[논문]동결-융해 정자의 운동학적 특성에 대한 MitoTEMPO의 영향

조은석; 김정아; 정용대; 최요한; 홍준기; 김영신; 정학재; 백선영; 사수진

doi:10.5762/kais.2020.21.3.199

동결-융해 정자의 운동학적 특성에 대한 MitoTEMPO의 영향
Effects of Mitochondria-targeted Antioxidant MitoTEMPO on the Kinetic Characteristics of Frozen-Thawed Boar Sperm 원문보기

한국산학기술학회논문지 = Journal of the Korea Academia-Industrial cooperation Society, v.21 no.3, 2020년, pp.199 - 205

초록
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정액의 동결보존은 인공수정을 통한 동물 번식에 유용한 것으로 알려져 있지만 동결-융해된 돼지 정액의 사용은 저온손상 때문에 제한된다. 최근에는 이를 보완하기 위해 다양한 첨가제 연구가 진행 되고 있다. 그 중 항산화제는 정자의 동결 융해과정에서 정자 세포막의 지질과산화를 억제시켜 정자의 생존성과 운동성을 개선시킨 다고 알려져 있다. 본 연구의 목적은 동결보존액에 대한 MitoTEMPO(미토콘드리아 표적 항산화제) 첨가가 돼지 동결-융해 정자의 운동학적 특성에 미치는 영향을 평가하는 것이다. 성숙한 Duroc종 수퇘지로부터 정액샘플을 채취하였으며, 다양한 농도의 MitoTEMPO (0, 0.5, 5, 50 및 500 μM)를 lactose-egg yolk 동결보존액에 첨가하여 정액을 동결하였다. 동결-융해 후 정자의 운동학적 특성들은 정자자동분석기 (CASA; computer-assisted sperm analysis)를 이용하여 분석하였다. 그 결과, 동결용 보존액에 5 및 50 μM (50.46±2.71%, 46.96±2.66%) MitoTEMPO 첨가 시 500 μM 처리구(35.40±2.95%)에 비해 유의적으로 높은 정자 운동성을 나타냈다(P<0.05). 그렇지만, 운동성을 제외한 다른 운동학적 특성에서는 유의적인 차이를 보이지 않았다. 결론적으로 동결용 보존액에 대한 MitoTEMPO 첨가는 동결-융해 돼지 정자의 운동성에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Cryopreservation of semen is useful for animal breeding via artificial insemination (AI). However, the use of frozen-thawed boar semen is limited due to cryodamage. The aim of this study was to investigate the effects of different concentrations of MitoTEMPO (a mitochondria-targeted antioxidant) in lactose-egg yolk (LEY) extenders on kinetic characteristics of frozen-thawed boar sperms. Semen samples were collected from mature Duroc boars (2~3 years old) and cryopreserved in LEY extenders containing 0, 0.5, 5, 50, and 500 μM MitoTEMPO. The kinetic characteristics of frozen-thawed sperms were determined 0 and 30 min after thawing using computer-assisted sperm analysis (CASA). Results indicated that sperm motility immediately after thawing was significantly higher with 5 and 50 μM (50.46±2.71% and 46.96±2.66%, respectively) than with 500 μM MitoTEMPO (35.40±2.95%) (P<0.05). However, there were no significant differences in other kinetic characteristics except motility. In conclusion, the addition of MitoTEMPO to the sperm freezing extender may have a beneficial effect on motility of post-thawed boar semen.

주제어

표/그림 (2)

표 Table 1. Effects of different concentration of MitoTEMPO on the kinetic characteristics of frozen-thawed sperm immediately after thawing
표 Table 2. Effects of different concentration of MitoTEMPO on the kinetic characteristics of frozen-thawed sperm at 30 min after thawing

AI 본문요약
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문제 정의

비록 MitoTEMPO가 사람에서 융해 후 정자의 품질에 관한 효과가 보고된 바 있지만[18], 돼지를 포함한 다른 동물들에서 연구는 매우 미흡한 실정이다. 따라서 우리는 본 연구에서 돼지 동결정액의 수정능력 향상을 위해 동결용 보존액에 대한 미토콘드리아 표적 항산화제인 MitoTEMPO 첨가가 동결-융해 후 정자의 운동학적 특성에 미치는 영향을 평가하였다.

제안 방법

정액샘플의 동결은 자동 정액동결기(SY-LAB Gerate GmbH, Austria)를 사용하여 실시하였고 동결인 완료된 샘플들은 –196 ℃ 액체질소에 담가서 분석에 사용될 때까지 보관하였다. 동결된 스트로우는 38 ℃ 항온수조에 20초 동안 담그는 방법으로 융해하여 BTS와 혼합 후 원심분리(400×g, 38 ℃, 10분)하여 상층액을 제거하고 BTS로 재부유하여 정자의 운동학적 특성 분석을 하였다. 개체 간의 변이를 최소화하기 위해서 동결-융해 후 정자의 운동성이 30 % 이상인 개체(두록종 수퇘지)만를 선발한 후 정액샘플을 pooling 하여 본 연구에 이용하였다.

대상 데이터

정자샘플은 BTS 희석을 통해 30×106 cells/㎖의 농도로 조정하여 분석했다. 38℃로 가온된 정자샘플 5 μl를 markler counting chamber (Sefi-Medical Instruments, Israel)와 CASA를 사용하여 샘플 당 최소 100마리의 정자를 평가하기 위해서 10회 이상 분석을 반복하여 데이터를 수집하였다. 각 정자샘플의 운동학적 특성 지표인 운동성(MOT, percent of motile sperm, %; 운동성이 있는 정자의 비율), 곡선운동 속도(VCL, curvilinear velocity, ㎛/s; 정자의 운동 경로를 따라 형성되는 호를 단위시간 당 이동한 거리), 직선운동 속도(VSL, straight-line velocity, ㎛/s; 정자의 처음 위치와 마지막 위치 사이의 직선거리를 전체 경과시간으로 나눈 값), 평균운동 속도(VAP, average path velocity, ㎛/s; 전체 이동한 거리를 경과한 시간으로 나눈 값), 직진성(LIN, linearity, %; VSL과 VCL의 비[VSL/VCL]), 측두 이동거리(ALH, Amplitude of lateral head displacement, ㎛; 이동에 따른 정자두부 좌우 진폭의 평균거리)가 측정되었다.
동결된 스트로우는 38 ℃ 항온수조에 20초 동안 담그는 방법으로 융해하여 BTS와 혼합 후 원심분리(400×g, 38 ℃, 10분)하여 상층액을 제거하고 BTS로 재부유하여 정자의 운동학적 특성 분석을 하였다. 개체 간의 변이를 최소화하기 위해서 동결-융해 후 정자의 운동성이 30 % 이상인 개체(두록종 수퇘지)만를 선발한 후 정액샘플을 pooling 하여 본 연구에 이용하였다.
본 연구에 사용된 정액은 농촌진흥청 국립축산과학원 양돈과에서 사육된 성숙한 두록종(Duroc) 수퇘지 3두를 대상으로 음경 수압법을 이용하여 채취되었다. 채취된 원정액은 여과지를 통해 교양물질 및 불순물을 제거한 후, 채취정액과 등온조건(약 38 ℃)으로 가온한 정액희석액(BTS; Beltsville thawing solution)을 1:1 비율로 1차 희석하여 1시간 이내로 실험실로 운반하여 연구에 이용하였다.

데이터처리

1 version을 이용하였다. 3가지 이상의 변수의 차이는 ANOVA를 이용하여 분석하였고, 사후검증으로 Duncan의 multiple range test방법을 이용하였다. 집단 간 평균의 차이는 t-test를 이용하였다.
동결-융해된 정자의 운동학적 특성들은 CASA를 사용하여 객관적으로 평가되었다. 정자샘플은 BTS 희석을 통해 30×106 cells/㎖의 농도로 조정하여 분석했다.
3가지 이상의 변수의 차이는 ANOVA를 이용하여 분석하였고, 사후검증으로 Duncan의 multiple range test방법을 이용하였다. 집단 간 평균의 차이는 t-test를 이용하였다. 모든 검정은 유의수준 5% 이하로 수행하였다.

성능/효과

이유자돈 돼지 정액의 동결과정 중 동결보존액에 대한 MitoTEMPO 첨가가 융해 직후 정자의 운동학적 특성에 미치는 영향을 Table 1에 나타내었다. MitoTEMPO 5 및 50 μM 처리구에서의 운동성은 각각 50.46±2.71 %, 46.96±2.66 %로 무처리구(0 μM, 41.68±1.31 %)와 0.5 μM 처리구(40.28±0.75 %) 보다다소 높은 운동성을 보였으나 유의적인 차이를 보이지 않았고 500 μM 처리구(35.40±2.95 %) 보다는 유의적으로 높은 운동성을 나타냈다 (p<0.05). 이러한 결과는 5 및 50 μM MitoTEMPO 처리가 생존은 하고 있으나 낮은 대사 상태로 움직이지 않는 정자에 운동성을 개선하는 것으로 사료된다.
그 결과 융해 직후의 정자의 운동학적 특성과 유사한 경향치를 보였다. 이는 시간이 경과함에 따라도 MitoTEMPO의 영향은 비슷하다는 것을 추측할 수 있다.
실제로, 동결보존 과정에서 다양한 종류의 세포에서 검출된 과산화물 형태의 활성산소는 다양한 항산화제를 첨가함으로써 조절될 수 있다고 보고된 바 있다[24]. 따라서, 본 연구의 결과는 돼지 동결정액 제조과정에 있어 미토콘드리아 타겟 항산화제인 MitoTEMPO를 동결보존액에 첨가함으로써 정자의 운동성을 개선시킬 수도 있음을 확인하였다.
하지만 다른 종들에서 이에 대한 연구가 진행된 바 없기 때문에 추후 연구가 필요할 것으로 사료된다. 본 연구에서는 돼지 동결용 보존액에 대한 5 및 50 μM의 MitoTEMPO 처리가 융해 후 돼지 정자의 운동성에 긍정적인 영향을 미치는 것을 확인했다. 이러한 결과는 다양한 항산화제가 동결-융해 후 정자의 품질을 개선시켰다는 보고들과 일치한다[20, 21].
본 연구의 결과를 종합해 보면 동결보존액에 대한 5 및 50 μM MitoTEMPO의 첨가는 동결-융해 후 돼지 정자의 운동성에 긍정적인 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다. 본 연구의 결과는 우량 씨돼지 유전자원 보존과 번식효율 증진 측면에서 돼지 육종개량과 더불어 양돈산업에 잠재적으로 가치가 높으며, 정자 동결보존과 융해 후 품질개선을 위한 다양한 첨가물 활용 연구에 기초자료를 제공할 것으로 생각된다.
이러한 결과는 5 및 50 μM MitoTEMPO 처리가 생존은 하고 있으나 낮은 대사 상태로 움직이지 않는 정자에 운동성을 개선하는 것으로 사료된다. 정자의 운동성(MOT) 이외에 평균운동 속도(VAP)와 직진성(LIN)이 대조구에 비해 0.5, 5 및 50 μM MitoTEMPO 처리구에서 다소 높은 경향을 보였으나, 곡선운동 속도(VCL)와 직선운동 속도(VSL)과 마찬가지로 유의적인 차이는 관찰되지 않았다. Table 2는 융해 후 30분 경과 후에 정자의 운동학적 특성을 분석한 결과이다.

후속연구

본 연구의 결과를 종합해 보면 동결보존액에 대한 5 및 50 μM MitoTEMPO의 첨가는 동결-융해 후 돼지 정자의 운동성에 긍정적인 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다. 본 연구의 결과는 우량 씨돼지 유전자원 보존과 번식효율 증진 측면에서 돼지 육종개량과 더불어 양돈산업에 잠재적으로 가치가 높으며, 정자 동결보존과 융해 후 품질개선을 위한 다양한 첨가물 활용 연구에 기초자료를 제공할 것으로 생각된다.
이는 MitoTEMPO의 효과가 종마다 다를 수 있음을 시사한다. 하지만 다른 종들에서 이에 대한 연구가 진행된 바 없기 때문에 추후 연구가 필요할 것으로 사료된다. 본 연구에서는 돼지 동결용 보존액에 대한 5 및 50 μM의 MitoTEMPO 처리가 융해 후 돼지 정자의 운동성에 긍정적인 영향을 미치는 것을 확인했다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	미토콘드리아는 어떻게 알려져 있는가?	미토콘드리아는 ATP 생성, 지방산 산화, 세포사멸 및 괴사 조절, 세포질 칼슘 이온 및 ROS 항상성 조절을 포함한 많은 세포 과정에서 중요한 역할을 하는 세포소기관으로 알려져 있다[12]. 돼지의 난모세포 및 배아의 세포질에서 높은 수준의 ATP 생성은 생체 및 시험관 내 난모세포 성숙, 수정 및 초기 배아 발달에 필요하다[13].
	정자 동결보존은 어디에 사용되는가?	정자 동결보존은 가축의 인공수정에 사용하여 동물 번식 프로그램 및 사람의 난임을 치료하기 위해 널리 사용되고 있다. 동결정액 활용의 장점은 우량 유전자원 장기 보존, 장거리 수송, 병원체 확산방지 보증 등을 포함한다[1].
	정자 동결보존의 장점은 무엇인가?	정자 동결보존은 가축의 인공수정에 사용하여 동물 번식 프로그램 및 사람의 난임을 치료하기 위해 널리 사용되고 있다. 동결정액 활용의 장점은 우량 유전자원 장기 보존, 장거리 수송, 병원체 확산방지 보증 등을 포함한다[1]. 하지만 돼지의 경우, 다른 축종들과 비교하여 정자 세포막 불포화지방산의 비율이 높아 세포막의 지질과산화가 발생하기 쉬우며, 이는 정자의 운동성과 생존성을 급격히 저하 시키는 요인으로 보고되고 있다[2, 3].

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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