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문제 정의
- 를 이용하여 커피를 발효함으로써 발효커피를 개발하여 상품화 하였다. 이에따라 본 연구는 발효미생물 산업 진흥원에서 개발한 발효커피가 발효전과의 차이점과 인체에 적용하여 일반적인 생활에서 발효커피에 의한 장내미생물 생태 변화를 객관적으로 평가하고자 한다.
- 본 연구에서 발효에 의해 커피원두내 총 폴리페놀과 총 플라보노이드의 양을 조사하였다. 비록 시간에 따른 함량을 조사하지 못하였지만 발효에 의해 커피원두 내 총 플라보이드와 총 폴리페놀 함량이 증가하였으며, 발효 시간에 따른 이물질들의 함량을 조사하여 본다면 발효시간 단축 개선에 큰 도움이 될 것이라 사료된다.
제안 방법
- 와 Bacillus spp.를 이용하여 커피를 발효함으로써 발효커피를 개발하여 상품화 하였다. 이에따라 본 연구는 발효미생물 산업 진흥원에서 개발한 발효커피가 발효전과의 차이점과 인체에 적용하여 일반적인 생활에서 발효커피에 의한 장내미생물 생태 변화를 객관적으로 평가하고자 한다.
- 커피생두와 물을 1:1.5의 비율로 1시간 동안 침지과정을 거친 후 121ºC, 1시간 동안 증 자과정을 진행하였다.
- 즉, 1차 PCR은 KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR kit (Roche, Wilmington, MA, USA)를 사용하였으며, PCR반응 조건은 95 ºC에서 3분간 초기 열처리한 후, 95 ºC에서 30초, 55 ºC에서 30초, 72 ºC에서 30초 간씩 25회 반복하고, 마지막에는 72ºC에서 5분 반응 시켰다.
- 장내미생물생태 분석을 위해 16S rRNA 유전자내의 과변부위 (Variable region) 중 V4 region을 Polymerase Chain Reaction (PCR)통해 증폭하였으며[13], 2-step PCR을 통해 일루미나시퀀 싱(Illumina sequencing) platform 중 하나인 Miseq platform (250 bp×2)에 맞춰 library를 제작하였다.
- 수집된 분변은 채취 후 2일 이내에 실험실로 보내도록 하였으며, 받는 즉시 MOBIO Power Fecal DNA isolation kit (MO BIO Laboratories Inc., Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 용액에 녹아있는 대변 200 µL에서 총 DNA 를 추출하였다.
- 즉, 시료 50 µL에 0.15 mM DPPH solution (99% Methanol에 용해) 150 µL을 가한 후 30 min 상온에서 방치한 후 분광광도계를 사용하여 흡광도 517 nm 에서 흡광도의 변화를 측정하였다.
- 생균수는 시료를 멸균생리식염수에 순차적으로 10배수로 희석하여 NA, MRS media에서 도말, 37ºC에서 1일간 배양 한 후 colony를 계수하여 측정하였다.
- 생균수 측정 생균수는 시료를 멸균생리식염수에 순차적으로 10배수로 희석하여 NA, MRS media에서 도말, 37ºC에서 1일간 배양 한 후 colony를 계수하여 측정하였다.
- 발효 후 수세과정을 거쳐 열풍 건조기 45ºC, 24시간 동안 건조하였다.
- 그 후, cool-down과정을거쳐 Bacillus amyloliquefaciens SRCM101368, Lactobacillus plantarum SRCM100320 2종을 커피생두에 접종하여 37 ºC, 24시간 동안 발효과정을 진행하였다.
- 3 mL를 차례로 가하여 혼합한 후 상온에서 40min 방치하여 반 응시켜 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 소거능은 Blois의 방법을 변형하 여 전자공여작용 (electron donationg abilities)에 대한 효과로 각 시료의 환원력을 측정하였다. 즉, 시료 50 µL에 0.
- 본 연구에 관한 IRB승인 후, 평소에 커피를 자주 섭취하는 피험자 10명(남: 5명, 여: 5명)을 모집하였다. 임상실험은 총 4주 동안 수행하였으며, 2주차씩 나 누어 진행하였다. 즉 1-2주 기간에는 발효커피를 섭취하지 않으 며, 3-4주 기간에는 피험자들에게 발효커피를 하루 2잔 이상씩 섭취하도록 하였다.
- 본 실험은 장내미생물생태 분석에 사용하기 위해 각 피험자는 분변을 OMNIgene-Gut kit OMR-200 (DNA Genotek, Ontario, Canada) 을 사용하여 발효커피 섭취전날과 섭취 마지막날 분변을 채취하도록 하였다. 수집된 분변은 채취 후 2일 이내에 실험실로 보내도록 하였으며, 받는 즉시 MOBIO Power Fecal DNA isolation kit (MO BIO Laboratories Inc.
- PCR 산물은 HiAccuBead (AccuGene, Incheon, Korea)로 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 다시 PCR을 이용하여 샘플 식별을 위한 barcode-sequencing을 진행하였으며, 2차 PCR후 생성 된 PCR 산물을 전에 설명한 동일한 방식으로 정제 하였다. 최종 PCR 산물은 Qubit (Invitrogen Inc.
- 정제된 PCR 산물은 다시 PCR을 이용하여 샘플 식별을 위한 barcode-sequencing을 진행하였으며, 2차 PCR후 생성 된 PCR 산물을 전에 설명한 동일한 방식으로 정제 하였다. 최종 PCR 산물은 Qubit (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, USA) 으로 농도를 측정하였으며, 동일한 농도로 모아 Miseq 시퀀싱 (sequencing) 수행을 위해 마크로젠(Seoul, Repulic of Korea)에 의뢰하였다. 시퀀싱 결과는 fastq 파일형태로 받았으며, 미국 국립생물정보센터(Bethesda, MD, USA)에서 운영하는 Sequence Read Archive에 등록하였다 (BioProject: PRJNA544370).
- MiSeq으로부터 얻은 시퀀스데이터는 MOTHUR 소프트웨어를 이용하여 오류 제거 및 통계분석을 수행하였다[14]. Operational taxonomic units (OTU)는 MOTHUR opti.clust[15]를 이용하여 97% 유사성으로 계산되었으며, 각 OTU는 Ribosome database project (version 16) 속 수준까지 분류되었다. 샘플 간 거리는 통계방법 중 하나인Bray-curtis 방법으로 계산되었으며, MOTHUR 의 “tree.
- 발효커피 섭취로인한 미생물군집의 변화는 AMOVA와 NMDS 를 통해 분석하였다.
- 장내미생물의 종 다 양성(Richness)을 나타내는 Chao와 종 균등성(Evenness)을 나타 내는 Inv-Simpson 및 Shannon지표를 발효커피를 섭취전과 후 로 나누어 비교해보았다(Fig. 2).
- 또한 PICRUSt2 (Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States 2)를 이용하여 16S rRNA 유전자 기반 metabolic pathway를 추정하였다[18].
- Analysis of molecular variance (AMOVA)는 NMDS plot에서 그룹 간 유의한 차이를 조사하기 위해 사용되었다.
- 발효에 의한 커피원두내의 생리활성 및 전자공여능을 조사하기 위해 총 폴리페놀, 플라보노이드 및 항산화 활동을 측정하였다.
- 발효커피를 섭취전과 섭취 후의 장내미생물생태 차이를 조사하 였다. 총 10명의 피험자를 모집하였으며, 피험자들의 생리학적 특성은 Table S3에 요약하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 관한 IRB승인 후, 평소에 커피를 자주 섭취하는 피험자 10명(남: 5명, 여: 5명)을 모집하였다.
- 커피생두(Brazil, Colombia, Costarica, Kenya)는 우성엠에프 (Hwaseong, Korea)에서 구입하였다. 커피생두와 물을 1:1.
- 그 후, cool-down과정을거쳐 Bacillus amyloliquefaciens SRCM101368, Lactobacillus plantarum SRCM100320 2종을 커피생두에 접종하여 37 ºC, 24시간 동안 발효과정을 진행하였다. 브라질 생두는 B. amyloliquefaciens를 이용해 발효하였으며, 콜롬비아, 코스타리카, 케냐 생두는 L. plantarum을 이용해 발효하였다. 발효 후 수세과정을 거쳐 열풍 건조기 45ºC, 24시간 동안 건조하였다.
- 즉, 1차 PCR은 KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR kit (Roche, Wilmington, MA, USA)를 사용하였으며, PCR반응 조건은 95 ºC에서 3분간 초기 열처리한 후, 95 ºC에서 30초, 55 ºC에서 30초, 72 ºC에서 30초 간씩 25회 반복하고, 마지막에는 72ºC에서 5분 반응 시켰다. PCR 산물은 HiAccuBead (AccuGene, Incheon, Korea)로 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 다시 PCR을 이용하여 샘플 식별을 위한 barcode-sequencing을 진행하였으며, 2차 PCR후 생성 된 PCR 산물을 전에 설명한 동일한 방식으로 정제 하였다.
- , Carlsbad, CA, USA) 으로 농도를 측정하였으며, 동일한 농도로 모아 Miseq 시퀀싱 (sequencing) 수행을 위해 마크로젠(Seoul, Repulic of Korea)에 의뢰하였다. 시퀀싱 결과는 fastq 파일형태로 받았으며, 미국 국립생물정보센터(Bethesda, MD, USA)에서 운영하는 Sequence Read Archive에 등록하였다 (BioProject: PRJNA544370).
데이터처리
- MiSeq으로부터 얻은 시퀀스데이터는 MOTHUR 소프트웨어를 이용하여 오류 제거 및 통계분석을 수행하였다[14]. Operational taxonomic units (OTU)는 MOTHUR opti.
- 통계학적 분석은 ANOVA를 사용하여 유의성검정을 실시하였고, 유의성이 있을때 사후검정으로 Tukey’s HSD를 사용하였다 (p<0.05).
- PICRUSt2를 통한 metabolic pathway의 유의한 차이는 STAMP (Statistical analysis of metagenomics profiles) 소프트웨어 상의 Welch’s t-test기반으로 수행하였다[19].
이론/모형
- 샘플 간 거리는 통계방법 중 하나인Bray-curtis 방법으로 계산되었으며, MOTHUR 의 “tree.shared” 명령어를 사용하여 시각화 하였다.
- 총 페놀 함량은 Folin-Denis 방법에 따라 추출된 시료 200 µL 에 Folin-Ciocalteu reagent 12.5 µL를 혼합하여 교반한 뒤, 120 분 동안 상온에서 방치하여 반응시켰으며 UV-Vis spectrophotometer (DU 800, Beckman coulter, Fullerton, CA, USA) 를 사용하여 750 nm에서 분석하였다.
- 5 µL를 혼합하여 교반한 뒤, 120 분 동안 상온에서 방치하여 반응시켰으며 UV-Vis spectrophotometer (DU 800, Beckman coulter, Fullerton, CA, USA) 를 사용하여 750 nm에서 분석하였다. 총 플라보노이드 함량은 Davis 방법에 따라 추출된 시료를 0.5 mL에 10% aluminum nitrate 0.1 mL, 1 M potassium acetate 0.1 mL 및 ethanol 4.3 mL를 차례로 가하여 혼합한 후 상온에서 40min 방치하여 반 응시켜 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 소거능은 Blois의 방법을 변형하 여 전자공여작용 (electron donationg abilities)에 대한 효과로 각 시료의 환원력을 측정하였다.
- 그룹 간 유의한 차이가 있는 OTUs는 MOTHUR의 Linear discriminant analysis Effect Size (LEfSe)를 사용하여 조사하였으며[16], 샘 플 간 유의적 차이가 있는 상관관계는 non-metric multidimensional scaling (NMDS) plot으로 나타내었다[17].
성능/효과
- NMDS상에서 발효커피 섭취로인한 미생물군집의 변화는 유의적인 차이가 없었지만, LEfSe를 통한 분석에서 발효커피섭취 전후 유의적인 차이를 보이는 6개의 OTU 를 확인하였다(Fig. 3).
- 그 결과 발효커피를 섭취함으 로써 종 균등성은 유의한 차이가 없음을 확인하였으나, 종의 풍부함은 크게 증가했음을 확인할 수 있었다.
- 하나의 그룹은 피험자 Q (BMI: 21.9)를 제외하고 상대적으로 높은 BMI를 갖는 Cluster였으며 (BMI: 25.7-29.4; A, D,E,andO),반면 다른 그룹은 피험자G (BMI:28.7)를제 외하고 상대적으로 낮은 BMI를 갖는 Cluster임을 확인하였다 (BMI: 19.6-24.5: I, K, R and T).
- 그 결과 커피원두를 발효함으로써 항산화 활성 뿐만아니라 폴리페놀 및 플라보노이드와 같은 유익한 물질의 양을 현저히 증가하였음을 확인 하였다(Fig. 1).
- 마지막으로, 발효커피 섭취에따른 미생물의 물질대사 변화를 조사해본 결과 9개의 metabolic pathways를 제 외하고는 유의적인 차이가 없음을 확인하였다(Fig. S3).
- 비록 시간에 따른 함량을 조사하지 못하였지만 발효에 의해 커피원두 내 총 플라보이드와 총 폴리페놀 함량이 증가하였으며, 발효 시간에 따른 이물질들의 함량을 조사하여 본다면 발효시간 단축 개선에 큰 도움이 될 것이라 사료된다.
- 와 같은 유해균은 감소하였다. 이러한 결과로 발효커피의 장기간 섭취는 인간의 장내에 유익한 미생물을 증가시켜 건강을 증진시킬 것으로 사료된다.
후속연구
- 종합적으로 이러한 결과는 발효커피를 섭취함으로써 인간의 건강에 이로운 효과를 가져올수 있음을 시사하며, 정확한 효과를 확인하기 위해 생리학적 차이를 추가로 조사할 필요가있다.
- 이러한 관점에서 발효커피는 Type III tyrosinemia 환자에게 이로운 효과를 줄 것이라 기대되며, 이에 대한 실질적인 평가와 이외 다른 metabolic pathways가 인간의 건강에 미치는 영향을 확인하기 위해 추가적인 실험이 필요하다.
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