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제안 방법
- α-MSH는 생체 내 멜라닌의 생성을 촉진하는 호르몬으로 본 실험에서는 α-MSH를 세포에 처리하여 과색소형성 유도 시 저령에탄올추출물의 효과를 조사하였다.
- 1% DMSO가 첨가된 1 N NaOH 용액에 90℃에서 1시간동안 멜라닌을 용해시키고, 96 well plate에 60 μl 씩 넣고 475 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 72시간 배양 후 세포의 수지상돌기의 변화를 위상차도립현미경(Leica, Germany)을 이용하여 관찰하였다.
- PBS로 2회 세척 하고 세포를 모아 eptube로 옮긴 후 15,000 rpm에서 20분간 원심 분리하여 상층액을 제거하고 관찰하였다.
- 세포의 형태적 관찰은 6 cm 배양용기에 1.5×104개의 세포를 분주하여 부착시킨 뒤 시료 처리 1시간 후에 α-MSH (100 μM)를 처리하였다.
- 10 cm 배양용기에 6×104개의 세포를 분주하고 24시간 부착시킨 뒤 시료를 농도별로 처리하였다.
- 10 cm 배양용기에 2.5×104개의 세포를 심고 24시간동안 부착 후 시료를 농도별로 처리 하고, 1시간 후 α-MSH (10 μM)를 처리하여 72시간 배양 하였다.
- 1% tween-20)로 blocking 후 1차 antibody를 blocking 버퍼에 희석하여 4℃에서 overnight 하였다. 2차 antibody는 anti-rabbit IgG, anti-mouse, anti-goat를 1:5000의 비율로 희석하여 반응시킨 다음 TBST로 세척고 ECL (Millipore, USA) 용액으로 발색 후 chemiDoc (Bio-Rad, USA)을 이용해 촬영하였다.
- Mushroom tyrosinase는 버섯이 생물/비생물적 요인으로부터 보호하기 위해 멜라닌을 생성하는데 이를 이용하여 멜라닌 생성을 측정하는 방법 중 하나로 저령 에탄올추출물이 mushroom tyrosinase의 활성에 미치는 영향을 관찰하였다.
- 1 M PMSF)로 세포를 용해하여 4℃에서 15,000 rpm으로 15분간 원심 분리(Hanil, Korea)하여 얻은 상층액을 tyrosinase 활성 측정용액으로 사용하였다. Protein assay 용액으로 595 nm 에서 흡광도를 측정 후, 동량의 단백질 양을 계산하였다. 동일양의 단백질과 0.
- 동일양의 단백질과 0.1 M SPB (pH 6.8)의 총량이 150 μl가 되도록 고 0.1% L-dopa를 50 μl씩 분주하여 혼합한 후 ELISA reader로 475 nm의 파장으로 30분에 흡광도의 변화를 측정하였다.
- 또한 α-MSH로 증가된 멜라닌이 저령추출물 50, 100 μg/ml에 의해 감소함을 육안적으로 관찰하였다(Fig. 5E).
- 멜라닌 정량은 Hosei 등 21) 의 방법을 변형해 사용하였다.
- 세포 생존율 측정은 세포의 대사 과정에서 미토콘드리아의 탈수소 효소와 MTT tetrazolium이 반응하면 MTT formazan이 형성되고 이를 다시 DMSO로 재수화시키면 보라색으로 나타나는 비색법으로 측정하였다. 저령 에탄올추출물을 농도별로 처리하고 24시간 후에 평가하였다.
- 세포 생존율 측정은 세포의 대사 과정에서 미토콘드리아의 탈수소 효소와 MTT tetrazolium이 반응하면 MTT formazan이 형성되고 이를 다시 DMSO로 재수화시키면 보라색으로 나타나는 비색법으로 측정하였다. 저령 에탄올추출물을 농도별로 처리하고 24시간 후에 평가하였다. 실험결과 시료 25, 50, 100 μg/ml의 농도에서 대조군의 94.
- 저령 에탄올추출물이 tyrosinase를 안정화시키고 활성을 조절하는 TRP-1과 멜라닌 생성에 관여하는 TRP-2의 발현을 확인하기 위해 시료를 농도별로 처리하고 α-MSH를 처리하여 Western blot을 시행했다.
- 저령 에탄올추출물이 세포 내 tyrosinase 활성에 미치는 영향을 확인하기 위해 추출물을 농도별로 48시간 처리하여 tyrosinase 활성 및 멜라닌 합성에 미치는 영향을 평가하였다.
- DPPH는 항산화 활성이 있는 물질과 반응하게 되면 free radical이 소거되어 탈색되는 점을 이용해서 항산화 활성을 측정하는데 널리 사용되고 있는 방법이다. 플라보노이드 등 환원력이 높은 물질들이 DPPH 라디칼을 소거능이 높다고 보고되어 저령 에탄올추출물의 항산화능을 DPPH를 이용해 측정하였다. 실험결과 시료 25, 50, 100 μg/ml 농도에서 71.
- 항산화활성은 Blosis방법을 19) 이용한 1,1-dipheny1-2-picry1-hydrazyl (DPPH; Sigma, USA)를 사용하여 라디칼 소거능을 확인하였다.
대상 데이터
- 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양받은 B16F10 melanoma 세포를 5% fetal bovine serum (FBS; Welgene, Korea)가 첨가된 dulbecco’s modified eagle medium (DMEM; Welgene, Korea) 을 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 이상 반복으로 평균갑을 구하여 평균±표준편차로 표시하였다.
- 본 연구의 실험 결과는 sigmaplot 10.0 (San Jose, CA, USA)을 이용하여 student’s t-test를 이용하여 p-value를 구하였으며, p〈0.05인 경우 *(#)로 표기하였고, p〈0.01인 경우 **(##)로 표기하여 유의성을 나타내였다.
이론/모형
- 세포내 tyrosinase 활성은 Matinez-Esparza 등 20) 의 방법으로측정하였다. 10 cm 배양용기에 5×104 개의 세포를 분주하여 24시간 동안 세포를 부착시켰다.
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