식용 식물 35종의 생리활성 부위를 대상으로 70% 에탄올 추출물의 구강 세균(Streptococcus mutans, Lactobacillus casei, Staphylococcus epidermidis, Klebsiella pneumoniae)에 대한 항균 활성을 확인하였다. 35종의 식물추출물 중 항균 스펙트럼이 가장 넓고 최소저해농도가 낮은 히비스커스 꽃 추출물을 구강 세균에 대한 항균 소재로 최종 선발하였다. 히비스커스 추출물의 항균 활성은 산성 조건에서 안정하였고, 열 안정성이 우수하였다. 히비스커스 추출물의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량은 130.5 및 25.7 mg/g으로 나타났고, 유리라디칼 소거활성과 환원력의 항산화 활성이 우수하였다.
식용 식물 35종의 생리활성 부위를 대상으로 70% 에탄올 추출물의 구강 세균(Streptococcus mutans, Lactobacillus casei, Staphylococcus epidermidis, Klebsiella pneumoniae)에 대한 항균 활성을 확인하였다. 35종의 식물추출물 중 항균 스펙트럼이 가장 넓고 최소저해농도가 낮은 히비스커스 꽃 추출물을 구강 세균에 대한 항균 소재로 최종 선발하였다. 히비스커스 추출물의 항균 활성은 산성 조건에서 안정하였고, 열 안정성이 우수하였다. 히비스커스 추출물의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량은 130.5 및 25.7 mg/g으로 나타났고, 유리라디칼 소거활성과 환원력의 항산화 활성이 우수하였다.
Thirty-five edible plants were tested against oral bacteria (Streptococcus mutans, Lactobacillus casei, Staphylococcus epidermidis, Klebsiella pneumonia). The edible plants were extracted using 70% ethanol as a solvent. Among the thirty-five edible plants, hibiscus (Hibiscus sabdariffa) extract was ...
Thirty-five edible plants were tested against oral bacteria (Streptococcus mutans, Lactobacillus casei, Staphylococcus epidermidis, Klebsiella pneumonia). The edible plants were extracted using 70% ethanol as a solvent. Among the thirty-five edible plants, hibiscus (Hibiscus sabdariffa) extract was selected as an effective antibacterial source because it showed the lowest minimum inhibitory concentration. The antimicrobial substances of hibiscus extract were very stable at acidic condition and at wide range of temperature 4-75 ℃. The total polyphenol and flavonoid contents of hibiscus extract were 130.5 and 25.7 mg/g, respectively. Also hibiscus extract showed a high degree of antioxidant activity.
Thirty-five edible plants were tested against oral bacteria (Streptococcus mutans, Lactobacillus casei, Staphylococcus epidermidis, Klebsiella pneumonia). The edible plants were extracted using 70% ethanol as a solvent. Among the thirty-five edible plants, hibiscus (Hibiscus sabdariffa) extract was selected as an effective antibacterial source because it showed the lowest minimum inhibitory concentration. The antimicrobial substances of hibiscus extract were very stable at acidic condition and at wide range of temperature 4-75 ℃. The total polyphenol and flavonoid contents of hibiscus extract were 130.5 and 25.7 mg/g, respectively. Also hibiscus extract showed a high degree of antioxidant activity.
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문제 정의
히비스커스는 눈의 피로 회복, 소화기능 강화, 강장,이뇨, 출혈 방지 및 비뇨기계 염증 완화 등의 효능이 있는 것으로 알려져 있어[21] 생리활성 소재로의 활용 가능성이 높은 식물이다. Kang 등의 연구[22]에서는 피부 관련 미생물에서 히비스커스 에탄올 추출물의 항균활성을 확인한 바 있으며, 본 연구에서는 구강에 관련된 미생물에서의 항균활성을 확인하고자한다.
구강 미생물(Streptococcus mutans, Lactobacillus casei, Staphylococcus epidermidis 및 Klebsiella pneumonia)에 대하여항균 효과를 갖는 식물추출물을 탐색하여 가장 활성이 우수한히비스커스를 구강용 항균 천연소재로 선정하였고, 또한 히비스커스 추출물의 항균 활성 및 항산화 활성을 평가하여 구강 위생용 생리활성 소재로의 개발 가능성을 검토하였다.
제안 방법
96 well plate에 희석된 시료 50 µL와 1×105-106 CFU/mL로 희석한 균 현탁액 50 µL를 혼합한 뒤 균주별 증식용 배지 150 µL를 넣고 24시간 동안배양한 후 microplate reader (VERSAmax, Molecular Devices, San Jose, CA, USA)를 사용하여 흡광도를 측정하였고, 균체의 성장이 억제되어 탁도로 나타나지 않는 최소의 농도를 최소저해농도(MIC)로 정하였다.
5 mL 가하여 2분간 방치한 후 760 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. Chlorogenic acid를 총 폴리페놀 함량 분석의 표준물질로 선정하여 표준곡선으로부터 총 폴리페놀의 함량을 계산하였다. 총 플라보노이드 함량은 Kim 등[25]의 방법을 변형하여 측정하였다.
DPPH 유리라디칼 소거능은 Heo 등[26]의 방법을 변형하여 분석하였다. 메탄올에 0.
본 실험의 식용 식물 원료 35종은 대형마트 또는 한약소재 전문 쇼핑몰을 통하여 구매하여 사용하였고, 식물 원료의 사용부위와 원산지는 Table 1과 같다. 건조 상태의 재료는 그대로 추출에 사용하였고, 생물 상태의 재료는 흐르는 수도수를 이용하여 세척하고 열풍건조기(Taeyang Electric Co., Goyang, South Korea)를 이용하여 40 oC에서 24-48시간 동안 건조 과정을 거친 후 실험에 사용하였다.
다섯 종의 균 모두37 oC로 셋팅된 진탕 배양기(VS-8480SFN, VISION Scientific, Daejeon, South Korea)를 사용하여 호기성 조건에서 배양하였으며, 24시간 또는 48시간 동안 배양하여 1×107 CFU/mL의 균을항균 활성 분석에 사용하였다.
본 연구에서 스크리닝 대상으로 선정한 식물 유래 추출물 35종 중 4종의 구강 세균에 대하여 항균 스펙트럼이 넓고 항균활성이 높은 히비스커스, 오미자, 레몬, 모과, 몰약, 단삼 추출물을 1차 선별하였으며, 최소저해농도(MIC) 측정을 통해 구강세균에 대한 생장 저해능을 확인하였다.
산과 알칼리에 대한 항균 활성의 안정성 평가를 위해 농도별 히비스커스 추출물을 1N NaOH 또는 1N HCl 수용액을 이용하여 pH를 3, 5, 7 및 9로 조정한 후 25 oC에서 3시간 방치하였다. 이후 본래의 pH로 조절한 후 균 배양액을 첨가하여 최소저해농도를 측정함으로써 pH에 대한 안정성을 평가하였다.
식용 식물 35종의 생리 활성 부위를 70% 에탄올로 추출하여구강 세균에 대한 항균 효과를 확인하였다. Table 2는 여러 식용 식물추출물의 paper disc assay 결과를 나타낸 것으로, 당귀,박하, 자소엽, 캐모마일, 고삼, 울금, 레몬그라스, 라벤더, 칡, 매리골드, 헛개나무, 달래, 약도라지, 냉이 및 아로니아 추출물은 구강 세균인 S.
이후 본래의 pH로 조절한 후 균 배양액을 첨가하여 최소저해농도를 측정함으로써 pH에 대한 안정성을 평가하였다. 온도에 대한 안정성은 농도별 히비스커스 추출물을 4, 25, 50 및75 oC에서 30분간 방치한 후 균 배양액을 첨가하여 확인된 최소저해농도를 측정하여 확인하였다.
C에서 3시간 방치하였다. 이후 본래의 pH로 조절한 후 균 배양액을 첨가하여 최소저해농도를 측정함으로써 pH에 대한 안정성을 평가하였다. 온도에 대한 안정성은 농도별 히비스커스 추출물을 4, 25, 50 및75 oC에서 30분간 방치한 후 균 배양액을 첨가하여 확인된 최소저해농도를 측정하여 확인하였다.
제조된 고체배지 위에 8 mm filter paper disc를 놓고 진공농축한 5 brix의시료 20 µL를 흡수시킨 후 37 oC에서 24시간 동안 배양하여 관찰하였다.
총 폴리페놀 함량 측정은 Folin-Denis assay법으로 Lee 등[24]의 방법을 변형하여 분석하였다. 시료 희석액 100 µL에 folin-ciocalteu 시약 50 µL를 첨가하여 혼합한 뒤 4분 동안 반응시키고, 20% NO2CO3를 1.
Chlorogenic acid를 총 폴리페놀 함량 분석의 표준물질로 선정하여 표준곡선으로부터 총 폴리페놀의 함량을 계산하였다. 총 플라보노이드 함량은 Kim 등[25]의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 희석액 0.
C에서 4시간 동안 진탕추출하였다. 추출물은 Whatman No. 1 여과지로 여과한 뒤 감압농축기(Eyela, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)로 농축한 후, 당도계(Master refractometer, Atago, Tokyo, Japan)를 사용하여 5 brix 농도로 제조하였다.
Streptococcus mutans KCTC 3065는 Brain Heart Infusion 배지에서, Lactobacillus casei KCTC 3109는 Lactobacilli MRS Broth 배지에서 배양하였다. Staphylococcus epidermidis KCTC 1917와 Klebsiella pneumoniae KCTC 2208와 Escherichia coli KCTC 2441는 Nutrient Broth 배지를 사용하여 배양하였다. 다섯 종의 균 모두37 oC로 셋팅된 진탕 배양기(VS-8480SFN, VISION Scientific, Daejeon, South Korea)를 사용하여 호기성 조건에서 배양하였으며, 24시간 또는 48시간 동안 배양하여 1×107 CFU/mL의 균을항균 활성 분석에 사용하였다.
본 연구에서 사용한 균주는 4종의 구강세균 Streptococcus mutans KCTC 3065, Lactobacillus casei KCTC 3109, Staphylococcus epidermidis KCTC 1917, Klebsiella pneumoniae KCTC 2208과 위생지표균 Escherichia coli KCTC 2441으로,생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, Jeongeup, South Korea)에서 분양 받아 사용하였다. Streptococcus mutans KCTC 3065는 Brain Heart Infusion 배지에서, Lactobacillus casei KCTC 3109는 Lactobacilli MRS Broth 배지에서 배양하였다. Staphylococcus epidermidis KCTC 1917와 Klebsiella pneumoniae KCTC 2208와 Escherichia coli KCTC 2441는 Nutrient Broth 배지를 사용하여 배양하였다.
본 실험의 식용 식물 원료 35종은 대형마트 또는 한약소재 전문 쇼핑몰을 통하여 구매하여 사용하였고, 식물 원료의 사용부위와 원산지는 Table 1과 같다. 건조 상태의 재료는 그대로 추출에 사용하였고, 생물 상태의 재료는 흐르는 수도수를 이용하여 세척하고 열풍건조기(Taeyang Electric Co.
본 연구에서 사용한 균주는 4종의 구강세균 Streptococcus mutans KCTC 3065, Lactobacillus casei KCTC 3109, Staphylococcus epidermidis KCTC 1917, Klebsiella pneumoniae KCTC 2208과 위생지표균 Escherichia coli KCTC 2441으로,생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, Jeongeup, South Korea)에서 분양 받아 사용하였다. Streptococcus mutans KCTC 3065는 Brain Heart Infusion 배지에서, Lactobacillus casei KCTC 3109는 Lactobacilli MRS Broth 배지에서 배양하였다.
5 mL와diethylene glycol 5 mL를 혼합한 후, 1 N NaOH를 1mL씩 가하여 37 oC에서 1시간 동안 반응시킨 후 420 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 총 플라보노이드 함량 계산용 표준물질은naringin을 사용하였다.
추출 용매인 정제수와 에탄올은 Burdick & Jackson사(Muskegon, MI, USA)의 HPLC급 제품을 사용하였고, 기능성평가에 사용된 folin-ciocalteu, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 시약과 표준물질로 사용된 chlorogenic acid, naringin, ascorbic acid는 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA)의 제품을, 그 외 시약은 1급 이상을 사용하였다.
이론/모형
최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 측정은 추출물을 0.45 µm filter (Whatman International, England)를 이용하여 제균한 후 단계희석법(serial dilution method)을 통해 농도별 시료를 제조하여 사용했다.
항균 활성 평가는 Higasi[23]의 방법과 같이 paper disc법을 이용하였으며, 계대배양을 통해 활성화시킨 균은 멸균 생리식염수에 현탁하여 1×107 CFU/mL의 농도로 맞춘 후 실험에 사용하였다.
성능/효과
K. pneumoniae에 대한 추출물의 MIC를 측정한 결과, 히비스커스, 오미자, 레몬, 모과 및 몰약 추출물은 항균 능력이 있었으며, 그 중 히비스커스, 오미자 및 레몬이 모두 1,250 µg/mL의 가장 낮은 MIC값을 나타냈다.
L. casei와 K. pneumoniae에 대한 MIC값은 각각 10,000와1,250 µg/mL로 나타나 pH 3-9의 넓은 pH 범위에서도 항균 활성이 안정하게 유지됨을 확인하였다.
S. epidermidis에 대한 MIC값은 pH 3-7 범위에서 각각 625 µg/mL로 안정하게 유지되었지만, pH 9에서는 MIC값이 5,000 µg/mL로 나타나 항균 활성이 알칼리 조건에서 낮아지는 것으로 나타났다.
S. epidermidis에 대한 식물추출물의 MIC를 측정한 결과, 모든 추출물이 균의 증식을 억제하였고, 그 중 오미자와 레몬 추출물이 가장 높은 저해능을 보였다(MIC=156.3 µg/mL).
Table 3과 같이 히비스커스, 오미자, 레몬 및 모과의 70%ethanol 추출물은 충치균인 S. mutans에 대해 생장 저해능을 보였는데 이 중에서 히비스커스 추출물이 가장 낮은 MIC값(5 mg/mL)을 나타냈다. Lee와 Kim[29]의 연구는 콩 추출물이 40 mg/mL 이상의 농도에서 S.
Table 3에서 보듯이 히비스커스 꽃으로부터 얻어진 70% 에탄올 추출물이 구강 세균의 생장을 효과적으로 저해하는 것으로 나타나 히비스커스 추출물을 대상으로 pH와 온도에 대한 안정성을 확인하였다.
대조군으로 사용된 보건지표균 E. coli에 대해서 히비스커스, 오미자 및 레몬 추출물이 생장 저해능을 보였는데 이 중에서 히비스커스가 가장 낮은 MIC값(1,250 µg/mL)을 나타냈다.
또한 히비스커스 추출물을 각각 4, 25, 50 및 75 oC에서 30분간 방치한 후 최소저해농도를 측정한 결과, 모든 균이 4-75 oC 까지의 넓은 온도 범위에서 일정한 MIC값을 나타냈다. 그 값은 S.
pneumonia에 대해 낮은 항균 활성을 보였다. 루이보스와 페퍼민트 추출물은 S. mutans와 S. epidermidis에 대해, 어성초, 계피, 로즈힙 및 자몽 추출물은 S. epidermidis와 K. pneumonia에 대해, 황백 추출물은 S. mutans와 L. casei의 두 종류의 균에 대한 항균 활성을 나타냈다. 모과, 감초 및 몰약 추출물은 그람양성균인 S.
casei의 두 종류의 균에 대한 항균 활성을 나타냈다. 모과, 감초 및 몰약 추출물은 그람양성균인 S. mutans와 S. epidermidis, 그람음성균인 K. pneumonia에 대해, 단삼 추출물은 그람양성균인 L. casei와 S. epidermidis, 그람음성균인 K. pneumonia에 대해 항균 활성을 나타내었다. 특히 히비스커스,오미자 및 레몬 추출물은 그람양성균인 S.
본 연구에서는 35종의 식용 식물을 대상으로 구강 세균에 대한 항균 활성을 측정하여 히비스커스(Hibiscus sabdariffa) 추출물이 가장 효과적인 것을 확인하였다. 히비스커스는 열대아시아및 서아프리카가 원산지인 무궁화속 아욱과의 식물이며 보통 물로 추출하여 음용하는데[19], 그 추출물에는 사과산, 구연산 등이 들어있어 신맛을 가지며 안토시아닌계 색소로 인해 밝은 적색을 나타낸다[20].
엄나무, 블루베리 및 석류 추출물은 S. epidermidis에 대해, 구기자 및 당근 추출물은 K. pneumonia에 대해 낮은 항균 활성을 보였다. 루이보스와 페퍼민트 추출물은 S.
이상으로 히비스커스 추출물의 항균 활성은 산성 조건에서 가장 안정하게 유지됨을 알 수 있었으며, 이는 히비스커스가 특유의 신맛과 유기산을 함유하고 있어서 재료 본래의 pH가 낮아 산성에 더 안정한 것으로 판단된다. 구강청결제, 치약 등의 구강 청결 제품은 다양한 pH 범위의 제품이 존재하며, 히비스커스 추출물이 그 중 약산성 제품의 항균소재로 적용될 경우 안정한 항균 활성을 유지할 수 있을 것으로 사료된다.
이상의 결과로부터 35종의 식용 식물 중 히비스커스, 오미자, 레몬, 모과, 몰약, 및 단삼 추출물이 구강 세균에 대한 항균 소재로 선별되었고, 그 중 항균 스펙트럼 및 항균 활성이 가장 우수한 히비스커스 추출물을 구강 세균용 항균 및 생리활성 소재로 최종 선발하였다. 히비스커스 추출물은 상당량의 폴리페놀과 플라보노이드 화합물을 함유하고 있었고, 높은 항산화 활성을 보여주었다.
이상의 항균 활성 분석 결과로부터 항균 활성의 범위가 넓고,구강 관련 위해균과 E. coli에 대하여 우수한 항균 활성을 나타내며 특히 충치균인 S. mutans에 대한 최소저해농도가 가장 낮은 히비스커스 추출물을 구강 미생물에 대한 항균 소재로 발굴하였다.
pneumonia에 대해 항균 활성을 나타내었다. 특히 히비스커스,오미자 및 레몬 추출물은 그람양성균인 S. mutans와 S. epidermidis, 그람음성균인 K. pneumoniae와 E. coli에서 clear zone이 관찰되어 넓은 항균 스펙트럼과 높은 항균 활성을 보였다. 오미자의 경우 S.
히비스커스 추출물은 500 µg/mL의 농도에서86.1%의 유리라디칼을 소거하였고, DPPH 유리라디칼을 50%소거하는 농도인 EC50값은 246.7 µg/mL으로 나타나 히비스커스추출물은 유리라디칼 소거 항산화 능력이 우수함을 알 수 있었다.
이상의 결과로부터 35종의 식용 식물 중 히비스커스, 오미자, 레몬, 모과, 몰약, 및 단삼 추출물이 구강 세균에 대한 항균 소재로 선별되었고, 그 중 항균 스펙트럼 및 항균 활성이 가장 우수한 히비스커스 추출물을 구강 세균용 항균 및 생리활성 소재로 최종 선발하였다. 히비스커스 추출물은 상당량의 폴리페놀과 플라보노이드 화합물을 함유하고 있었고, 높은 항산화 활성을 보여주었다. 따라서 히비스커스 추출물은 구강용 항균 및 항산화 활성을 가진 기능성 원료로 활용가능성이 높을 것으로 사료되며, 향후 히비스커스 추출물의 추출 조건 최적화 및 구강용품에 적용한 연구에 대해 검토할 필요가 있다.
폴리페놀은 화학 구조에 따라 플라보노이드계와 비플라보노이드계로 구분되는 생리활성 물질로 항산화, 항염증 및 항돌연변이 활성[34]뿐만 아니라, 특히 강력한 항균 효과[35]를 갖는 것으로 알려져 있다. 히비스커스 추출물의 총 폴리페놀 함량은130.5 mg/g이었고, 총 플라보노이드 함량은 25.7 mg/g으로 나타났다(Table 4). 이 결과는 Kim과 Jin[36]의 연구에서 히비스커스의 총 폴리페놀 함량이 131.
히비스커스 추출물의 환원력도 농도에 비례하여 증가하였고(Fig. 2),반응액의 흡광도가 0.5에 달하는 농도인 RC0.5값은 490.0 µg/mL으로 나타났다.
후속연구
히비스커스 추출물은 상당량의 폴리페놀과 플라보노이드 화합물을 함유하고 있었고, 높은 항산화 활성을 보여주었다. 따라서 히비스커스 추출물은 구강용 항균 및 항산화 활성을 가진 기능성 원료로 활용가능성이 높을 것으로 사료되며, 향후 히비스커스 추출물의 추출 조건 최적화 및 구강용품에 적용한 연구에 대해 검토할 필요가 있다.
이상으로 히비스커스 꽃 추출물의 항균 물질은 열 안정성이 우수하고 산성 조건에서 안정한 것으로 확인되어 향후 구강용품 및 연관 제품에 적용할 경우 활용성이 높을 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
구강 질환이란 무엇인가?
그 중에는 충치의 원인균으로 널리 알려진 Streptococcus mutans[2]와 Lactobacillus casei[3], 구강 인두와 피부에 상주하며 화농성 염증을 유발하는 Staphylococcus epidermidis[4], 휘발성 황화합물을 생성하여 구취를 유발하는Klebsiella pneumonia 등이 대표적인 구강세균으로 알려져 있다[5]. 구강 질환은 충치(dental caries, 치아우식증), 구내염, 치주염 등 입안에서 생기는 병을 일컫는데, 특히 충치는 구강 질환중 가장 문제가 되는 감염병으로 치아표면의 파괴를 동반한다[6]. 대표적인 충치 유발균인 Streptococcus mutans는 치아 표면에서 glucosyltransferase의 촉매 작용으로 음식물의 sucrose를 분해하여 acetic acid 및 citric acid 등의 산을 생성하고, 이는 치아 에나멜층의 hydroxyapatite를 부식하여 치아 표면을 손실시킨다[2].
구강세균의 종류에는 무엇이 있는가?
미생물과 쉽게 접촉하는 신체 부위인 구강은 적절한 온도, 습도 및 음식물 잔사등으로 인해 미생물의 생육에 좋은 환경을 제공해주며, 구강 내에서는 700여 종의 다양한 세균이 존재하는 것으로 보고되어 있다[1]. 그 중에는 충치의 원인균으로 널리 알려진 Streptococcus mutans[2]와 Lactobacillus casei[3], 구강 인두와 피부에 상주하며 화농성 염증을 유발하는 Staphylococcus epidermidis[4], 휘발성 황화합물을 생성하여 구취를 유발하는Klebsiella pneumonia 등이 대표적인 구강세균으로 알려져 있다[5]. 구강 질환은 충치(dental caries, 치아우식증), 구내염, 치주염 등 입안에서 생기는 병을 일컫는데, 특히 충치는 구강 질환중 가장 문제가 되는 감염병으로 치아표면의 파괴를 동반한다[6].
구강 세균의 억제 시 불거지는 안정성 문제의 해결 방법에는 무엇이 있는가?
따라서 인간에게 독성이 없거나 적으면서 안정성이 높은 구강용 항미생물 소재의 개발이 요구되어 충치 유발균의 증식을 억제하는 방법[10], 충치균이 분비하는 glucan 합성 효소인glucosyltransferase의 활성을 저해하는 방법[11], 충치 유발균이 이용하기 쉬운 sucrose를 대체하는 감미료를 사용하는 방법[12]등이 알려져 있다. 또한 식물추출물을 대상으로 구강 관련 천연 소재를 탐색하는 연구가 꾸준히 진행되고 있으며[13], 그 대표적인 예로 감국[14], 황련[15] 및 솔잎[16] 추출물은 충치균의 생장을 억제한다고 알려졌고, 오미자[17]와 연[18] 추출물은 구강 세균의 성장 억제와 구취 제거에 효과적임이 보고되었다.
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