinate-CoA ligase ADP-forming beta subunit(SUCLA2) 유전자가 허브 유전자로 확인되었다. AXIN1 유전자는 선행 연구를 통해 6개월령에서 9개월령으로 넘어가면서 근섬유 수의 증식이 억제되고 지방생성이 활발히 이뤄지는 것에 핵심적인 역할을 하는 것으로 추정할 수 있었다. 또한, 시트르산 회로의 중요 요소인 SUCLA2 유전자는 소의 태아기 지방 조직 성장단계에 따라 유전자의 발현이 증가된다는 보고에 따라, 지방 대사와 관련된 유전자임을 알 수 있었다. 추후 한우 태아기 6, 9개월령에 특이적으로 발현된 유전자들을 대상으로 근육 및 지방 형성 관련 기능을 검증하는 후속 연구가 필요할 것이다.

Abstract ▼ AI-Helper

The prenatal period in livestock animals is crucial for meat production because net increase in the number of muscle fibers is finished before birth. However, there is no study on the growth and development mechanism of muscles in Hanwoo during this period. Therefore, to find candidate genes involved in muscle growth and development during this period in Hanwoo, mRNA expression data of longissimus in Hanwoo at 6 and 9 months post-conceptional age (MPA) were analyzed. We independently identified differentially expressed genes (DEGs) using DESeq2 and edgeR which are R software packages, and considered the overlaps of the results as final-DEGs to use in downstream analysis. The DEGs were classified into several modules using WGCNA then the modules' functions were analyzed to identify modules which involved in myogenesis and adipogenesis. Finally, the hub genes which had the highest WGCNA module membership among the top 10% genes of the STRING network maximal clique centrality were identified. 913(6 MPA specific DEGs) and 233(9 MPA specific DEGs) DEGs were figured out, and these were classified into five and two modules, respectively. Two of the identified modules'(one was in 6, and another was in 9 MPA specific modules) functions was found to be related to myogenesis and adipogenesis. One of the hub genes belonging to the 6 MPA specific module was axin1 (AXIN1) which is known as an inhibitor of Wnt signaling pathway, another was succinate-CoA ligase ADP-forming beta subunit (SUCLA2) which is known as a crucial component of citrate cycle.

주제어

표/그림 (12)

그림 Fig. 1. (A) PCA distinguishes the gene expression pattern of samples.
표 Table 1. Differentially expressed genes (DEGs) between 6 and 9 months in Hanwoo longissimus tissue identified using DESeq2 and edgeR software
표 Table 2. Top 10 of 6 months post-conceptional age specific differentially expressed genes in Hanwoo longissimus tissue identified using DESeq2
표 Table 3. Top 10 of 9 months post-conceptional age specific differentially expressed genes in Hanwoo longissimus tissue identified using DESeq2
그림 Fig. 2. 6 months post-conceptional age specific differentially expressed genes network analysis by WGCNA.
그림 Fig. 3. 9 months post-conceptional age specific differentially expressed genes network analysis by WGCNA.
그림 Fig. 4. Gene ontology biological process term enrichment of the 6 months post-conceptional age specific differentially expressed genes.
그림 Fig. 5. Kyoto encyclopedia of genes and genomes enrichment of the 6 months post-conceptional age specific differentially expressed genes.
그림 Fig. 6. Functional analysis of the 9 months post-conceptional age specific differentially expressed genes.
그림 Fig. 7. STRING protein-protein interaction network. Yellow nodes with black border are candidates of the hub gene.
표 Table 4. Top 10% of STRING maximal clique centrality of 6 months post-conceptional age specific DEGs in turquoise module
표 Table 5. Top 10% of STRING maximal clique centrality of 9 months post-conceptional age specific DEGs in blue module

AI 본문요약
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문제 정의

특히, Lehnert 등[29]에 따르면 소는 태아기 3분의 2 지점(약 6개월령)에서 근섬유 수의 고정이 이뤄지고, 출생 준비를 위해 골격근의 극적인 적응을 보인다고 하였다. 따라서 본 연구에서는 한우 태아기 6개월령 및 9개월령의 유전자 발현 양상을 살펴 보고, 근육의 성장과 발달에 관여할 것으로 여겨지는 유전자들을 규명하고자 하였다.
이처럼 여러 가축에서 태아기 근육의 성장과 발달에 관여하는 유전자들에 관한 연구들이 진행되었지만 한우에 관한 연구는 전무한 실정이다. 본 연구를 통하여 한우 태아기 등심 조직의 유전자 발현 양상을 살펴보고, 근육의 성장과 발달에 관여할 것으로 여겨지는 유전자들을 알아보고자 하였다.

가설 설정

(A) PCA distinguishes the gene expression pattern of samples. (B) Heatmap shows differentially expressed genes expression pattern.

제안 방법

1–TOM 행렬을 euclidean 방식으로 거리행렬(distance matrix)화하여 평균 연관(average linkage) 방식으로 계층적 군집화(hierarchical clustering) 후 최소 모듈 크기 30, deepSplit은 2로 설정한 ‘cutreeDynamic’ 함수를 이용 발현되는 양상에 따라 모듈을 나누고, 각각의 모듈을 색깔로 구분하여 Cytoscape로 성장단계별 차등발현유전자군의 네트워크를 시각화하였다.
edgeR은 filterByExpr 함수로 필터링된 발현량 데이터를 활용해 동일한 옵션으로 차등발현유전자군을 추출하였다. DESeq2, edgeR에서 공통으로 추출된 차등발현유전자군의 발현 양상은 주성분 분석(Principal Component Analysis, PCA) 및 heatmap분석으로 확인하였다. 최종적으로 두 개의 소프트웨어에서 공통으로 존재하는 유전자들을 대상으로 차등발현 유전자군의 공발현 네트워크 및 기능 분석에 활용하였다.
1) [46]를 활용하여 시각화 하였다. DESeq2의 rlog 함수로 성장단계별 차등발현유전자군 발현량 데이터를 변환하여 WGCNA 분석의 입력 파일로 활용하였다. 인접행렬을 구하기 위한 네트워크 타입을 signed hybrid (두 유전자간의 상관계수가 양수이면 그 값을 그대로 사용하고, 음수이면 0으로 취급)로, 위상 중첩 행렬(topological overlap matrix, TOM) 타입은 unsigned로 설정하였다.
1) [39] 소프트웨어의 index 및 quant 기능을 통해 염기서열 정렬 및 전사체 발현량을 확보하였다. R 패키지인 tximport (Michael Love, version 1.12.3)을 활용하여 유전자 발현량으로 변환했으며 DESeq2 (Michael Love, version 1.24.0) [30], edgeR (Yunshun Chen, version 3.26.5) [42]을 이용하여 차등발현유전자군을 추출하였다. 차등 발현유전자군의 발굴은 DESeq2와 edgeR을 활용하여 공통적으로 존재하는 차등발현유전자군을 추출하여 추후 기능 분석에 활용하였다.
2 버전을 사용하였다. Salmon (Rob Patro, version 0.14.1) [39] 소프트웨어의 index 및 quant 기능을 통해 염기서열 정렬 및 전사체 발현량을 확보하였다. R 패키지인 tximport (Michael Love, version 1.
5를 초과하는 값을 가진 유전자를 차등발현유전자로 추출하였다. edgeR은 filterByExpr 함수로 필터링된 발현량 데이터를 활용해 동일한 옵션으로 차등발현유전자군을 추출하였다. DESeq2, edgeR에서 공통으로 추출된 차등발현유전자군의 발현 양상은 주성분 분석(Principal Component Analysis, PCA) 및 heatmap분석으로 확인하였다.
공발현 네트워크 분석 결과, 근내지방 및 근육 형성 관련 유의한 기능을 보유한 모듈들을 대상으로 각 모듈별 허브 유전자를 찾기 위해 STRING (ELIXIR Core Data Resources, version 11.0) [49]을 활용한 단백질-단백질 상호작용 네트워크로 허브 유전자 후보군을 추출한 후 이 중 공발현 네트워크의 모듈내 지위(module membership)값이 가장 높은 유전자를 허브 유전자로 분류하였다. 모듈내 지위가 높을수록 그 유전자의 모듈에 대한 대표성이 높다는 것을 의미한다.
공발현 네트워크 분석을 통해 비슷한 발현 양상을 보이는 유전자군들이 그룹화되어 모듈로 구성 되었고, 각 모듈은 단백질 상호작용 네트워크 분석을 통해 그룹 내에 존재하는 유전자들과 연결 정도를 분석하여 모듈별 허브 유전자를 선정하였다. 6개월령에서 특이적으로 발현되는 유전자 중 turquoise모듈의 308개 유전자를 대상으로 STRING 단백질 상호작용 분석 결과 Fig.
4, 나머지는 기본 옵션으로 설정하였다. 또한, R 패키지인 clusterProfiler (Guangchuang Yu, version 3.12.0)[55]를 이용하여 pvalueCutoff = 0.1로 옵션을 설정하여 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) [26] 경로 분석을 수행하였다.
본 연구는 수정 후 6, 9개월령 태아의 등심 조직 추출 후, 전사체 분석을 통해 성장 단계별의 차등발현유전자군(Differentially Expressed Genes, DEGs)을 발굴하였으며, 공발현 네트워크 분석(Co-expression network)을 유전자 상호작용 분석 및 기능 분석을 수행하였다.
본 연구에서는 DESeq2, edgeR 각각 정규화를 거친 후 DESeq2는 lfcThreshold 파라미터를 1.5로 설정하고 그 결과에서 Benjamini-Hochberg방법으로 조정된 p-value (FDR) < 0.05, log2 fold change 절댓값 1.5를 초과하는 값을 가진 유전자를 차등발현유전자로 추출하였다.
비슷한 발현 양상으로 그룹화된 차등발현유전자군은 Cytoscape의 플러그인 ClueGO (Bernhard Mlecnik, version 2.5.4)[7]를 사용하여 Gene Ontology (GO) [2]의 Biological process(BP) 기능 분석을 수행하였다. P-value는 0.
성장단계별 차등발현유전자군 각각에 대해 ‘pickSoftThreshold’ 함수를 이용하여 파워(soft threshold, power)를 결정, 인접행렬, TOM을 구하였다.
DESeq2의 rlog 함수로 성장단계별 차등발현유전자군 발현량 데이터를 변환하여 WGCNA 분석의 입력 파일로 활용하였다. 인접행렬을 구하기 위한 네트워크 타입을 signed hybrid (두 유전자간의 상관계수가 양수이면 그 값을 그대로 사용하고, 음수이면 0으로 취급)로, 위상 중첩 행렬(topological overlap matrix, TOM) 타입은 unsigned로 설정하였다. 성장단계별 차등발현유전자군 각각에 대해 ‘pickSoftThreshold’ 함수를 이용하여 파워(soft threshold, power)를 결정, 인접행렬, TOM을 구하였다.
한우 태아기 6, 9개월령 등심 조직은 Illumina HiSeq 0000 플랫폼을 활용하여 전사체 자료를 생산하였다. 전사체 자료의 품질 관리는 Trimmomatic (USADELLAB, version 0.36) [8] 소프트웨어를 활용하여 염기서열 양 말단의 베이스 퀄리티 3 이하와 sliding window로 4개 염기 기준 퀄리티 스코어 평균 30(Q30) 이하이면서, 남은 read의 길이가 최소 55 bp를 넘지 않는 염기서열을 제거하였다. 참조 서열은 Ensembl 데이터베이스의 소(Bos taurus) ARS-UCD1.
이는 차등발현유전자군의 한계치를 조금 높게 하여 추출한 결과 매우 밀접한 상관관계에 있는 유전자들로만 집단이 구성된 것으로 사료된다. 즉, 유전자간의 상관 계수가 상향 평준화되어 분포범위가 매우 좁아 모듈화할 수 있는 변별력이 매우 떨어지므로 이를 보정하기 위해 높은 수준의 파워를 설정하였다.
5) [42]을 이용하여 차등발현유전자군을 추출하였다. 차등 발현유전자군의 발굴은 DESeq2와 edgeR을 활용하여 공통적으로 존재하는 차등발현유전자군을 추출하여 추후 기능 분석에 활용하였다. DESeq2 소프트웨어는 발현량 정규화 방법으로 median of ratios방식을 사용한다[1].
DESeq2, edgeR에서 공통으로 추출된 차등발현유전자군의 발현 양상은 주성분 분석(Principal Component Analysis, PCA) 및 heatmap분석으로 확인하였다. 최종적으로 두 개의 소프트웨어에서 공통으로 존재하는 유전자들을 대상으로 차등발현 유전자군의 공발현 네트워크 및 기능 분석에 활용하였다.

대상 데이터

공발현 네트워크 분석을 통해 비슷한 발현 양상을 보이는 유전자군들이 그룹화되어 모듈로 구성 되었고, 각 모듈은 단백질 상호작용 네트워크 분석을 통해 그룹 내에 존재하는 유전자들과 연결 정도를 분석하여 모듈별 허브 유전자를 선정하였다. 6개월령에서 특이적으로 발현되는 유전자 중 turquoise모듈의 308개 유전자를 대상으로 STRING 단백질 상호작용 분석 결과 Fig. 7A와 같은 단백질 상호작용 네트워크가 구축 되었고, 이 중 MCC 점수 상위 10%인 28개의 유전자(Table 4)를 후보로 선정하였다. 이 중 공발현 네트워크 모듈내지위값이 가장 높은 axin 1 (AXIN1)을 허브 유전자로 선정하였다.
이 중 공발현 네트워크 모듈내지위값이 가장 높은 axin 1 (AXIN1)을 허브 유전자로 선정하였다. 9개월령에서 특이적으로 발현되는 유전자 중 blue모듈의 60개 유전자는 단백질 상호작용 분석 결과, Fig. 7B와 같은 결과를 보였으며, 이 중 MCC 점수 상위 10%인 5개의 유전자를 허브 유전자 후보군(Table 5)으로 선정하였다. 이 중 공발현 네트워크에서 모듈내 지위값이 가장 높은 succinate-CoA ligase ADP-forming beta subunit (SUCLA2) 유전자를 허브 유전자로 선정하였다.
9개월령에서 특이적으로 발현된 유전자군의 공발현 네트워크 중 blue 모듈에서acetyl-CoA biosynthetic process from pyruvate 기능과 관련하여 DLAT, DLD, PGK1, tricarboxylic acid cycle에는 DLAT, DLD, MDH1, ND4L, NDUFS1, SLC 25A12, SUCLA2 등의 유전자가 존재 하였다. Zhou 등(2012)[57]은 지방이 많은 Rongchang돼지 품종에서 지방이 적은 품종인 Landrace보다 MDH1 유전자가 높은 발현량을 보인다고 발표했다.
모듈내 지위가 높을수록 그 유전자의 모듈에 대한 대표성이 높다는 것을 의미한다. STRING은 Cytoscape에서 플러그인인 stringApp (John Morris, version 1.4.2)으로 Confidence cutoff 0.4, Maximum additional interactors 0의 옵션을 설정하여 각 모듈 유전자들에 대한 네트워크 데이터를 활용하였으며, cytoHubba (Chia-Hao Chin, version 0.1) [12] 플러그인의 MCC (maximal clique centrality)방식으로 유전자별 MCC점수를 뽑아 상위 10% 이내인 유전자를 후보군으로 선정하였다. Chin 등은 효모 단백질-단백질 상호작용 네트워크에서 MCC방식이 허브 유전자를 찾는데 높은 정확도를 보였다고 보고하였다[12].
3A와 같이 시각화 하였다. blue 모듈은 60개, turquoise 모듈은 132개의 유전자로 구성되었다(Supplementary 2).
본 시험에 사용된 공시 축은 국립축산과학원 한우연구소의 임신우를 도축하여태아기 6개월령 6두 및 9개월령 8두를 대상으로 등심 조직를 채취하였다. 동물 실험 수행에 관련된 모든 과정은 국립축산과학원 동물실험윤리위원회 승인(승인번호: NIAS-2018-319)을 받아 진행되었다.
7A와 같은 단백질 상호작용 네트워크가 구축 되었고, 이 중 MCC 점수 상위 10%인 28개의 유전자(Table 4)를 후보로 선정하였다. 이 중 공발현 네트워크 모듈내지위값이 가장 높은 axin 1 (AXIN1)을 허브 유전자로 선정하였다. 9개월령에서 특이적으로 발현되는 유전자 중 blue모듈의 60개 유전자는 단백질 상호작용 분석 결과, Fig.
7B와 같은 결과를 보였으며, 이 중 MCC 점수 상위 10%인 5개의 유전자를 허브 유전자 후보군(Table 5)으로 선정하였다. 이 중 공발현 네트워크에서 모듈내 지위값이 가장 높은 succinate-CoA ligase ADP-forming beta subunit (SUCLA2) 유전자를 허브 유전자로 선정하였다.
한우 태아기 6, 9개월령 등심 조직은 Illumina HiSeq 0000 플랫폼을 활용하여 전사체 자료를 생산하였다. 전사체 자료의 품질 관리는 Trimmomatic (USADELLAB, version 0.

이론/모형

차등 발현유전자군의 발굴은 DESeq2와 edgeR을 활용하여 공통적으로 존재하는 차등발현유전자군을 추출하여 추후 기능 분석에 활용하였다. DESeq2 소프트웨어는 발현량 정규화 방법으로 median of ratios방식을 사용한다[1]. 또한 샘플 별 참조유전자의 발현량 통계데이터를 도출하는 함수에서 log2 fold change 한계값(lfcThreshold) 파라미터를 설정할 경우 이 값을 넘지 못하는 데이터를 제거하는 독립 필터링(independent filtering) 결과로만 DEGs를 추출한다.
차등발현유전자군의 공발현 네트워크 분석을 위해 R 패키지인 WGCNA (Peter Langfelder, version 1.68) [28]을 사용하였고, 네트워크 분석 소프트웨어인 Cytoscape (Cytoscape Consortium, version 3.7.1) [46]를 활용하여 시각화 하였다. DESeq2의 rlog 함수로 성장단계별 차등발현유전자군 발현량 데이터를 변환하여 WGCNA 분석의 입력 파일로 활용하였다.
36) [8] 소프트웨어를 활용하여 염기서열 양 말단의 베이스 퀄리티 3 이하와 sliding window로 4개 염기 기준 퀄리티 스코어 평균 30(Q30) 이하이면서, 남은 read의 길이가 최소 55 bp를 넘지 않는 염기서열을 제거하였다. 참조 서열은 Ensembl 데이터베이스의 소(Bos taurus) ARS-UCD1.2 버전을 사용하였다. Salmon (Rob Patro, version 0.

성능/효과

6개월령 특이 발현 유전자군 blue 모듈은 peptidyl-lysine hydroxylation, peptidyl-proline modification 등이 유의적으로 나타났다. Peptidyl-lysine hydroxylation과 peptidyl-proline modification 중, peptidyl-proline hydroxylation는 콜라겐(collagen) 생합성 과정과 관련되어 있다고 알려져 있다[36].
6개월령 특이 발현 유전자군의 공발현 네트워크 중 turquoise 모듈은 KEGG pathway 분석(FDR adjusted p-value 0.011) 결과, dishevelled segment polarity protein 2 (DVL2), SRY-box transcription factor 17 (SOX17), nuclear factor of activated T cells 4 (NFATC4), C-terminal binding protein 1(CTBP1), transcription factor 7 like 1 (TCF7L1), NKD inhibitor of WNT signaling pathway 1 (NKD1), AXIN1, NKD inhibitor of WNT signaling pathway 2 (NKD2), Wnt family member 4 (WNT4), frizzled class receptor 8 (FZD8) 유전자 등으로 구성된 Wnt signaling pathway가 유의하게 나타났다. Wnt signaling pathway는 동물의 근육과 지방 형성 조절에 매우 중요한 경로라고 보고되었다[15].
9개월령 등심조직에서 특이적으로 발현된 유전자들 중, 6개월령 대비 가장 큰 차이를 보인 유전자는 ENSBTAG00000001858로 novel gene이었고, Basic Local Alignment Search Tool(BLAST) [24] 검색 결과 voltage dependent anion channel 2(VDAC2)와 높은 유사성(query cover 59% percent identity 98.65%)을 보였다. VDAC2는 전압의존적(voltage dependent)이온 채널 단백질인 VDAC2를 암호화하고 있는 유전자이다[32].
9개월령 특이 발현 유전자군 중 blue모듈은 15개의 유전자가 관여하고 있었으며, acetyl-CoA biosynthetic process from pyruvate, oxaloacetate metabolic process 과 같은 에너지 대사 관련 기능들이 나타났다(Fig. 6A). 또한, clusterProfiler 소프트웨어를 활용하여 KEGG pathway 분석한 결과 Pyruvate metabolism, Carbon metabolism, Propanoate metabolism 등의 대사회로가 유의함을 확인하였다(Fig.
9개월령 특이 발현 유전자군의 blue 모듈은 acetyl-CoA biosynthetic process from pyruvate, cellular respiration, tricarboxylic acid cycle 등의 세포 호흡, 에너지 대사 관련 기능이 유의한 것으로 나타났다. Remels 등[41]은 근세포의 분화 과정에서 분화 전 대비 세포 호흡 및 에너지 대사가 증가한다고 보고하였다.
4A), KEGG pathway 분석에서는 유의한 기능이 없었다. Brown모듈은 transcription from RNA polymerase I promoter 등 8개의 유의한 기능을 보였으며(Fig. 4B), KEGG는 유의한 기능이 나타나지 않았다. green모듈은 35개의 기능을 가지고 있었으며(Fig.
1A와 같이 확인할 수 있었다. DESeq2 소프트웨어 분석 결과, 태아기 6개월령에서 특이적으로 발현되는 유전자 1,233개, 9개월령에서 특이적으로 발현되는 유전자 333개로 나타났다. edgeR 소프트웨어를 활용한 분석결과는 6개월령에서 특이적으로 발현되는 유전자 1,598개, 9개월령에서 특이적으로 발현되는 유전자 1,125개를 확인하였다.
54%가 품질관리과정을 통과하였다. Salmon을 이용한 참조 서열 매핑 과정에서 최종적으로 272,605,173개의 염기서열이 정렬되어 원시 데이터 기준 약 67.76%의 매핑 비율을 보였다(Supplementary 1). 샘플별 발현량 데이터의 PCA 결과를 Fig.
5B). Yellow모듈은 17개 기능이 유의하였으나(Fig. 4E), KEGG pathway 분석에서는 유의한 경로가 없는 것으로 확인 되었다.
clueGO 소프트웨어를 활용한 BP분석 결과 6개월령 특이 발현 유전자군의 blue모듈은 prostaglandin biosynthetic process 등의 19개의 유의한 기능을 보유하고 있음을 확인했으며(Fig. 4A), KEGG pathway 분석에서는 유의한 기능이 없었다. Brown모듈은 transcription from RNA polymerase I promoter 등 8개의 유의한 기능을 보였으며(Fig.
DESeq2 소프트웨어 분석 결과, 태아기 6개월령에서 특이적으로 발현되는 유전자 1,233개, 9개월령에서 특이적으로 발현되는 유전자 333개로 나타났다. edgeR 소프트웨어를 활용한 분석결과는 6개월령에서 특이적으로 발현되는 유전자 1,598개, 9개월령에서 특이적으로 발현되는 유전자 1,125개를 확인하였다. 두 소프트웨어에서 공통적으로 나타난 차등발현유전자군은 6개월령 특이 발현유전자 913개, 9개월령 특이 발현 유전자 233개가 확인되었다(Table 1).
4B), KEGG는 유의한 기능이 나타나지 않았다. green모듈은 35개의 기능을 가지고 있었으며(Fig. 4C), Notch signaling pathway, Axon guidance, VEGF signaling pathway 등의 경로가 유의한 것으로 나타났다(Fig. 5A). turquoise 모듈은 5개의 유의한 기능이 나타났으며(Fig.
5A). turquoise 모듈은 5개의 유의한 기능이 나타났으며(Fig. 4D), Wnt signaling pathway, Axon guidance, Hippo signaling pathway 등의 KEGG pathway 경로를 보였다(Fig. 5B). Yellow모듈은 17개 기능이 유의하였으나(Fig.
6B). turquoise 모듈은 8개의 유의한 clueGO BP term을 확인했으며(Fig. 6C), Calcium signaling 경로 등이 유의한 것을 확인하였다(Fig. 6D).
turquoise 모듈은 establishment or maintenance of apical/ basal cell polarity기능이 유의한 것으로 나타났다. 세포의 극성은 세포 분열시 방향을 결정하게 되고 골격근에서 정점(apical)과 기저부(basal)의 비대칭 분할은 정점 자식 세포의 근섬유 접촉을 끊어 myogenic regulatory factors (MRFs)의 상향 조절에 저항하도록 만든다[18, 51].
edgeR 소프트웨어를 활용한 분석결과는 6개월령에서 특이적으로 발현되는 유전자 1,598개, 9개월령에서 특이적으로 발현되는 유전자 1,125개를 확인하였다. 두 소프트웨어에서 공통적으로 나타난 차등발현유전자군은 6개월령 특이 발현유전자 913개, 9개월령 특이 발현 유전자 233개가 확인되었다(Table 1). 공통적으로 나타난 1,146개의 차등발현유전자군에 대한 발현 양상은 Fig.
6A). 또한, clusterProfiler 소프트웨어를 활용하여 KEGG pathway 분석한 결과 Pyruvate metabolism, Carbon metabolism, Propanoate metabolism 등의 대사회로가 유의함을 확인하였다(Fig. 6B). turquoise 모듈은 8개의 유의한 clueGO BP term을 확인했으며(Fig.
한우 태아 6개월령 및 9개월령의 등심 조직 샘플을 품질관리 및 참조서열 정렬 수행 결과, 총 402,325,883개의 리드 중 약 97.54%가 품질관리과정을 통과하였다. Salmon을 이용한 참조 서열 매핑 과정에서 최종적으로 272,605,173개의 염기서열이 정렬되어 원시 데이터 기준 약 67.

후속연구

Taga 등(2012)[50]은 수정 후 110, 180, 210, 260일령 소(Charolais, Blond d'Aquitaine) 태아의 신장 주위 지방 조직을 채취하여 단백질 발현 분석 결과 DLAT, DLD, MDH1, NDUFS1, SUCLA2 등이 4개 성장단계에 따라 발현이 증가함을 보고하였다. 이러한 연구 결과들을 기반으로 blue 모듈에 구성되어 있는 유전자군이 한우 태아기 6, 9개월령 지방 형성에 관여한다는 가능성을 제시할 수 있다. 특히, 모듈 내 허브 유전자로 선정된 SUCLA2 유전자가 핵심적인 역할을 할 것으로 추정된다.
Du등(2015)[14]이 소에서 상처 부위 재생을 위한 것 외에 순수한 근섬유 생성은 수정 후 약 7개월령에서 중단 되고, 비슷한 시기에 지방 분화가 점차 증가한다는 결과를 얻어, 본 연구결과와 비슷한 양상을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 하지만 근세포의 증식, 분화 과정에서 이 모듈내 유전자들에 미치는 AXIN1의 작용 기작은 명확하지 않으며 AXIN1과 높은 연관성을 보이는 Wnt signaling pathway 대사회로와 근육 세포의 성장, 발달과의 연관성 연구가 추가적으로 진행되어야 할 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	소의 근생성은 어떤 세포 때문에 일어나는가?	따라서 소의 성장에 따른 근육의 성장 및 발달과정을 살펴보는 것은 개량과 사양 연구 분야에 매우 중요하다. 소의 근생성(myogenesis)은 정자와 난자의 수정 후 약 2개월 간의 배아기를 거치면서 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)가 증식, 분화, 발달하여 1차 근섬유(Primary myofibers)를 형성하게 되고, 이후 약 7~8개월까지 2차 근섬유(Secondary myofibers)가 형성되어 최종적으로 근육을 이루게 된다[5, 44]. 이 과정에서 다양한 유전자들(WNT, PAX3, PAX7, GLI, MRFs, MYF5, MYOD 등)이 발현 및 조절되면서 근육 형성에 직 간접적인 영향을 미친다[13].
	특이 발현 유전자군을 분류할 때 사용한 도구는?	차등발현유전자군을 활용하여공발현 유전자 네트워크 분석을 구성하였으며, 유사한 발현 양상을 보이는 유전자들을 그룹화하여 6개월령 특이 발현 유전자군 5개, 9개월령 특이 발현 유전자군 2개의 모듈로 분류했다. 각 모듈은 Gene Ontology (GO) 및 KEGG pathway 분석으로 유의한 기능을 확인하였다. 그 결과, 한우 태아기 6, 9개월령 특이 발현 유전자 네트워크 중, 근육과 지방생성 대사회로와 관련된 2개의 모듈에 대해 네트워크 내에 허브 유전자를 선정할 수 있었다.
	콜라겐이란?	Peptidyl-lysine hydroxylation과 peptidyl-proline modification 중, peptidyl-proline hydroxylation는 콜라겐(collagen) 생합성 과정과 관련되어 있다고 알려져 있다[36]. 콜라겐은 근육과 뼈를 이어주는 연결 조직인 건(tendon)의 핵심적인 구성원이며, 근육의 발달 과정에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다[4, 21]. 이 대사회로의 모듈내 참여 유전자는 matrix metallopeptidase 14 (MMP14), prolyl 3-hydroxylase 3 (P3H3), prolyl 3-hydroxylase family member 4 (inactive)(P3H4), procollagen-lysine,2-oxoglutarate 5-dioxygenase 3(PLOD3), FKBP prolyl isomerase 10 (FKBP10)이었으며, 이 모듈내 연결 정도가 가장 높은 유전자는 BAF chromatin remodeling complex subunit BCL7C (BCL7C)로(Supplementary 2), 염색질 재구성에 관여하는 복합체의 구성원에 해당된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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