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문제 정의
- Cisplatin 등 백금을 기반으로 하는 신호전달은 암세포의 종류에 따라, 치료 용량에 따라 다중 신호경로를 나타내므로 신호 경로가 분명하지 않다. 따라서 본 연구에서는 cisplatin으로 세포 사멸을 유도한 SKOV3 세포에서 신호전달 과정 중 나타나는 Akt, ERK1/2, MAPK 신호전달 단백질의 변화를 조사하였다. 세포사멸에 관련한 신호 전달 단백질들은 세포 생존에 결정적인 역할을 하는 Akt 활성화 억제와 p38 활성화 조절이 세포사멸 유도와 관련되어 있음을 확인하였다.
- 특히 cisplatin을 처리한 다양한 세포에서의 ERK1/2 활성 변화는 세포사멸 또는 세포 생존에 대한 논란을 가진다[14, 15]. 본 연구에서는 cisplatin으로 세포사멸을 유도한 SKOV3 세포에서 세포사멸 과정 중 나타나는 Akt와 MAPK 신호 단백질의 작용을 규명하고자 하였다. 신호 단백질 발현 변화를 통해 이들의 역할을 규명하기 위해서 cisplatin이 SKOV3 세포에 미치는 세포사멸에 초점을 두고 시행하였다.
- Cisplatin이 세포에 작용하는 신호전달 기전은 분명하지 않아 더 많은 연구가 필요해 보인다. 이에 본 연구는 cisplatin을 난소암 세포(SKOV3) 에 처리하여 세포사멸 유도 과정에서 나타나는 신호 단백질의 역할을 밝히고자 하였다. 결과는 cisplatin으로 처리한 난소암 세포에서 TUNEL assay와 유세포 분석을 통해 대조군과 비교하여 세포 사멸수가 증가하였다.
제안 방법
- Effects of Cisplatin on viability in SKOV3 cells. Cells were seeded in 96-well plates and treated with 5 MM and 10 MM concentrations of cisplatin, and cell viability was determined with the MTT assay. The values are calculated relative to the control group (0 MM cisplatin).
- Cisplatin 처리에 따른 SKOV3 세포의 초기 세포 사멸을 관찰하기 위하여 제조사(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)의 설명에 따라 Annexin V FITC로 염색하였다. 대략 1×105 개의 세포를 수확하여 pH 7.
- Caspase-3는 세포 사멸의 주요 단계에서 나타나는 단백질이다. Cisplatin 처리한 SKOV3에서의 세포 사멸을 알아보기 위해 western blot으로 cleved PARP, cleved caspase-3 및 Bcl-2 단백질 수준을 측정하였다. Cleved PARP과 cleved caspase-3의 수준은 유의하게 증가하였으나 반대로 Bcl-2 수준은 유의하게 감소하였다(Figure 4).
- Cisplatin으로 세포 사멸을 유도한 신호전달 과정에는 어떠한 신호 전달 단백질들의 활성이 변화하여 SKOV3 세포에 영향을 미치는지 이들 활성 단백질에 대한 항체를 이용하여 western blot으로 확인하였다. Akt의 활성화는 세포 생존에 결정적인 역할을 하는 단백질로 p-Akt와 p-ERK 단백질 발현은 24시간에서 유의적으로 감소하였으나 p-Akt는 48시간에서 변화가 없었다(Figure 5).
- Cisplatin이 SKOV3 세포의 생존에 미치는 영향을 조사하기 위해 5 μM과 10 μM 농도로 0, 24 및 48시간 처리한 세포를 MTT assay 방법을 통해 세포 생존율을 결정하였다.
- TUNEL assay는 세포 사멸의 신호전달경로[16] 과정 중에 나타나는 세포의 DNA 손상을 현미경으로 관찰할 수 있는 분석 방법이다. Cisplatin이 세포 사멸을 통해 항암 효과를 나타내는지의 여부를 평가하기 위해 48시간 동안 cisplatin 10 MM로 처리된 SKOV3의 사멸 세포 체를 TUNEL assay로 관찰하였고 세포 사멸률을 24시간과 48시간에 확인하였다. Cisplatin으로 처리한 SKOV3 세포의 사멸 세포 수는 대조군과 비교하여 시간이 증가할수록 유의하게 증가하였다(Figure 3).
- In Situ Cell Death Detection Kit (Roche, Penzberg, Germany)를 이용한 terminal deoxynucleotidyl transferase mediated digoxigenin-dUTP-biotin nick-end labeling (TUNEL) assay를 통해 SKOV3 세포의 세포 사멸체을 입증함으로 세포 사멸을 확인하였다[16]. 세포는 4% 포름알데히드로 고정시키고 40분 동안 실온에서 배양하였다.
- 대조군과 비교하여 백분율 수치를 계산하고 IC50 값을 결정하였다. SKOV3 세포에 IC50에 해당하는 cisplatin을 처리하여 24시간 또는 48시간 동안 배양하였다.
- SKOV3 세포에 cisplatin을 처리한 후 단백질 저해제 칵테일이 첨가된 radioimmuno- precipitation buffer (50 mM Tris; pH 8.0; Cell Signaling, USA)에 용해하여 상층액의 단백질 양을 BCA Protein Assay kit (Thermo Fisher Scientific, Inc.)로 측정하였다. 단백질을 10% SDS-PAGE에 전기영동 한 후 nitrocellulose 막으로 전사하였다.
- SKOV3 세포에 cisplatin을 48시간 동안 처리한 결과 50%의 세포 증식 억제를 보이는 농도는 10 μM로 나타났다(Figure 1). cisplatin에 의해 유도 관찰된 세포 사멸이 세포 sub-G1 주기에서 나타나는 초기 세포사멸과 관련이 있는지 조사하기 위해 유세포 분석을 수행하였다(Figure 2). SKOV3 세포에 10 μM의 cisplatin을 48시간 처리한 결과, 처리하지 않은 대조군은 Annexcin-VFITC positive 세포가 0.
- )로 측정하였다. 단백질을 10% SDS-PAGE에 전기영동 한 후 nitrocellulose 막으로 전사하였다. 5% skim milk로 2시간 동안 실온에서 blocking 한 후 3회 세척하였다.
- 상층액을 제거하고 DMSO 100 ML/well 넣어 15분간 반응 후 microplate reader로 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군과 비교하여 백분율 수치를 계산하고 IC50 값을 결정하였다. SKOV3 세포에 IC50에 해당하는 cisplatin을 처리하여 24시간 또는 48시간 동안 배양하였다.
- 2% Triton X-100 용액에 5분 동안 투과시킨 후 50 ML의 TUNEL reaction mixture 혼합물을 chamber slide에 첨가하고 37°C, 5% CO2 암실 조건 하에서 1시간 방치하였다. 마지막으로, 상층액을 제거하고 PBS로 5분 동안 2번 세척한 후 confocal microscope Model LSM 510 (Carl Zeiss, Jen, Germany)으로 관찰하였다.
- ) 4°C에서 24시간 반응시키고 tris buffered saline with tween 20 (TBST)로 3번 세척 후, 2차 항체 horseradish peroxidase-conjugated anti-IgG (Invitrogen)로 실온에서 2시간 반응하였다. 세척 후 Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce, IL, USA)을 이용하여 단백질 밴드를 확인하였다.
- 신호 단백질 발현 변화를 통해 이들의 역할을 규명하기 위해서 cisplatin이 SKOV3 세포에 미치는 세포사멸에 초점을 두고 시행하였다. 세포 사멸체 확인과 초기 세포 사멸율 분석하고 caspase-3 및 Bcl-2의 발현을 고려하여 Akt, ERK1/2, p38 그리고 JNK의 역할을 결정하였다.
- 이후 배양 세포에 190 ML Annexin-V binding buffer로 희석하여 세포가 최종 농도 1 Mg/mL PI (propidium iodide)가 되도록 염색한 후 Becton-Dickinson FACScan과 Cell Quest software (Becton-Dickinson, Mountain View, CA, USA)를 사용하여 분석하였다. 세포주기 분석은 염색한 세포로부터 DNA양을 측정하여 결정하였다.
- 본 연구에서는 cisplatin으로 세포사멸을 유도한 SKOV3 세포에서 세포사멸 과정 중 나타나는 Akt와 MAPK 신호 단백질의 작용을 규명하고자 하였다. 신호 단백질 발현 변화를 통해 이들의 역할을 규명하기 위해서 cisplatin이 SKOV3 세포에 미치는 세포사멸에 초점을 두고 시행하였다. 세포 사멸체 확인과 초기 세포 사멸율 분석하고 caspase-3 및 Bcl-2의 발현을 고려하여 Akt, ERK1/2, p38 그리고 JNK의 역할을 결정하였다.
- 이어서 PBS에서 여러번 세척하여 얼음 위에서 0.2% Triton X-100 용액에 5분 동안 투과시킨 후 50 ML의 TUNEL reaction mixture 혼합물을 chamber slide에 첨가하고 37°C, 5% CO2 암실 조건 하에서 1시간 방치하였다.
- 4)에 현탁시키고 5 ML Annexin-V-FITC를 첨가하여 15분 동안 실온에서 배양하고 2 mL Annexin-V binding buffer를 첨가하여 5분간 원심분리 한 후 상층액을 제거하였다. 이후 배양 세포에 190 ML Annexin-V binding buffer로 희석하여 세포가 최종 농도 1 Mg/mL PI (propidium iodide)가 되도록 염색한 후 Becton-Dickinson FACScan과 Cell Quest software (Becton-Dickinson, Mountain View, CA, USA)를 사용하여 분석하였다. 세포주기 분석은 염색한 세포로부터 DNA양을 측정하여 결정하였다.
대상 데이터
- Cisplatin (cis-diamminedichloridoplatinum (II), CDDP) 은 Sigma- Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. p-AKT (ser 473), p-ERK1/2, p-JNK, p-P38, cleaved-PARP cleaved-caspase-3, Bcl-2와 B-actin에 대한 1차 항체는 모두 Cell Signaling Technology (Danvers, MA)에서 구입하여 1:1,000 또는 1:5,000으로 희석하여 사용하였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. p-AKT (ser 473), p-ERK1/2, p-JNK, p-P38, cleaved-PARP cleaved-caspase-3, Bcl-2와 B-actin에 대한 1차 항체는 모두 Cell Signaling Technology (Danvers, MA)에서 구입하여 1:1,000 또는 1:5,000으로 희석하여 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 인간의 난소암 세포(SKOV3) (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA)는 서울 의과대학에서 분양받아 RPMI-1640 배지(Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)에 2 mM L-glutamine (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)과 10% fetal bovine serum (HyClone, Thermo Scientific), 1% penicillin streptomycin (Invitrogen)을 첨가하여 37°C, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
데이터처리
- 두 그룹 간의 평균을 비교할 때는 Student’s t-test를 사용하여 비교하였고 통계적 유의성은 분산분석 (Analysis of Vatiance, ANOVA)을 실시하여 검증하였다.
- 본 연구에서의 모든 실험 결과는 평균(mean value)±표준 편차로 나타내었다.
이론/모형
- Cisplatin induces apoptotic cells in SKOV3 cells. Cells were treated with cisplatin and after treatment, the number of apoptotic cells was determined with the TUNEL assay. Data are presented as the mean±SD and are representative of three independent experiments with similar results.
- 세포 생존율은 3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium (MTT) (Cell Titer 96Ⓡ AQueous Cell Proliferation Assay kit; Promega Corporation, Madison, WI, USA) assay 방법에 따라 수행하였다. 동일한 수의 세포를 96 well plate에서 24시간 배양 후 다양한 농도의 cisplatin을 처리하여 48시간 동안 다시 배양하였다.
성능/효과
- 45% 변화를 보였다. Cisplatin에 의한 세포 사멸의 최종 실행 단백질인 caspase-3의 절편은 처리 시간이 증가함에 따라 증가하였고 PARP의 절편은 두드러지게 증가하는 결과를 보였다. 이는 caspase-3의 활성화에 의해 PARP 절편의 잘림은 세포 사멸의 특징 중 하나이다 [22].
- Cisplatin이 세포 사멸을 통해 항암 효과를 나타내는지의 여부를 평가하기 위해 48시간 동안 cisplatin 10 MM로 처리된 SKOV3의 사멸 세포 체를 TUNEL assay로 관찰하였고 세포 사멸률을 24시간과 48시간에 확인하였다. Cisplatin으로 처리한 SKOV3 세포의 사멸 세포 수는 대조군과 비교하여 시간이 증가할수록 유의하게 증가하였다(Figure 3).
- 거기다가 ERK 활성화에 따른 세포 사멸과 세포 생존에 대한 논란은 여전히 존재한다[34]. HeLa 세포에서 cisplatin 농도와 시간이 증가함에 따라 ERK의 활성은 증가하였고 세포 생존에 기여한다는 보고와는 달리[14] 본 실험은 10 MM 농도로 SKOV3 세포에 24시간과 48시간까지 처리한 결과 ERK 활성은 시간이 증가함에 따라 감소하였다. 세포 사멸을 유도한다는 결과이다.
- SKOV3 세포에 10 μM의 cisplatin을 48시간 처리한 결과, 처리하지 않은 대조군은 Annexcin-VFITC positive 세포가 0.72%을 보였으나 cisplatin을 처리한 경우 9.46%로 증가하는 것을 확인하였다.
- SKOV3 세포에 cisplatin을 48시간 동안 처리한 결과 50%의 세포 증식 억제를 보이는 농도는 10 μM로 나타났다(Figure 1).
- p38과 p-JUN의 활성은 24시간에 증가하는 것으로 나타났으나 48시간 에서 p38의 활성은 감소하였으며 p-JUN의 활성은 일정하 였다.
- 이에 본 연구는 cisplatin을 난소암 세포(SKOV3) 에 처리하여 세포사멸 유도 과정에서 나타나는 신호 단백질의 역할을 밝히고자 하였다. 결과는 cisplatin으로 처리한 난소암 세포에서 TUNEL assay와 유세포 분석을 통해 대조군과 비교하여 세포 사멸수가 증가하였다. 세포 사멸 단계에서 나타나는 PARP 및 caspase-3 활성도 증가하였다.
- p38과 JNK는 DNA 손상이나 다양한 스트레스에 의해 활성화되어 세포 사멸을 유도하는 것으로 잘 알려져 있다[34]. 따라서 cisplatin이 SKOV3 세포에 스트레스 작용하면서 p38과 JNK의 활성을 24시간까지는 증가시켜 세포 사멸을 유도하였으나 48시간에서는 p38의 활성을 감소하여 세포 사멸 조절자 역할을 하는 것으로 보여진다. 이상의 종합적 결과들은 cisplatin이 SKOV3 세포에 Akt의 활성을 감소하여 세포 증식을 억제하고 MAPK의 p38 활성을 조절하여 세포 사멸을 유도하는 것으로 사료된다.
- 따라서 본 연구에서는 cisplatin으로 세포 사멸을 유도한 SKOV3 세포에서 신호전달 과정 중 나타나는 Akt, ERK1/2, MAPK 신호전달 단백질의 변화를 조사하였다. 세포사멸에 관련한 신호 전달 단백질들은 세포 생존에 결정적인 역할을 하는 Akt 활성화 억제와 p38 활성화 조절이 세포사멸 유도와 관련되어 있음을 확인하였다.
- 그러나 Bcl-2의 발현은 감소하였다. 신호 전달 경로에서 나타나는 단백질의 발현은 ERK1/2의 활성은 시간 의존적으로 감소하였으나 Akt 활성은 24시간에 감소하다 48시간에서의 활성은 일정하였다. p38과 p-JUN의 활성은 24시간에 증가하는 것으로 나타났으나 48시간 에서 p38의 활성은 감소하였으며 p-JUN의 활성은 일정하 였다.
- 그러나 Bcl-2의 항 세포 사멸(생존 촉진) 기능과 Bax의 사멸 촉진 기능이 길항을 일으켜 두 단백질 간의 발현 양을 조절하여 세포 생존과 사멸이 결정되는 것으로 알려져 있었으나 Bax을 비롯한 BH-3, Bcl-2 단백질들이 미토콘드리아로 표적화하는 단백질들의 균형을 결정한다고 한다. 실험 결과에서 시간에 의존하여 항 세포 사멸 Bcl-2의 단백질의 발현은 감소하였다. 세포 사멸이 증가하고 있음을 나타낸 것이다.
- p38과 p-JUN의 활성은 24시간에 증가하는 것으로 나타났으나 48시간 에서 p38의 활성은 감소하였으며 p-JUN의 활성은 일정하 였다. 이상의 결과들을 토대로 결론은 cisplatin이 SKOV3 세포에서 Akt 활성을 감소하여 세포 증식을 억제하고 MAPK의 p38 발현을 조절하여 세포사멸을 유도하는 것으로 판단된다. 향 후, 암치료 전략에 도움이 되는 cisplatin을 포함한 백금기반 화학요법제의 신호전달 기전을 밝히기 위한 더 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 따라서 cisplatin이 SKOV3 세포에 스트레스 작용하면서 p38과 JNK의 활성을 24시간까지는 증가시켜 세포 사멸을 유도하였으나 48시간에서는 p38의 활성을 감소하여 세포 사멸 조절자 역할을 하는 것으로 보여진다. 이상의 종합적 결과들은 cisplatin이 SKOV3 세포에 Akt의 활성을 감소하여 세포 증식을 억제하고 MAPK의 p38 활성을 조절하여 세포 사멸을 유도하는 것으로 사료된다. MAPK 경로의 활성화는 cisplatin과 같이 백금을 기반으로 하는 화합물들이 세포 생존, 세포사멸, 세포주기 정지 등의 다양한 세포 반응을 유도할 수 있다는 연구 결과와[35] 일치하는 결과를 나타낸 것이다.
후속연구
- Cisplatin (CDDP)은 난소암 치료에 사용되는 화학 요법제로 암세포에 따라 그리고 치료 용량에 따라 다중 신호경로를 활 성화하여 세포 반응을 다르게 일으킬 수 있다. Cisplatin이 세포에 작용하는 신호전달 기전은 분명하지 않아 더 많은 연구가 필요해 보인다. 이에 본 연구는 cisplatin을 난소암 세포(SKOV3) 에 처리하여 세포사멸 유도 과정에서 나타나는 신호 단백질의 역할을 밝히고자 하였다.
- 향 후, 암치료 전략에 도움이 되는 cisplatin을 포함한 백금기반 화학요법제의 신호전달 기전을 밝히기 위한 더 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다. 본 실험을 통해 제시한 결과는 MAPK 신호 경로를 타겟으로 하는 암 치료 전략에 유용하게 사용 될 수 있기를 기대한다.
- MAPK 경로의 활성화는 cisplatin과 같이 백금을 기반으로 하는 화합물들이 세포 생존, 세포사멸, 세포주기 정지 등의 다양한 세포 반응을 유도할 수 있다는 연구 결과와[35] 일치하는 결과를 나타낸 것이다. 실험에서 얻은 신호 전달 과정에서 발현한 신호 단백질들의 작용과 스트레스에 반항하는 세포 사멸 시간을 고려하여 MAPK 의 활성 경로를 표적으로 하는 암 치료 전략에 유용한 자료가 될 수 있을 것으로 사료된다. 향후 다양한 세포 반응을 유도하는 백금 기반 금속 화합물 화학요법제로 신호 전달 기작을 밝히기 위해서는 지속적인 연구가 필요해 보인다.
- 이상의 결과들을 토대로 결론은 cisplatin이 SKOV3 세포에서 Akt 활성을 감소하여 세포 증식을 억제하고 MAPK의 p38 발현을 조절하여 세포사멸을 유도하는 것으로 판단된다. 향 후, 암치료 전략에 도움이 되는 cisplatin을 포함한 백금기반 화학요법제의 신호전달 기전을 밝히기 위한 더 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다. 본 실험을 통해 제시한 결과는 MAPK 신호 경로를 타겟으로 하는 암 치료 전략에 유용하게 사용 될 수 있기를 기대한다.
- 실험에서 얻은 신호 전달 과정에서 발현한 신호 단백질들의 작용과 스트레스에 반항하는 세포 사멸 시간을 고려하여 MAPK 의 활성 경로를 표적으로 하는 암 치료 전략에 유용한 자료가 될 수 있을 것으로 사료된다. 향후 다양한 세포 반응을 유도하는 백금 기반 금속 화합물 화학요법제로 신호 전달 기작을 밝히기 위해서는 지속적인 연구가 필요해 보인다.
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