[논문]쌍별 귀뚜라미의 소화기관에서 기아에 의한 소화효소 유전자의 발현

이누리; 이은령; 권기상; 권오유

doi:10.5352/jls.2020.30.1.82

쌍별 귀뚜라미의 소화기관에서 기아에 의한 소화효소 유전자의 발현
Expression of Digestive Enzyme Genes in the Digestive Tract of the Two-spotted Cricket During Starvation 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.30 no.1, 2020년, pp.82 - 87

이누리 (충남대학교 의과대학 해부학교실) , 이은령 (경운대학교 간호보건대학 임상병리학과) , 권기상 (충남대학교 의과대학 해부학교실) , 권오유 (충남대학교 의과대학 해부학교실)

초록
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쌍별 귀뚜라미(G. bimaculatus)가 식량공급이 제한적이거나 starvation상태를 어떻게 극복하는지를 알기 위하여 소화기관(전장, 중장, 후장)에서 소화작용의 가장 중요한 3대 효소인 amylase, trypsin, lipase의 유전자발현을 조사하였다. G. bimaculatus의 전장에서는 amylase, trypsin, lipase 유전자, 중장은 amylase 유전자, 후장은 amylase, trypsin 유전자의 발현이 먹이 의존적이지만, 중장의 trypsin, lipase 유전자와 후장의 lipase 유전자는 먹이 비의존적인 발현으로 항상 일정한 상태를 유지한다. 이 결과는 곤충이 starvation과 같은 외부환경에 적응 및 생존하는지를 관련 유전자들의 발현수준에서 접근할 수 있는 중요한 실마리를 제공할 것이다.

Abstract ▼ AI-Helper

The gene expression of amylase, trypsin, and lipase in the digestive organs of the two-spotted cricket (Gryllus bimaculatus) was tested to understand how it overcomes starvation. Amylase gene expression in the foregut was reduced by digesting no food until starvation-3 days. Although that expression persisted to starvation-6 days, it returned to normal at refeeding-2 days. The expression of trypsin peaked at around 8 times as starvation started and at around 4 times at starvation-3 days. After refeeding, trypsin expression rose up to 14 times and then fell back to normal as feeding continued. Lipase gene expression remained elevated at 1.5-2 times when starvation started and returned to normal at refeeding-2 days. In the midgut, amylase expression decreased until starvation-3 days, increasing to about 2 times at starvation-6 days; it did not rise again by refeeding. Trypsin was constantly expressed regardless of starvation and refeeding, while lipase expression was reduced by 0.6-0.7 times by starvation and refeeding. Amylase gene expression in the hindgut was 0.2-0.3 times lower than starvation-6 days, and it increased by 0.5 times on refeeding-1 day and more than 1.5 times on refeeding-3 days. The gene expression of trypsin was almost identical to amylase.

주제어

표/그림 (3)

그림 Fig. 1. Gene expression of amylase (black), trypsin (light gray) and lipase (dark gray) from digestive tract of male G. bimaculatus.
그림 Fig. 2. Gene expression of amylase (black), trypsin (light gray) and lipase (dark gray) from digestive tract of male G. bimaculatus.
그림 Fig. 3. Gene expression of amylase, trypsin and lipase by starvation (S) and refeeding (R) in the digestive tract of male G. bimaculatus.

AI 본문요약
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문제 정의

본 논문에 사용된 귀뚜라미(Gryllus bimaculatus)는 잡식성이며 셀룰로오스 함량이 높은 풀뿌리, 단백질이 많이 포함된 버섯류 및 곤충(죽거나 살아있는)을 먹이로 한다[24]. 귀뚜라미가 식량이 부족한 기아상태를 어떻게 극복하는지를 알기 위하여 소화기관(전장, 중장, 후장)에서 amylase, trypsin, lipase의 유전자발현 양상을 연구하였다.
Spodoptera littoralis (Boisduval)에서 amylase활성도가 전장＜후장＜중장 순으로 높았다[12], 그러나 American cockroach, Periplaneta americana의 amylase활성도는 후장＜중장＜전장 순이 높았다[16]. 본 연구는 G. bimaculatus 소화기계에서 amylase유전자 발현을 측정하였다. amylase유전자 발현은 전장에 비하여 중장은 약 1.

제안 방법

즉 곤충의 먹이에는 지방의 함량이 단수화물, 단백질에 비하여 미미하여 fat body, salivary gland중심으로 연구가 이루지고 있다. G. bimaculatus 소화기계에서 lipase유전자 발현을 측정하였다. lipase유전자 발현은 전장에 비하여 중장은 약 2.
곤충의 trypsin 연구 역시 amylase와 동일하게 식물의 trypsin inhibitor와 곤충 trypsin에 저항성 작물육종등 해충방제에 중점을 두고 개발되고 있다. G. bimaculatus 소화기계에서 trypsin유전자 발현을 측정하였다. trypsin유전자 발현은 전장에 비하여 중장은 약 10배, 후장은 약 4배 높은 발현을 보였다.
Lipase활성도는 중장이 가장 강하고 후장에서 약하게 확인되며 전장에서는 거의 확인되지 않을 정도이다. G. bimaculatus 소화기관(전장, 중장, 후장)에서 각각의 amylase, trypsin, lipase 유전자발현을 조사하였다(Fig. 2). 전장에서는 amylase 유전자발현을 control로 하였을 때에, trypsin유전자발현은 아주 미미한 수준이지만 lipase 유전자발현은 현저하게 amylase 유전자발현보다 강하지는 않지만 가장 강한 발현을 보였다.
Total mRNA는 SuperscriptII™ First Strand Kit (Invitrogen Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 역전사 하였다. RT-PCR은 총 30 cycles 시행되었다. 각 단계의 조건은 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 60초이다.
Starvation에 의한 amylase, trypsin, lipase의 유전자발현을 조사하였다(Fig. 3). 전장에서 amylase 유전자발현은 starvation 3일째에 1/2수준으로 내려가지만, 6일 starvation에서 3배 정도 높은 발현을 보였다.
귀뚜라미 해부를 위해서 CO₂ 가스에 노출시켜 마취시켰다. 각 조직은 해부 현미경(Nikon Eclipse E600)으로 관찰하며 절단하였다[10].
각각의 소화효소(amylase, trypsin, lipase) 유전자가 전장, 중장, 후장에서 상대적 발현을 상호 비교하였다(Fig. 1). 많은 곤충은 polysaccharide가 풍부한 음식을 먹고 음식에서 starch을 분해하기 위해 소화 amylase가 필요하다.
6일 동안 기아상태에서도 귀뚜라미에게 물은 계속 공급되었다. 귀뚜라미 해부를 위해서 CO₂ 가스에 노출시켜 마취시켰다. 각 조직은 해부 현미경(Nikon Eclipse E600)으로 관찰하며 절단하였다[10].

대상 데이터

성충은 투명한 플라스틱 통(직경, 9 cm; 높이, 10 cm)에서 10시간/14시간의 명/암 광주기에서 70%의 습도로 28-30℃에서 사육하였다. 귀뚜라미에 물은 무제한으로 공급되었으며 사료는 30%casein (protein), 30% dextrose (carbohydrate), 40% cellulose and one drop of oil (lipid)를 공급하였다. 실험에는 동일하게 자란 수컷만 사용되었다.
본 연구에 사용 된 쌍별 귀뚜라미(G. bimaculatus)의 5령 유충은 한국 농촌진흥청(전주, 한국)에서 분양 받았다. 성충은 투명한 플라스틱 통(직경, 9 cm; 높이, 10 cm)에서 10시간/14시간의 명/암 광주기에서 70%의 습도로 28-30℃에서 사육하였다.
실험에는 동일하게 자란 수컷만 사용되었다. 서로 잡아먹는 것을 피하기 위하여 플라스틱 통 1개에 한 마리의 수컷 귀뚜라미를 사육하였다. 6일 동안 기아상태에서도 귀뚜라미에게 물은 계속 공급되었다.
귀뚜라미에 물은 무제한으로 공급되었으며 사료는 30%casein (protein), 30% dextrose (carbohydrate), 40% cellulose and one drop of oil (lipid)를 공급하였다. 실험에는 동일하게 자란 수컷만 사용되었다. 서로 잡아먹는 것을 피하기 위하여 플라스틱 통 1개에 한 마리의 수컷 귀뚜라미를 사육하였다.

데이터처리

사용된 primer는 다음과 같다; cActin-F (5'-ATCACTGCCCTTGCTCCTTC-3'), & cActin-R (5'-TTCCTGTGGACAATGGATGG3'), cTryp220-F (5’-GCCTGCAAGAAGTACTACCC-3’) & cTryp220-R (5’-TCTGGGCGATCCAGTCA-3’), cAmyl314-F(5’-ATGTTGTCGTGGCCCTATG-3’) & cAmyl314-R (5’-GTCTGCTTCAGGTCAGTGTT-3’), cLipase3-F (5’-CGTCGCCACATCAAGTACAA-3’) & cLipase3-R (5’-CGAACATGGCCCGAATCTT-3’). 여러 그룹 간의 통계적 유의성: 일원 분산 분석(ANOVA) 테스트. GraphPad Prism 6 소프트웨어(GraphPadSoftware Inc.

성능/효과

bimaculatus 소화기계에서 lipase유전자 발현을 측정하였다. lipase유전자 발현은 전장에 비하여 중장은 약 2.5배, 후장은 약 2배 높은 발현을 보였다.
bimaculatus 소화기계에서 trypsin유전자 발현을 측정하였다. trypsin유전자 발현은 전장에 비하여 중장은 약 10배, 후장은 약 4배 높은 발현을 보였다.
결과를 요약하면, 곤충 소화기관의 amylase, trypsin, lipase 유전자발현과 분비는 다른 양상으로 행동한다. 즉, G.
결과를 요약하면, 곤충 소화기관의 amylase, trypsin, lipase 유전자발현과 분비는 다른 양상으로 행동한다. 즉, G. bimaculatus의 전장은 amylase, trypsin, lipase 유전자, 중장은 amylase 유전자, 후장은 amylase, trypsin 유전자발현이 먹이 의존적으로 발현하지만, 중장의 trypsin, lipase 유전자와 후장의 lipase 유전자는 먹이 의존적인 발현이 아니고 항상 일정한 유전자발현 상태를 유지한다. 이 결과는 곤충이 어떻게 starvation과 같은 극한의 먹이제한을 극복하는지를 유전자발현수준의 연구에서 중요한 실마리를 제공할 것이다.
그러나 lipase 유전자발현은 먹이공급과 상관없이 항상 변함이 없다. 즉, 후장에서 amylase와 trypsin 유전자발현은 먹이 의존적으로 발현 변화하지만 lipase 유전자발현은 먹이공급과 상관없이 항상 동일한 수준을 유지한다.

후속연구

bimaculatus의 전장은 amylase, trypsin, lipase 유전자, 중장은 amylase 유전자, 후장은 amylase, trypsin 유전자발현이 먹이 의존적으로 발현하지만, 중장의 trypsin, lipase 유전자와 후장의 lipase 유전자는 먹이 의존적인 발현이 아니고 항상 일정한 유전자발현 상태를 유지한다. 이 결과는 곤충이 어떻게 starvation과 같은 극한의 먹이제한을 극복하는지를 유전자발현수준의 연구에서 중요한 실마리를 제공할 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Trypsin은 무엇인가?	Trypsin은 chymotrypsin family의 serine endopeptidase로서 음식소화, 면역방어 및 zymogen 활성화를 포함하여 곤충에서 다양한 중요한 역할을 한다. Trypsin 유전자발현은 Aedesaegypti의 instar의 모든 발생과정에 지속된다[34], 그러나 Trypsin 유전자발현의 정확한 메커니즘은 완전하게 알지 못하고 있다[15].
	배 발생기원에 따라 곤충의 소화기계는 어떻게 구별되는가?	소화 효소합성, 분비 및 소화 메커니즘은 기본적으로 모든 동물과 유사하다. 곤충 소화기계는 배 발생기원(embryological origin)에 따라서 전장(foregut), 중장(midgut), 후장(hindgut)으로 구별된다. 전장과 후장은 외배엽(ectoderm)유래로서 각질(cuticle) 층을 가지고 있어 탈피(moulting)과정을 거친다.
	곤충이 환경 변화로 인한 음식 부족을 극복하는 방법은?	곤충이 장기간 충분한 음식을 섭취하지 않으면 성장과 번식이 크게 줄어든다. 그러나 곤충은 스트레스 방지 상태로 대응하여 새로운 식품자원의 발견 및 이동, 신진 대사를 제한하는 활동 감소, 신체의 항상성을 유지하기 위한 지질 침착 증가와 같은 불리한 외부음식 부족을 극복 할 수 있다[11, 36]. 기아에 직면하면서 곤충반응에는 혈당, 트레할로스(trehalose) 및 트리글리세리드(triglyceride)수치와 같은 여러 가지 생리학적 변화도 포함된다[13].

참고문헌 (36)

Barillas-Mury, C., Graf, R., Hagedorn, H. H. and Wells, M. A. 1991. cDNA and deduced amino acid sequence of a blood meal-induced trypsin from the mosquito, Aedes aegypti. Insect Biochem. 21, 825-831.

상세보기
Bezerra, C. A., Macedo, L. L., Amorim, T. M., Santos, V. O., Fragoso, R. R., Lucena, W. A., Meneguim, A. M., Valencia-Jimenez, A., Engler, G., Silva, M. C., Albuquerque, E. V. and Grossi-de-Sa, M. F. 2014. Molecular cloning and characterization of an ${\alpha}$ -amylase cDNA highly expressed in major feeding stages of the coffee berry borer, Hypothenemus hampei. Gene 553, 7-16.

상세보기
Chapman, R. F. 1998. Alimentary canal, digestion and absorption. In: Chapman RF, editor. The insects, structure and function. 4th edition. U.K.: Cambridge University Press. pp38-58.
Da Lage, J. L., Maisonhaute, C., Maczkowiak, F. and Cariou, M. L. 2003. A nested alpha-amylase gene in Drosophila ananassae. J. Mol. Evol. 57, 355-362.

상세보기
Ejiofor, A. O. 2016. Insect Biotechnology. In: Raman, C., Goldsmith, M., Agunbiade, T. (eds) Short views on insect genomics and proteomics. entomology in focus, vol 4. Springer.
Grossman, G. L., Campos, Y., Severson, D. W. and James, A. A. 1997. Evidence for two distinct members of the amylase gene family in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 769-781.

상세보기
Horne, I., Haritos, V. S. and Oakeshott, J. G. 2009. Comparative and functional genomics of lipases in holometabolous insects. Insect Biochem. Mol. Biol. 39, 547-567.

상세보기
Kalhok, S. E., Tabak, L. M., Prosser, D. E., Brook, W., Downe, A. E. R. and White, B. N. 1993. Isolation, sequencing and characterization of two cDNA clones coding for trypsin-like enzymes from the midgut of Aedes aegypti. Insect Mol. Biol. 2, 71-79.

상세보기
Klowden, M. J. 2007. Physiological systems in insects. 2nd ed. New York, NY: Elsevier. p. 688.
Kwon, K., Yoo, B. K., Ko, Y., Choi, J. Y., Kwon, O. Y. and Kim, S. W. 2018. Effect of starvation on expression of troponin complex genes and ER stress associated genes in skeletal muscles. Biomed. Res. 29, 2368-2372.
Lorenz, M. W. and Gade, G. 2009. Hormonal regulation of energy metabolism in insects as a driving force for performance. Integr. Comp. Biol. 49, 380-392.

상세보기
Lwalaba, D., Hoffmann, K. H. and Woodring, J. 2010. Control of the release of digestive enzymes in the larvae of the fall armyworm, Spodoptera frugiperda. Arch. Insect Biochem. Physiol. 73, 14-29.

상세보기
McCue, M. D., Terblanche, J. S. and Benoit, J. B. 2017. Learning to starve: Impacts of food limitation beyond the stress period. J. Exp. Biol. 220, 4330-4338.

상세보기
Ngernyuang, N., Kobayashi, I., Promboon, A., Ratanapo, S., Tamura, T. and Ngernsiri, L. 2011. Cloning and expression analysis of the Bombyx mori ${\alpha}$ -amylase gene (Amy) from the indigenous Thai silkworm strain, Nanglai. J. Insect Sci. 11, 38.
Noriega, F. G. and Wells, M. A. 1999. A molecular view of trypsin synthesis in the midgut of Aedes aegypti. J. Insect Physiol. 45, 613-620.

상세보기
Oyebanji, O., Soyelu, O., Bamigbade, A. and Okonji, R. 2014. Distribution of digestive enzymes in the gut of American cockroach, Periplaneta americana (L.). Int. J. Sci. Res. Pub. 4, 1-5.
Peterson, A. M., Barillas-Mury, C. V. and Wells, M. A. 1994. Sequence of three cDNAs encoding an alkaline midgut trypsin from Manduca sexta. Insect Biochem. Mol. Biol. 24, 463-471.

상세보기
Rosetto, M., Belardinelli, M., Fausto, A. M., Marchini, D., Bongiorno, G., Maroli, M. and Mazzini, M. 2003. A mammalian-like lipase gene is expressed in the female reproductive accessory glands of the sand fly Phlebotomus papatasi (Diptera, Psychodidae). Insect Mol. Biol. 12, 501-508.

상세보기
Sbivastava, P. N. 1961. Studies on the physiology of digestion in the last instar larva of the rice moth (Corcyra cephalonica Stainton). Beitr. Entomol. 11, 11-15.
Shukle, R. H., Mittapalli, O., Morton, P. K. and Chen, M. S. 2009. Characterization and expression analysis of a gene encoding a secreted lipase-like protein expressed in the salivary glands of the larval Hessian fly, Mayetiola destructor (Say). J. Insect Physiol. 55, 104-111.
Terra, W. R. 1988. Physiology and biochemistry of insect digestion: an evolutionary perspective. Braz. J. Med. Biol. Res. 21, 675-734.

상세보기
Terra, W. R. 1990. Evolution of digestive systems of insects. Annu. Rev. Entomol. 35, 181-200.

상세보기
Terra, W. R. 2011. The origin and functions of the insect peritrophic membrane and peritrophic gel. Arch. Insect Biochem. Physiol. 47, 47-61.
Terra, W. R. and Ferreira, C. 1994. Insect digestive enzymes: Properties, compartmentalization and function. Comp. Biochem. Physiol. Part B. Biochem. Mol. Biol. 109, 1-62.

상세보기
Terra, W. R. and Ferreira, C. 2005. Biochemistry of digestion. In: Gilbert, L. I., Iatrou, K., Gill, S. S. editors. Comprehensive molecular insect science, vol. 3. San Diego, California, USA: Elsevier. pp171-224.
Terra, W. R. and Ferreira, C. 2009. Digestive system. In: Resh V. H., Carde R. T. editors. Encyclopedia of Insects, 2nd edition. San Diego: Academic Press, pp273-281.
Valencia-Jiminez, A., Bustillo, A. E., Ossa, G. A. and Chrispeels, M. J. 2000. ${\alpha}$ -Amylases of the coffee berry borer (Hypothenemus hampei) and their inhibition by two plant amylase inhibitors. Insect Biochem. Mol. Biol. 30, 207-213.

상세보기
Verhagen, L. A., Luijendijk, M. C., Korte-Bouws, G. A., Korte, S. M. and Adan, R. A. 2009. Dopamine and serotonin release in the nucleus accumbens during starvation-induced hyperactivity. Eur. Neuropsychopharmacol. 19, 309-316.

상세보기
Wang, S., Young, F. and Hicky, D. A. 1995. Genomic organization and expression of a trypsin gene from the spruce budworm, Choristoneura fumiferana. Insect Biochem. Mol. Biol. 25, 899-908.

상세보기
Wilhite, S. E., Elden, T. C., Brzin, J. and Smigocki, A. C. 2000. Inhibition of cysteine and aspartyl proteinases in the alfalfa weevil midgut with biochemical and plant-derived proteinase inhibitors. Insect Biochem. Mol. Biol. 30, 1181-1188.

상세보기
Woodring, J. 2017. The flow and fate of digestive enzymes in the field cricket, Gryllus bimaculatus. Arch. Insect Biochem. Physiol. 95, 3.
Woodring, J. and Weidlich, S. 2016. The secretion of digestive enzymes and caecal size are determined by dietary protein in the cricket Gryllus bimaculatus. Arch. Insect Biochem. Physiol. 93, 121-128.

상세보기
Yan, X. H., De Bondt, H. L., Powell, C. C., Bullock, R. C. and Borovsky, D. 1999. Sequencing and characterization of the citrus weevil, Diaprepes abbreviatus, trypsin cDNA. Effect of Aedes trypsin modulating oostatic factor on trypsin biosynthesis. Eur. J. Biochem. 262, 627-636.

상세보기
Yang, Y. J. and Davies, D. M. 1971. Trypsin and chymotrypsin during metamorphosis in Aedes aegypti and properties of the chymotrypsin. J. Insect Physiol. 17, 117-131.

상세보기
Yu, Y., Huang, R., Ye, J., Zhang, V., Wu, C., Cheng, G., Jia, J. and Wang, L. 2016. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife 5, E15693.

상세보기
Zhang, D. W., Xiao, Z. J., Zeng, B. P., Li, K. and Tang, Y. L. 2019. Insect behavior and physiological adaptation mechanisms under starvation stress. Front. Physiol. 10, 163.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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