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문제 정의
- 새송이버섯은 필수아미노산의 대부분을 함유하고 있고, 무기질의 함량도 다른 버섯에 비해서 높은 편이며, 항산화와 항암 등 다양한 생리활성 등이 이미 보고되어있다[20,24]. 따라서 본 연구에서는 다양한 생리활성이 보고된 새송이버섯을 대상으로 현대인의 구강에 발생하는 질병들을 예방하고 치료할 수 있는 새로운 소재 관련 기능성을 조사하기 위해 새송이버섯 용매추출물을 이용하여 여러 구강질환 관련 균주에 대한 항균력을 조사하였다. 실험에 이용된 균주는 극심한 치성농양에서 자주 발견되는 Staphylococcus aureus[25], 치아우식의 원인균인 Streptococcus criceti, Streptococcus mutans, Streptococcus ratti 및 Streptococcus sobrinus, 그리고 치주질환 원인균인 Actinomyces viscosus 등을 이용하였다.
- 대부분의 버섯은 다양한 2차 대사물질을 포함하고 있는데, 이러한 버섯들은 항산화, 항염 및 항균등의 효과가 이미 알려져 있으며, 또한 잠재적으로 몇몇의 버섯에서 구강질환과 관련된 균에 대한 항균활성이 보고되어 있지만[27,29], 여러 구강균을 대상으로 한 새송이버섯의 항균활성은 전혀 보고되어 있지 않다. 따라서 본 연구에서는 새송이버섯의 용매추출물로부터 치주질환과 충치 예방을 위한 기능성을 평가할 목적으로 6종의 구강 세균에 대한 항균활성을 조사하였다. 항균활성에 사용된 균주는 치아우식증에 직간접적으로 관여하는 S.
제안 방법
- 37°C에서 24시간배양한 다음, disc의 주변에 형성된 억제환의 직경을 버니어 캘리퍼스(vernier calipers, 0~150 mm, color world, China)로 측정하여 항균 활성을 확인하였다.
- 37℃ 혐기성 배양기에서 3, 6, 8, 10 및 24 시간동안 배양 후, 600 nm에서 흡광도(MECASYS,Korea)를 측정하여 구강세균의 생육변화를 확인하였다.
- 96-well plate에 배지 40 µl와 추출물 60 µl을 혼합하고 균배양액의 최종농도가 5×105CFU/ml가 되도록 희석하여 100 µl의 균 배양액을 첨가하여 37℃ 혐기성 배양기에서 24시간 배양하였다. 600 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 균의 성장을 억제하여 흡광도가 변화하지 않거나 감소되는 최소농도를 MIC로 결정하였다. 모든시료에 대한 실험은 3회 반복 실시하였다.
- 디스크확산법에서 모든 구강균주에서 항균활성이 나타난ethyl acetate 추출물의 농도 및 시간 경과에 따른 생육저해효과를 측정하였다. 6종의 균배양액에 새송이버섯 ethyl acetate 추출물을 15.00mg/ml, 7.50 mg/ml, 3.75 mg/ml, 1.88 mg/ml, 0.94 mg/ml, 0.47 mg/ml, 0.23 mg/ml, 0.12 mg/ml,0.06 mg/ml 및 0.03 mg/ml 등의 농도로 첨가하여 배양하였으며 0, 3, 6, 8, 10, 12 및 24 시간 이후, 흡광도를 각각 측정하고 추출물을 첨가하지 않은 대조군과 비교하였으며, 그 중 15.00 mg/ml, 7.50mg/ml, 3.75 mg/ml 및 0.03 mg/ml 등의 농도 추출물 첨가로 인한 6종의 구강관련 균의 생육 변화를[Fig. 1]에 나타내었다.
- Ethyl acetate를 용매로 한 새송이버섯 추출액을 액체배지로 15.00 mg/ml에서 0.03 mg/ml 농도가 되도록 2배씩 희석하여 37°C 혐기성 배양기에서 24시간배양 후, 600 nm에서 흡광도를 측정하면서 초기의 흡광도와 비교하여 감소되는 최소농도를 MIC로 결정하였다.
- 디스크확산법에서 모든 구강균주에서 항균활성이 나타난ethyl acetate 추출물의 농도 및 시간 경과에 따른 생육저해효과를 측정하였다. 6종의 균배양액에 새송이버섯 ethyl acetate 추출물을 15.
- 새송이버섯 추출물의 농도 및 배양 시간 경과에 따른 생육저해효과를 조사하였다. 디스크확산법을 통한 항균실험결과, 새송이버섯 추출물 중에서 실험에 사용된 6종의 구강균에 대해 항균활성이 나타난 ethyl acetate 추출물을 대상으로 조사하였으며, 15.00 mg/ml, 7.50 mg/ml, 3.75 mg/ml 및0.03 mg/ml 농도의 새송이버섯 추출물을 첨가하면서 MIC 측정방법과 동일한 조건으로 실험하였다. 37℃ 혐기성 배양기에서 3, 6, 8, 10 및 24 시간동안 배양 후, 600 nm에서 흡광도(MECASYS,Korea)를 측정하여 구강세균의 생육변화를 확인하였다.
- 본 연구는 새송이버섯을 ethanol, ethyl acetate 및 acetone 등의 용매로 추출하여 치아우식증과 치주질환 관련 S. aureus, S. criceti, S. mutans, S. ratti, S. sobrinus 및 A. viscosus 등 6종의 구강균주를 대상으로 항균활성과 최소저해농도(MIC)를 측정한 결과는 다음과 같다.
- 0%) (Daejung Chemicals & Metals, Siheung, Korea) 등을 사용하였다. 분쇄한 새송이버섯 가루 50 g에 용매 400 mL를 첨가하여 48시간 동안 교반 추출하고 여과(ADVANTEC No. 2, AdvantecMFS, Inc., Tokyo, Japan)하여 고형물을 제거하였다. 진공회전증발기(rotary evaporator, EYELAA-1000S, Tokyo Rikakikai Co, Tokyo, Japan)를 이용하여 용매를 완전히 휘발시키며 농축한 이후,DMSO로 용해하여 실험에 사용하였다.
- 새송이버섯 용매추출물이 구강균에 대해 나타내는 항균력을 조사하기 위해 원판확산법을 통하여 생육저해환의 크기를 측정하였다. 구강 질환과 관련된 S.
- 새송이버섯 추출물의 농도 및 배양 시간 경과에 따른 생육저해효과를 조사하였다. 디스크확산법을 통한 항균실험결과, 새송이버섯 추출물 중에서 실험에 사용된 6종의 구강균에 대해 항균활성이 나타난 ethyl acetate 추출물을 대상으로 조사하였으며, 15.
- 1이 되도록 희석한 다음, 평판배지에 멸균한 면봉으로 도말하였다. 새송이버섯의 acetone, ethanol 및 ethyl acetate 추출물을 각각 1.5 mg/disc의 농도로 paper disc (6 mm diameter, Whatman AA discs,Whatman International, St. Louis, MO, USA)에 흡수시켜 용매를 휘발시킨후, 도말한 배지 표면에 올렸다. 37°C에서 24시간배양한 다음, disc의 주변에 형성된 억제환의 직경을 버니어 캘리퍼스(vernier calipers, 0~150 mm, color world, China)로 측정하여 항균 활성을 확인하였다.
- 새송이버섯이 구강 미생물의 생육을 저해하는데 필요한 최소농도인 최소저해농도(MIC)는 액체 배지희석법을 이용하여 측정하였다. 새송이버섯의 세 가지 추출물 중 원판확산법에서 가장 항균 활성이 높게 나타난 ethyl acetate 추출물의 MIC를 측정하였다. Ethyl acetate를 용매로 한 새송이버섯 추출액을 액체배지로 15.
대상 데이터
- 새송이버섯 용매추출물이 구강균에 대해 나타내는 항균력을 조사하기 위해 원판확산법을 통하여 생육저해환의 크기를 측정하였다. 구강 질환과 관련된 S. aureus, S. criceti, S. mutans, S. ratti, S.sobrinus 및 A. viscosus 등 6종의 균주를 사용하였다. 결과는 [Table 2]에 나타난것과 같이, 새송이버섯의 ethanol 추출물에서는 S.
- 배지는 Brain-Heart Infusion (BHI, Difco,Detroit, MI, USA)와 Trypticase Soy Broth (TSB, BD Co., USA)을 사용하였으며, 모든 균주를 해당 배지에 접종하여 37°C 혐기성 배양기(5% CO2)에서 24시간 배양하였다.
- 새송이버섯은 전라남도 광주에서 인공 재배하여 세절된 버섯을 구입하였으며, 자연 건조시켜 시료로 사용하였다. 추출용매로는 극성이 다른 acetone (99.
- 실험에 사용한 균주는 6종으로 Staphylococcus aureus (S. aureus), Streptococcus criceti (S. criceti),Streptococcus mutans (S. mutans), Streptococcus ratti (S. ratti), Streptococcus sobrinus (S. sobrinus) 및 Actinomyces viscosus (A. viscosus) 등이며, 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)로부터 분양 받아 사용하였다[Table 1]. 배지는 Brain-Heart Infusion (BHI, Difco,Detroit, MI, USA)와 Trypticase Soy Broth (TSB, BD Co.
- 따라서 본 연구에서는 다양한 생리활성이 보고된 새송이버섯을 대상으로 현대인의 구강에 발생하는 질병들을 예방하고 치료할 수 있는 새로운 소재 관련 기능성을 조사하기 위해 새송이버섯 용매추출물을 이용하여 여러 구강질환 관련 균주에 대한 항균력을 조사하였다. 실험에 이용된 균주는 극심한 치성농양에서 자주 발견되는 Staphylococcus aureus[25], 치아우식의 원인균인 Streptococcus criceti, Streptococcus mutans, Streptococcus ratti 및 Streptococcus sobrinus, 그리고 치주질환 원인균인 Actinomyces viscosus 등을 이용하였다.
- 37℃ 혐기성 배양기에서 3, 6, 8, 10 및 24 시간동안 배양 후, 600 nm에서 흡광도(MECASYS,Korea)를 측정하여 구강세균의 생육변화를 확인하였다. 음성대조군으로는 추출물 대신 DMSO를 첨가한 용액을 사용하였다. 모든 시료에 대한 실험은 3회 반복 실시하였다.
- , Tokyo, Japan)하여 고형물을 제거하였다. 진공회전증발기(rotary evaporator, EYELAA-1000S, Tokyo Rikakikai Co, Tokyo, Japan)를 이용하여 용매를 완전히 휘발시키며 농축한 이후,DMSO로 용해하여 실험에 사용하였다.
- 추출용매로는 극성이 다른 acetone (99.5%), ethanol (99.5%) 및 ethyl acetate(99.0%) (Daejung Chemicals & Metals, Siheung, Korea) 등을 사용하였다.
- 따라서 본 연구에서는 새송이버섯의 용매추출물로부터 치주질환과 충치 예방을 위한 기능성을 평가할 목적으로 6종의 구강 세균에 대한 항균활성을 조사하였다. 항균활성에 사용된 균주는 치아우식증에 직간접적으로 관여하는 S. aureus, S. criceti, S. mutans, S. ratti 및 S. sobrinus와 치주질환을 유발하는 A. viscosus 등으로 총6종이다. S.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 반복 실험하였으며, 결과는 평균±표준편차로 나타내었다.
- 본 실험의 통계분석처리는 SPSS Statistics 23 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 ANOVAtest와 Duncan’s multiple range test로 통계적 유의성 검정은 0.05로 하였다.
이론/모형
- 새송이버섯 추출물의 항균 활성은 원판확산법(disc diffusion method)으로 측정하였다. 각 추출물은 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 용해시켜 50 mg/ml의 농도로 맞추어 사용하였다.
- 새송이버섯이 구강 미생물의 생육을 저해하는데 필요한 최소농도인 최소저해농도(MIC)는 액체 배지희석법을 이용하여 측정하였다. 새송이버섯의 세 가지 추출물 중 원판확산법에서 가장 항균 활성이 높게 나타난 ethyl acetate 추출물의 MIC를 측정하였다.
- 액체배지희석법(broth dilution method)을 이용하여 구강세균 6종에 대한 새송이버섯 용매추출물의 최소저해농도(MIC)를 측정하였다. 새송이버섯 ethyl acetate 추출물을 최고농도 15.
성능/효과
- 1. 디스크확산법을 이용하여 6종의 구강균에 대한 항균활성 결과, ethyl acetate 추출물에서 실험에 이용된 모든 구강균에서 항균활성을 확인하였으며, acetone 추출물은 S. criceti, S. mutans, S.ratti 및 A. viscosus 등의 균에 대해 다소 약한 항균활성을 보였다. Ethanol 추출물은 S.
- 1]에서 보는 바와 같이, 추출물의 농도가 높아질수록 균의 생육이 크게 억제되는 것을 알 수 있었으며, 억제되는 시간 또한 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 15.00 mg/ml 농도에서는 배양초기부터 균의 생육이 크게 억제되어 균의 증식이 발생하지 않았으며, 15.00 mg/ml 보다 낮은 농도에서는 3시간까지 균의 증식이 발생하면서 대조군과 차이가 없었다. 가장 낮은 농도인 0.
- 2. MIC는 디스크확산법에서 6종의 구강균에 대해 항균활성을 모두 보인 ethyl acetate 추출물을 이용하였으며, 결과적으로 실험에 사용된 구강균 모두에서 7.50 mg/ml로 조사되었다.
- 3. 6종의 구강균에 대한 새송이버섯 ethyl acetate 추출물의 생육저해 효과를 확인한 결과, 낮은 농도에서는 시간이 경과하면서 균이 증식하는 것을 확인하였고, 농도가 높아짐에 따라 균의 생육 저해 효과가 증가하였으며, 7.50 mg/ml에서는 시간이 경과하면서 흡광도가 감소하여 생육저해 효과가 나타나는 것을 확인하였다.
- 03 mg/ml에서는 3시간 이후 급격한 균의 증식이 발생하여 24시간 이후에 대조군보다 균의 생육이 증가되었다. 3.75mg/ml의 농도에서 3시간에서 12시간까지 균이 다소 약하게 증식하였으며, 12시간 이후에는 흡광도가 급격히 상승하였다. 반면에 7.
- Ethanol, ethyl acetate 및 acetone 등 3종류의 용매로 추출한 새송이버섯에 대한 항균효과를 조사한 결과, ethyl acetate 추출물이 6종의 구강균 모두에서 항균활성을 나타내었으며. ethanol 추출물에서는 S.
- S. aureus 균에 대하여 ethanol 추출물과 ethyl acetate 추출물에서 각각10.76±0.63 mm, 10.49±1.23 mm의 생육저해환을 형성하여 우수한 항균활성을 나타내었다.
- S. mutans에 대해서 ethyl acetate 추출물과 acetone추출물에서 각각 6.12±0.16 mm과 6.21±0.36 mm의 생육저해환을 보여 항균활성이 매우 약하게확인되었다.
- S. ratti에서는 ethyl acetate 추출물에서 10.89±1.75 mm의 강한 활성을 보였으며, acetone 추출물에서는 낮은 활성을 나타내었다.
- 03 mg/ml 농도가 되도록 2배씩 희석하여 37°C 혐기성 배양기에서 24시간배양 후, 600 nm에서 흡광도를 측정하면서 초기의 흡광도와 비교하여 감소되는 최소농도를 MIC로 결정하였다. [Table 3]과 같이, S. aureus, S. criceti, S. mutans, S. ratti, S. sobrinus 및 A. viscosus 등 실험에 사용한 균주 모두에서 7.50 mg/ml의 동일한 MIC를 확인하였다.
- Ethanol, ethyl acetate 및 acetone 등 3종류의 용매로 추출한 새송이버섯에 대한 항균효과를 조사한 결과, ethyl acetate 추출물이 6종의 구강균 모두에서 항균활성을 나타내었으며. ethanol 추출물에서는 S. aureus에서만 항균활성을 보였고, acetone 추출물에서는 S. criceti, S. mutans, S. ratti 및 A.viscosus 등 4종의 구강균에서 항균활성을 나타내었다. Park 등[27]의 연구에 의하면, chloroform,methanol, acetone, ethyl acetate 및 증류수 등으로 추출한 큰 느타리버섯 추출물의 경우, S.
- viscosus 등 6종의 균주를 사용하였다. 결과는 [Table 2]에 나타난것과 같이, 새송이버섯의 ethanol 추출물에서는 S. aureus를 제외한 나머지 5종의 균주에서 생육저해효과가 나타나지 않았고, acetone 추출물에서는 S. aureus와 S. sobrinus을 제외한 나머지 4종의 균주에서 약한 항균활성을 나타내었다. S.
- mutans에서 항균활성을 보이지 않았다고 보고하였으나, 본 연구에서도 acetone과 ethyl acetate 추출물에서 항균활성을 매우 약한 항균활성을 보였다. 결과적으로 ethyl acetate 추출물의 경우 S. mutans를 제외하고 치아우식에 직간접적으로 관련된 S. sobrinus, S. aureus, S. ratti 및 S. criceti와 치주질환 원인균인 A. viscosus에 강한 항균활성을 나타냈으며, 7.50 mg/ml의 농도에서 최소저해농도(MIC)를 확인하였다. 따라서 새송이버섯은 acetone과 ethanol 보다 ethyl acetate가 구강관련 균에 대해 항균활성을 나타내는 생리활성물질을 추출하는데 더 적합한 용매로 확인되었으며, 이는 본 연구팀이 최근에 발표한 싸리버섯과 동일한 결과였다[29].
- 50 mg/ml의 농도에서 최소저해농도(MIC)를 확인하였다. 따라서 새송이버섯은 acetone과 ethanol 보다 ethyl acetate가 구강관련 균에 대해 항균활성을 나타내는 생리활성물질을 추출하는데 더 적합한 용매로 확인되었으며, 이는 본 연구팀이 최근에 발표한 싸리버섯과 동일한 결과였다[29]. 새송이버섯 추출물이 낮은 농도에서 시간이 경과함에 따라 대조군보다 균의 생육이 촉진되는 원인에 대한 관련 연구가 필요하며, 향후 새송이버섯 추출물의 항균관련 생리활성 유효성분을 분리 및 정제하여 구강균에 대한 억제 효과를 확인하고, 생리활성물질의 독성과 안전성 등의 추가 연구가 수반되어야 할 것으로 사료된다.
- 75mg/ml의 농도에서 3시간에서 12시간까지 균이 다소 약하게 증식하였으며, 12시간 이후에는 흡광도가 급격히 상승하였다. 반면에 7.50 mg/ml에서는 모든 균주에서 12시간배양 후에도 흡광도 값이 감소하여 균의 생장이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 추출물에 의한 균의 생육에 미치는 영향은 실험에 사용된 6종 균주 모두에서 비슷한 결과를 보여주었다.
- aureus에 대해서만 생육저해 효과를 보였다. 새송이버섯의 ethyl acetate 추출물은 A. viscosus 에 대해 가장 강한 활성을 나타내었다.
- 85 mm와 같이 가장 강한 항균활성을 나타내었다. 새송이버섯의 ethyl acetate 추출물은 S. mutans에 대해서 매우 약한 활성을 보였지만 다른 균주에 대해 모두 항균효과를 보여주었으며, 다른 추출물에 비해 비교적 높은 항균활성을 확인할 수 있었다.
- 대조군은 6시간까지 급격히 균이 성장한 이후 24시간까지 흡광도 값이 거의 증가하지 않는 대수기를 보였다. 새송이버섯의 ethyl acetate 추출물이 구강균의 생육에 미치는 영향을 조사한 결과, [Fig. 1]에서 보는 바와 같이, 추출물의 농도가 높아질수록 균의 생육이 크게 억제되는 것을 알 수 있었으며, 억제되는 시간 또한 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 15.
- 이상의 결과를 종합하면, 새송이버섯 추출물이 치아우식증에 직간접적으로 관여하는 S. aureus,S. criceti, S.
후속연구
- aureus,S. criceti, S. mutans, S. ratti 및 S. sobrinus 등과 치주질환을 유발하는 A. viscosus에 대한 항균효과가 있다는 것을 확인하였으며, 치아우식증과 치주질환을 비롯한 구강질환의 예방을 위하여 천연소재 개발에 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 새송이버섯 추출물이 낮은 농도에서 시간이 경과함에 따라 대조군보다 균의 생육이 촉진되는 원인에 대한 관련 연구가 필요하며, 향후 새송이버섯 추출물의 항균관련 생리활성 유효성분을 분리 및 정제하여 구강균에 대한 억제 효과를 확인하고, 생리활성물질의 독성과 안전성 등의 추가 연구가 수반되어야 할 것으로 사료된다. 또한 구강균에 항균작용을 나타내는 생리활성물질의 생산량을 증대시킬 수 있는 추출 방법을 탐색하는 후속연구를 진행하고자 한다.
- 따라서 새송이버섯은 acetone과 ethanol 보다 ethyl acetate가 구강관련 균에 대해 항균활성을 나타내는 생리활성물질을 추출하는데 더 적합한 용매로 확인되었으며, 이는 본 연구팀이 최근에 발표한 싸리버섯과 동일한 결과였다[29]. 새송이버섯 추출물이 낮은 농도에서 시간이 경과함에 따라 대조군보다 균의 생육이 촉진되는 원인에 대한 관련 연구가 필요하며, 향후 새송이버섯 추출물의 항균관련 생리활성 유효성분을 분리 및 정제하여 구강균에 대한 억제 효과를 확인하고, 생리활성물질의 독성과 안전성 등의 추가 연구가 수반되어야 할 것으로 사료된다. 또한 구강균에 항균작용을 나타내는 생리활성물질의 생산량을 증대시킬 수 있는 추출 방법을 탐색하는 후속연구를 진행하고자 한다.
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