[논문]곰보버섯 (Morchella spp.) 수집균주의 배양적특성 및 유전적 유연관계

민경진; 박혜성; 이은지; 이찬중

doi:10.14480/jm.2020.18.1.100

곰보버섯 (Morchella spp.) 수집균주의 배양적특성 및 유전적 유연관계
Culture characteristics and genetic relationship of morel mushroom (Morchella spp.) isolates from Korea and other countries 원문보기

Journal of mushrooms = 한국버섯학회지, v.18 no.1, 2020년, pp.100 - 106

민경진 (농촌진흥청 국립원예특작과학원 인삼특작부 버섯과) , 박혜성 (농촌진흥청 국립원예특작과학원 인삼특작부 버섯과) , 이은지 (농촌진흥청 국립원예특작과학원 인삼특작부 버섯과) , 이찬중 (농촌진흥청 국립원예특작과학원 인삼특작부 버섯과)

초록
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본 연구는 국내외 수집 균주를 대상으로 균주의 배양적 특성과 유전적 유연관계 및 균주별 함유된 베타글루칸의 함량을 분석하였다. 곰보버섯은 생장온도 25℃, pH 7.0에서 균사 생장이 가장 왕성하였다. 균사는 초기에 백색에서 생장이 진행될수록 진한 노란색을 띠다 진한 갈색으로 변화하는 공통적인 특징을 가지고 있었으며, 곰보버섯만의 고유한 배양적 특징으로 균사가 종에 따라 주기별로 경화되는 특징과 특유 강한 향이 있다는 것을 확인할 수 있었다. 균사 형태는 관찰을 통하여 총 5종류로 분류되었고 이들 균주의 ITS 분석 결과 Morchella conica, M.sextelata, M. importuna, M. esculenta, M. carssipes 등 5종으로 동정되었다. UFPF primer를 이용하여 PCR 다형성을 분석한 결과 ITS 분석 결과와는 다르게 M. conica로 동정된 KMCC04971 균주와 M. sextelata로 동정된 KMCC04407 균주는 동일한 패턴을 보였으며 그 결과 4개의 그룹으로 분류할 수 있었다. 균주별 균사체 베타글루칸 함량 분석 결과 M. importuna인 KMCC04973 균주가 100 g당 알파글루칸 16.4 g을 포함하는 베타글루칸 함량 33.1 g으로 가장 높았다.

Abstract ▼ AI-Helper

Eight morel mushroom species were collected from Korea and other countries. The culture characteristics, genetic relationships, and beta-glucan content of the strains were analyzed. The mycelia of Morchella species exhibited optimal growth when cultured in dark at 25 ℃ in media with pH 7. The mycelia had a distinctive mycelial scent and characteristically changed color, being white initially, and then turning dark yellow to dark brown as it grew. The mycelia were classified into five types based on morphology. The isolates were identified as Morchella conica, two M. sextelata, M. importuna, M. esculenta, and three M. crassipes, based on ITS-rDNA sequences. PCR polymorphisms were variably produced within Morchella spp. using Universal Fungal Fingerprinting Primers (UFPF) and classified into four groups at the intra and inter species level. The strains, KMCC04971 and KMCC04407, showed the same banding pattern as M. conica and M. sextelata, respectively; however, these results were different from those of ITS analysis. Glucan content analysis by strain showed that the KMCC 04973 strain of M. importuna had the highest alpha- and beta-glucan content, at 16.4 g and 33.1 g per 100 g, respectively.

주제어

표/그림 (9)

표 Table 1. The list of Morchella spp. used in this study
그림 Fig. 1. Effect of temperature and pH on the growth of Morchella spp.
그림 Fig. 2. Morphological characteristics of Morchella spp. on PDA media.
표 Table 2. Characteristics of mycelial growth 8 Morchella spp. on PDA media
그림 Fig. 3. Mycelial growrth of Morchella spp. on PDA media with LIS formation.
그림 Fig. 5. PCR polymorphism of Morchella spp. symplified by UFPF 1, UFPF 2 and UFPF 3 primers.
그림 Fig. 4. Phylogenetic relationships of Morchella spp. based on ITS region sequences.
그림 Fig. 6. Dendrogram derived from polymorphic bands generated by UFPF primers in Morchella spp.
표 Table 3. Total glucan, α-glucan and β-glucan contents of mycelical Morchella spp.

AI 본문요약
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* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.

문제 정의

본 연구는 국내외 수집 균주를 대상으로 균주의 배양적특성과 유전적 유연관계 및 균주별 함유된 베타글루칸의함량을 분석하였다. 곰보버섯은 생장온도 25^oC, pH 7.
본 연구는 국내외에서 수집한 곰보버섯에 대한 배양적 특성을 구명하였고, rDNA ITS 염기서열과 UFPF primer를 이용한 유전학적인 특성 및 균주별 함유된 베타글루칸의 함량을 분석한 결과를 보고하고자 한다.
담자균류의 다당체는 세포골격을 구성하는 세포벽(cellwell) 다당, 세포 내에 저장 형태로 존재하는 세포 내(interacellular) 다당 및 균체외로 분비하는 세포 외(extracellular) 다당 등 세 가지로 나눌 수 있다(Lee,1996). 본 연구에서는 세포벽과 세포 내 저장 형태로 존재하는 베타글루칸의 함량을 분석하였다. 국내외 곰보버섯수집 균주의 베타글루칸 함량은 Table 3과 같다.

제안 방법

증폭된 PCRproduct는 1.5% agarose gel에서 전기영동한 후 PCR 다형성 밴드를 관찰하였다.
0)로 희석한후 12,000 rpm에서 10분간 원심분리 후 100 µl를 취하여 exo-1,3-β-glucanse(100 U/ml)와 β-glucosidase(20 U/mL)를 100 µl 혼합하였다. 40^oC에서 1시간 반응 후 glucosedetermination reagent를 3 ml 첨가하고 40^oC에서 20분간 반응시킨 후 510 nm에서 흡광도를 측정하여 total glucan함량을 분석하였다. α-Glucan 분석은 100 mg 시료에2 M KOH를 넣고 20분간 아이스 워터에서 진탕 시킨 뒤1.
Kit 내 사용 방법에 따라Total-Glucan 과 α-Glucan 당 함량을 구한 뒤 두 당 함량의 차이로 β-Glucan을 계산하였다.
)를 넣고 전체 반응 용액이 총 50 µl가 되도록 하였다. PCR 기기를 이용하여 DNA 변성 94^oC 5분간, 그 후 변성은 94^oC 1분,annealing 55^oC 1분, 합성 72oC 2분, 36 cycle실시하였으며 최종 DMA 합성 72^oC 7분으로 하였다. 증폭된 PCRproduct는 1.
PCR 반응 용액은 10 mM Tris-HCl(pH 8.0), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.01% gelatin, 100 ng primer, 50 ng templateDNA, 2.5 mM dNTP (dCTP, dTTP, dATP, dGTP) 및 2.5unit Taq polymerase (JK Biotech. Ltd.)를 넣고 전체 반응 용액이 총 50 µl가 되도록 하였다.
, 2010) 곰보버섯의 종명을 분석하고자 수행하였다. PCR 증폭 조건은 DNA 변성 94^oC 4분, 94^oC 1분, annealing 55^oC 1분, 합성 72^oC 2분, 35 cycle실시 후 최종 DMA 합성 72^oC 10분으로하였다. 증폭된 산물은 1.
배양 후5 mm cork borer를 이용하여 균주별로 균사 선단 부위를 절단하여 새로운 PDA 플레이트의 중앙에 접종하였다. 각 균주별로 동시에 접종하였으며 3회 반복하여 25^oC에서 6일간 배양하면서 매일 균사 생장 정도를 비교하였다.
곰보버섯(Mochella spp.) 계통별 ITS 염기서열을 분석한 결과 700~1200 bp 정도의 증폭 산물을 얻었으며 보정을 통해 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 등록되어 있는 종들과 ITS region sequence 상동성을 비교하여 분석하였다. 또한 MEGA(Molecular EvolutionaryGenetics Analysis, X)의 neighbor-joining 방법으로Bootstrap 1000회 반복하여 계통수를 작성하였다.
Mochella spp. 균주로부터 Genomic DNA를 추출하기 위하여 100 ml PDB Broth (Potato Dextrose Broth)에PDA 평판 배지 상에 미리 배양된 균사체의 선단 부위를5mm cork borer를 이용하여 agar를 포함한 plug를 접종하고 균주 간 성장 속도에 따라 10에서 15일간 150 rpm으로 진탕 배양하였다. 배양이 완료된 균사체를 여과지를 이용하여 걸러낸 뒤 증류수를 이용하여 배지 성분을 세척하고 PDA 조각을 걸러낸 뒤 동결 건조하였다.
반응종료 후 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 100 µl를 취하여 glucose determination reagent를 3 ml 첨가하고 40oC에서 20분간 반응시킨 후 510 nm에서 흡광도를 이용하여 α-Glucan(phytoglycogen and starch) 당 함량을 측정하였으며 β-Glucan 함량은 Megazyme에서 제공하는 검량 프로그램에 대입하여 (g/100 g) 값으로 계산하였다.
수집 곰보버섯 균주의 균사 생장과 형태적 특성을 조사하기 위하여 PDA에 계대하여 7일간 배양하였다. 배양 후5 mm cork borer를 이용하여 균주별로 균사 선단 부위를 절단하여 새로운 PDA 플레이트의 중앙에 접종하였다. 각 균주별로 동시에 접종하였으며 3회 반복하여 25^oC에서 6일간 배양하면서 매일 균사 생장 정도를 비교하였다.
균주로부터 Genomic DNA를 추출하기 위하여 100 ml PDB Broth (Potato Dextrose Broth)에PDA 평판 배지 상에 미리 배양된 균사체의 선단 부위를5mm cork borer를 이용하여 agar를 포함한 plug를 접종하고 균주 간 성장 속도에 따라 10에서 15일간 150 rpm으로 진탕 배양하였다. 배양이 완료된 균사체를 여과지를 이용하여 걸러낸 뒤 증류수를 이용하여 배지 성분을 세척하고 PDA 조각을 걸러낸 뒤 동결 건조하였다. 동결 건조한 균사체를 곱게 마쇄한 후 100 µg을 1.
수집 곰보버섯 균주의 균사 생장과 형태적 특성을 조사하기 위하여 PDA에 계대하여 7일간 배양하였다. 배양 후5 mm cork borer를 이용하여 균주별로 균사 선단 부위를 절단하여 새로운 PDA 플레이트의 중앙에 접종하였다.
). 유전적 유사도를 분석한 결과 A 그룹(KMCC04971, 04407),B 그룹(KMCC04973), C 그룹(KMCC04972), D 그룹(KMCC04974, 04975, 04976, 04977) 등 4개의 그룹으로 나누어졌다. 또한 국외 수집종과 국내 수집종과의 구별되는 것을 확인하였으며 ITS 분석 결과 M.
)를 사용하여 PCR 산물을 정제하였다. 정제된PCR product를 Genotech(Daejeon, Korea)사에 의뢰하여 염기서열 분석하였다.
증폭된 산물은 1.5% agarose gel에서 전기영동한 후 UV lamp를 통해 관찰 후 PCR clean-up gel extraction kit (Macherey–nagel Co.)를 사용하여 PCR 산물을 정제하였다.
추출한 DNA를 주쇄로 ITS 1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’)과 ITS 4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATATGC-3’) primer를 이용하여 Polymerase Chain Reaction(PCR) 분석을 수행하였다.

대상 데이터

본 연구에 사용된 균주는 농촌진흥청 국립원예특작과학원 버섯과(KMCC, Korean Mushroom Culture Collection)에서 분양받아 사용하였다(Table 1) 시험에 사용된 균주는 국외 수집 4균주, 국내 수집 4균주 등 총 8균주를 분양받아 4^oC에서 보존하면서 실험에 사용하였다.

데이터처리

또한 MEGA(Molecular EvolutionaryGenetics Analysis, X)의 neighbor-joining 방법으로Bootstrap 1000회 반복하여 계통수를 작성하였다. PCR다형성 분석은 검출된 밴드의 유무로 database한 후 유사도(similarity coefficient)를 산출하였고 Dendrogram은 위의 유사도 값을 근거로 UPGA (unweighted paired groupmethods with arithmatic average)법을 이용하여 작성하였다. 유연관계분석을 위한 program은 NTSYS (numericaltaxonomy system using multivariate statiscal programsVer.
실험은 모두 3회 반복 수행하였으며 얻어진 결과는SAS 9.4 program을 이용하여 평균과 표준편차를 산출하고 Duncan multiple range test를 통하여 각 실험 평균차에 대한 통계적 유의성 검정을 수행하였으며, p<0.05 및p<0.01 수준에서 검증하였다.
PCR다형성 분석은 검출된 밴드의 유무로 database한 후 유사도(similarity coefficient)를 산출하였고 Dendrogram은 위의 유사도 값을 근거로 UPGA (unweighted paired groupmethods with arithmatic average)법을 이용하여 작성하였다. 유연관계분석을 위한 program은 NTSYS (numericaltaxonomy system using multivariate statiscal programsVer. 2.2)를 이용하였다.

이론/모형

) 계통별 ITS 염기서열을 분석한 결과 700~1200 bp 정도의 증폭 산물을 얻었으며 보정을 통해 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 등록되어 있는 종들과 ITS region sequence 상동성을 비교하여 분석하였다. 또한 MEGA(Molecular EvolutionaryGenetics Analysis, X)의 neighbor-joining 방법으로Bootstrap 1000회 반복하여 계통수를 작성하였다. PCR다형성 분석은 검출된 밴드의 유무로 database한 후 유사도(similarity coefficient)를 산출하였고 Dendrogram은 위의 유사도 값을 근거로 UPGA (unweighted paired groupmethods with arithmatic average)법을 이용하여 작성하였다.

성능/효과

5 mm로 가장 느렸으며 균사는 노란색이며 풍부한 솜털 같은 균사와 동심원을 그리며 자랐다. Duncan으로 유의성 분석한 결과 KMCC04971, KMCC04407 균주가 가장 유의미하게 빨리 생장하는 것을 확인할 수 있었다.Buscot(1993)는 곰보버섯의 배양적인 특징으로 M.
배양적 특성은 Table 2에 나타내었다. Fig. 1은 PDA 배지 상에서 곰보버섯의 최적 생장 온도와 pH를 조사한 결과로 최적온도는 25^oC였고 pH는 7.0으로 나타났다. 이러한 결과는 Winder(2006)의 연구와 비슷한 결과였으며, 실험 곰보버섯 균주는 백색 균사가 점차 노란색을 띠며 진갈색으로 변하는 공통적인 특징을 가지고 있었다(Fig.
국내외 곰보버섯수집 균주의 베타글루칸 함량은 Table 3과 같다. M.importuna인 KMCC04973 균주는 균사체 내 알파글루칸함량이 100당 16.4 g, 베타글루칸 함량이 33.1 g으로 가장 높았고, M. carssipes 3균주(KMCC04975, 04976, 04977)는 평균 12.5 g의 알파글루칸과 26.9 g의 베타글루칸을 함유하고 있었다. 그리고 M.
carssipes등 5종으로 동정되었다. UFPF primer를 이용하여 PCR다형성을 분석한 결과 ITS 분석 결과와는 다르게 M.conica로 동정된 KMCC04971 균주와 M. sextelata로 동정된 KMCC04407 균주는 동일한 패턴을 보였으며 그 결과 4개의 그룹으로 분류할 수 있었다. 균주별 균사체 베타글루칸 함량 분석 결과 M.
carssipes KMCC04977은 92%의 상동성을 보였다. 같은 종인 M. carssipes 사이에서도 분석 결과 10%이하의 유전적 다형성의 차이가 존재하는 것을 확인하였다. 이와 같이 곰보버섯의 형태적인 특징만으로 종을 결정짓기에는 한계가 있기 때문에 RAPD 다형성 방법은 곰보버섯의 유전적 유사성과 계통 발생학적 분석을 확인하는데 유용한 방법이다(Gepts et al.
63%의높은 상동성을 보였다. 국내 수집 3균주는(KMCC04975,04976, 04977) M. carssipes와 각각 99.64, 99.82,99.82%로 높은 상동성을 보였다.
국내외 수집한 곰보버섯 8균주를 대상으로 12종류의 UFPF primer로 PCR 다형성 분석을 실시하였으며 그 중 UFPF 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9 primer가 PCR 핵산지문 primer로 적합한 것으로 확인되었다(자료생략). Fig.
85%로 높은 상동성을 보였다. 국외 수집균주 KMCC04973는 M. importuna와 100%로 일치하였고, 국내 수집 균주 KMCC04974는 M. esculenta와 99.63%의높은 상동성을 보였다. 국내 수집 3균주는(KMCC04975,04976, 04977) M.
균사는 초기에 백색에서 생장이 진행될수록 진한 노란색을 띠다 진한 갈색으로 변화하는 공통적인 특징을 가지고 있었으며, 곰보버섯만의 고유한 배양적 특징으로 균사가 종에 따라 주기별로 경화되는 특징과 특유 강한 향이 있다는 것을 확인할 수 있었다. 균사 형태는 관찰을 통하여 총 5종류로 분류되었고 이들 균주의 ITS 분석 결과 Morchella conica,M.sextelata, M. importuna, M. esculenta, M. carssipes등 5종으로 동정되었다. UFPF primer를 이용하여 PCR다형성을 분석한 결과 ITS 분석 결과와는 다르게 M.
0에서 균사 생장이 가장 왕성하였다. 균사는 초기에 백색에서 생장이 진행될수록 진한 노란색을 띠다 진한 갈색으로 변화하는 공통적인 특징을 가지고 있었으며, 곰보버섯만의 고유한 배양적 특징으로 균사가 종에 따라 주기별로 경화되는 특징과 특유 강한 향이 있다는 것을 확인할 수 있었다. 균사 형태는 관찰을 통하여 총 5종류로 분류되었고 이들 균주의 ITS 분석 결과 Morchella conica,M.
sextelata로 동정된 KMCC04407 균주는 동일한 패턴을 보였으며 그 결과 4개의 그룹으로 분류할 수 있었다. 균주별 균사체 베타글루칸 함량 분석 결과 M. importuna인 KMCC04973균주가 100 g당 알파글루칸 16.4 g을 포함하는 베타글루칸 함량 33.1 g으로 가장 높았다.
유전적 유사도를 분석한 결과 A 그룹(KMCC04971, 04407),B 그룹(KMCC04973), C 그룹(KMCC04972), D 그룹(KMCC04974, 04975, 04976, 04977) 등 4개의 그룹으로 나누어졌다. 또한 국외 수집종과 국내 수집종과의 구별되는 것을 확인하였으며 ITS 분석 결과 M. conica로 동정되었던 KMCC04971 균주와 M. sextelata 로 동정되었던KMCC04407 균주가 PCR 다형성 분석에서는 99%의 유사성을 보여 ITS 분석과는 다른 결과를 보였다. 유연관계도 분석 결과 M.
CDA 배지 종류별로 배양하여 균사 생장 실험을 3회 이상 반복하였다. 배지 종류별 곰보버섯의 균사 생장을 조사한 결과 유의미한 차이는 없었으며 매우 생장이빨라 6일 만에 모든 배지에서 생장이 완료되었다. 생장은KMCC04971가 74.
). 본 연구에서는 KMCC04971(M. conica) 2주, KMCC04407,04972(M. sextelate) 2주, KMCC04974 (M. eaculenta) 3주, KMCC04975, 04976, 04977(M. cassipes) 3주째 형성되는 것으로 확인되었으며 KMCC04973 (M. importuna)균주는 평판배지에서 LIS를 형성하지 않았다. 실험 균주 중 M.
생장은KMCC04971가 74.5±4.0 mm로 가장 빠르게 생장하였고, 균사는 밝은 백색으로 가운데를 중심으로 넓게 퍼져 균사 생장은 KMCC04407 균주가 73.2±1.1 mm, KMCC04972는66.5±0.5 mm, KMCC04974은 55.6±3.2 mm, KMCC04976는 50.4±1.5 mm, KMCC04973 39±3.6 mm 그리고KMCC04975는 38±3.0 mm였다.
importuna)균주는 평판배지에서 LIS를 형성하지 않았다. 실험 균주 중 M. sextelate KMCC04972는 점성이 있는 유색의 액상이 균사에 맺히다가 LIS가 형성되는 것이 관찰되었다. 이러한 결과는 Philippoussis 등(1995)이 M.
sextelata 로 동정되었던KMCC04407 균주가 PCR 다형성 분석에서는 99%의 유사성을 보여 ITS 분석과는 다른 결과를 보였다. 유연관계도 분석 결과 M. conica KMCC04971, M. sextelataKMCC04407, M. importuna KMCC04973 세 균주는80%로 높은 상동성을 나타내었다. 이들 세 균주와 M.
importuna KMCC04973 세 균주는80%로 높은 상동성을 나타내었다. 이들 세 균주와 M.sextelata KMCC04972는 30%의 낮은 상동성을 보였으며 국내 수집 균주간의 관계를 보았을 때 M. esculenta KMCC04974, M. carssipes KMCC0475는 99%의 상동성을 보였고, 이들 두 균주와 M. carssipes KMCC04976는95%, M. carssipes KMCC04977은 92%의 상동성을 보였다. 같은 종인 M.
rotunda이 5주라고 보고한 결과와 비슷하였다. 이상의 결과로 균주의 생장속도와 균사의 색과 형태를 분석한 결과 약 5종으로 분류할 수 있었다.
로 동정되었다. 중국에서 수집한 KMCC04971 균주는 Morchella conica와 99.85%의 높은 상동성을 보였으며 나머지 중국에서 수집한 2균주는(KMCC04407, 04972) M. sextelata와 각각 100, 99.85%로 높은 상동성을 보였다. 국외 수집균주 KMCC04973는 M.

후속연구

Nitha 등 (2007)은 10mer의 primer를 이용한 RAPD profiling을 통해 곰보버섯 균주간의 유전적 유사성과 계통발생의 다양성을 분석한 결과 유의한 결과를 얻었다고 보고하였다. 이상의 결과로 ITS분석 후에 더욱 정밀한 유전적 유사도 분석을 위해 UFPFprimer를 이용한 유전적인 다형성 분석이 국내외 곰보버섯 종을 구분할 수 있는 판별 마커로서 충분히 활용 가능할 것으로 판단된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	곰보버섯의 학명은?	곰보버섯의 학명은 Morchella esculenta (L.) Pers.로 일반명은 ‘Morel’이라고 불린다.
	곰보버섯의 야생 채집량은?	, 2011). 연간 900,000kg이 야생에서 채집되어 평균 kg당 $160로 거래되고 있어 경제적중요성이 높은 버섯이다(Du et al., 2015).
	곰보버섯은 분류학적으로 어디에 속하는가?	로 일반명은 ‘Morel’이라고 불린다. 분류학상 자낭균아강(Asocomycotina), 곰보버섯 (Morchellaceae)과, 곰보버섯(Morchella)속에 속하는 야생 식용버섯으로 히말라야 산맥, 유럽, 지중해, 미국, 온대지역 아시아 국가 등 전 세계적으로 많이 분포한다(Kim et al., 2009; Ali et al.

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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