[논문]하수오의 독성평가를 위한 성분분석 및 안정성 시험

트란환뉴엔크한; 한강현; 김용범; 우미희; 김정아; 민병선

doi:10.22889/kjp.2020.51.1.086

하수오의 독성평가를 위한 성분분석 및 안정성 시험
Analysis and Stability Test of the Water Extract and Powder from Polygoni Multiflori Radix for Toxicity Study 원문보기

생약학회지, v.51 no.1, 2020년, pp.86 - 91

트란환뉴엔크한 (대구가톨릭대학교 약학대학) , 한강현 (안전성평가연구소) , 김용범 (안전성평가연구소) , 우미희 (대구가톨릭대학교 약학대학) , 김정아 (경북대학교 약학대학) , 민병선 (대구가톨릭대학교 약학대학)

Abstract ▼ AI-Helper

For toxicological evaluation, water extracts and powder from Polygoni Multiflori Radix were made and the component analysis was followed by the Korean Pharmacopoeia method. To verify the stability of the water extract and powder from Polygoni Multiflori Radix used for toxic testing, the stability test was examined after storage at room temperature and in the cold room for one year. Water extract and powder from Polygoni Multiflori Radix were found to be stable for one year. Therefore, the use of the specimen of Polygoni Multiflori Radix after preparation during the animal test turned out to be stable.

주제어

표/그림 (5)

그림 Fig. 1. Chemical structures of maker compounds for Polygoni Multiflori Radix.
표 Table I. HPLC conditions for Polygoni Multiflori Radix
그림 Fig. 2. HPLC chromatogram.
표 Table II. Contents of marker compounds of Polygoni Multiflori Radix
표 Table III. Contents of marker compounds during the period of stability test (n = 3)

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

본 연구는 하수오를 대상으로 HPLC-UV를 이용하여 지표성분의 분석으로 표준화된 열수 추출물 및 분말을 확보 하고, 실온과 냉장의 보관조건에서 지표성분의 변화를 모니터링으로 독성시험에 사용하는 하수오 열수 추출물 및 분말의 안정성을 확인하고자 하였다.
하수오의 독성실험을 위한 열수 추출물 및 분말을 제조하 였고 각각의 제조물에 대한 지표성분 분석과 안정성을 확인하고자 연구를 하였다. 하수오는 감별자문단을 구성하여 독성시험에 적합한 시료를 선정하였다.

제안 방법

09%로 확인되어 대한 약전 규격에 적합하였다. ²¹⁾ 열수 추출물과 분말의 안정성을 확인하기 위하여 각각의 시료를 1년간 실온과 냉장 보관하 면서 3가지 지표성분 분석과 HPLC peak의 profile을 통해 확인하였다. 본 연구에서 안정성이 확보된 하수오 시료는 3종의 유전독성 및 13주 반복투여 독성시험을 실시할 예정 이다.
하수오는 한국에서 재배가 되나 시장에 유통되는 대부분이 중국산으로 시료의 대표성을 갖기 위하여 중국산을 사용하였다. 각 생약은 식품의약품안전처 고시 2003-17, 안전성 유효성심사규정에 준한 표준탕제 제조법에 따라 열수 추출하고 이를 농축한 후 동결 건조하였고, 분말은 대한민국약전 통칙 41항 및 대한민국약전외한약(생약)규격집 총칙 9항의 가루생약에 따라 세말로 제조하여 사용하였다. ^22-24)
각각의 시료는 100 mg씩 정확히 취하고 60분간 sonication 후 membrane filter로 여과한 후 HPLC로 분석하였다.
검액의 조제 - 하수오 110 kg을 추출 탱크에 넣고, 물을 시료의 10배로 첨가하여 100 °C에서 2시간 전탕한 후 농축 동결 건조하여 20.2 kg의 물 추출물을 얻었고, 분말은 15.0 kg 을 초미립자건식분쇄기로 분쇄하여 14.7 kg을 얻었다.
하수오의 독성실험을 위한 생약은 생약감별 자문위원회를 구성하여 감별하였고, 규격은 대한민국약전 11개정에 따라 일반시험 및 함량시험을 실시하여 규격품을 선정하였다. 독성시험용 시료로 열수 추출물은 표준탕제 제조법에 따라 추출 제조하였고(식약처고시 2003-17, 안전성유효성심사규 정에 준한 표준탕액 제조법), 분말은 초미립자건식분쇄기로 분쇄하여 세말(대한민국약전 통칙 41항 및 대한민국약전외 한약(생약)규격집 총칙 9항)로 하였다. 하수오 열수 추출물및 분말의 함량분석을 위해 대한민국약전 지표물질인 2,3,5,4'-테트라하이드로시스틸벤-2-O-β-D-글루코시드(1), 에모딘(2), 파이시온(3)을 선정하여 HPLC-UV detector와 RP C-18 column으로 분석하였다.
안정성시험에 따른 하수오 열수 추출물 및 분말의 함량은 Table III과 같으며, 각각의 함량계산은 지표물질로 선정한 2,3,5,4'-테트라하이드로시스틸벤-2-O-β-D-글루코시드(1), 에모딘(2), 파이시온(3)으로 하였다.
열수 추출물 및 분말 안정성시험 - 하수오의 표준탕제법에 따른 열수 추출물 및 분말에 대한 안정성 자료를 얻고자 열수 추출물과 분말을 실온과 냉장에 12개월간 보관하고, 일정 기간 간격(1, 3, 4, 6, 9, 12 개월)으로 육안 관찰 및 3 가지 유효성분 함량평가를 수행하였다.
지표물질 정량 - 대한약전을 기반으로 지표물질 및 HPLC분석 조건을 선정하였고, 22) Table I과 같은 조건으로 분석하였다.
추출물 안정성 실험 - 하수오의 동결건조한 열수 추출물및 분말의 안정성 실험을 위해 시료를 실온과 냉장에 12개월 보관하면서 0, 1, 3, 6, 9, 12 개월에 각각의 시료를 설정된 HPLC 조건에서 분석하였다.
하수오 열수 추출물및 분말의 함량분석을 위해 대한민국약전 지표물질인 2,3,5,4'-테트라하이드로시스틸벤-2-O-β-D-글루코시드(1), 에모딘(2), 파이시온(3)을 선정하여 HPLC-UV detector와 RP C-18 column으로 분석하였다. 하수오 열수 추출물 및 분말의 장기보존에 따른 안정성 시험을 위해 시료는 실온과 냉장 보관하였고, 실험기간은 각각 12개월간 HPLC로 분석하여 지표물질의 함량과 peak의 pattern으로 생약의 안정성을 확인 하였다. 이러한 하수오 시료의 표준화와 안정성 결과는 독성시험 결과의 신뢰성을 확보하고 생약의 안전한 사용과 효율적 품질관리 개선에도 활용이 가능하다고 기대된다.
하수오 열수 추출물및 분말의 함량분석을 위해 대한민국약전 지표물질인 2,3,5,4'-테트라하이드로시스틸벤-2-O-β-D-글루코시드(1), 에모딘(2), 파이시온(3)을 선정하여 HPLC-UV detector와 RP C-18 column으로 분석하였다.
하수오의 독성실험을 위한 생약은 생약감별 자문위원회를 구성하여 감별하였고, 규격은 대한민국약전 11개정에 따라 일반시험 및 함량시험을 실시하여 규격품을 선정하였다. 독성시험용 시료로 열수 추출물은 표준탕제 제조법에 따라 추출 제조하였고(식약처고시 2003-17, 안전성유효성심사규 정에 준한 표준탕액 제조법), 분말은 초미립자건식분쇄기로 분쇄하여 세말(대한민국약전 통칙 41항 및 대한민국약전외 한약(생약)규격집 총칙 9항)로 하였다.

대상 데이터

2) 본 연구에서는 하수오의 대표적인 생리활성 물질이며 주성분으로 알려진 2,3,5,4'-테트라하이드로시 스틸벤-2-O-β-D-글루코시드(1), 에모딘(2), 파이시온(3)을 대한약전 11개정을 참고하여 설정하였다.
HPLC system은 Gilson사의 306 pump, 811C dynamic mixer, UV/VIS-156 detector, 231 XL sample injector, GILSON UniPoint data 및 Waters사 binary pump controller Waters 1525, 717 auto-sampler, dual λ absorbance detector Waters 2478를 사용하였으며, column은 Waters사 SunFire C-18 (5 μm, 4.6×150 mm)를 사용하였다.
HPLC 용매는 Burdick & Jackson사의 MeOH 및 acetonitrile을 사용하였고, H2O는 Milli-Q로 처리한 물을 사용하였다.
시약 및 기기 - 하수오 표준품 2,3,5,4'-테트라하이드로시 스틸벤-2-O-β-D-글루코시드(1), 에모딘(2), 파이시온(3)은 경북대학교 김정아 교수로부터 제공받아 사용하였다.
실험재료 - 본 연구에 사용한 하수오(Polygoni Multiflori Radix)는 유통되는 생약을 기원별, 산지별로 구입하여 기원, 성상, 색상, 냄새 등을 기준으로 생약감별 자문위원회 (충남대학교, 배기환 명예교수; 한국생명공학연구원, 이형규 박사; 경북대학교, 김정아 교수; 대구가톨릭대학교, 민병선 교수)의 감별을 거쳐 선별하였고, 선정된 시료는 대구가톨릭대학교 약학대학 표본실에 보관되어 있다(하수오, CUD-1215-1).
표준액 조제 - 2,3,5,4'-테트라하이드로시스틸벤-2-O-β-D-글루코시드(1), 에모딘(2), 파이시온(3)의 표준품을 정밀하게 측정한 후 70% MeOH로 1 mg/mL 농도로 녹여 4°C에 보관하면서 사용 전에 70% MeOH로 희석하여 표준액으로 사용하였다.
하수오의 독성실험을 위한 열수 추출물 및 분말을 제조하 였고 각각의 제조물에 대한 지표성분 분석과 안정성을 확인하고자 연구를 하였다. 하수오는 감별자문단을 구성하여 독성시험에 적합한 시료를 선정하였다. 선정된 하수오는 2,3,5,4'-테트라하이드로시스틸벤-2-O-β-D-글루코시드(1), 에모딘(2), 파이시온(3)을 HPLC로 이용한 분석한 결과 각각의 성분 함량이 2.
실험재료 - 본 연구에 사용한 하수오(Polygoni Multiflori Radix)는 유통되는 생약을 기원별, 산지별로 구입하여 기원, 성상, 색상, 냄새 등을 기준으로 생약감별 자문위원회 (충남대학교, 배기환 명예교수; 한국생명공학연구원, 이형규 박사; 경북대학교, 김정아 교수; 대구가톨릭대학교, 민병선 교수)의 감별을 거쳐 선별하였고, 선정된 시료는 대구가톨릭대학교 약학대학 표본실에 보관되어 있다(하수오, CUD-1215-1). 하수오는 한국에서 재배가 되나 시장에 유통되는 대부분이 중국산으로 시료의 대표성을 갖기 위하여 중국산을 사용하였다. 각 생약은 식품의약품안전처 고시 2003-17, 안전성 유효성심사규정에 준한 표준탕제 제조법에 따라 열수 추출하고 이를 농축한 후 동결 건조하였고, 분말은 대한민국약전 통칙 41항 및 대한민국약전외한약(생약)규격집 총칙 9항의 가루생약에 따라 세말로 제조하여 사용하였다.

이론/모형

각각의 시료는 100 mg씩 정확히 취하고 60분간 sonication 후 membrane filter로 여과한 후 HPLC로 분석하였다. HPLC 분석은 대한민국약전 제11 개정 의약품각조 제2부 하수오 정량법에 따라 시험하였다.
분말생약 입도시험 - 가루생약은 대한민국약전 제11 개정 통칙 41항 및 대한민국약전외한약(생약)규격집 제5개정 총칙 9항 규정에 전형 또는 절단 생약을 조말, 중말, 세말 또는 미세말로 한 것으로서 보통 세말로 한 것을 규정한다. 입도시험은 대한약전 의약품각조 제2부의 분말백당의 입도시험 항목에 따라 시험 실시한다. 시료 약 5.

성능/효과

그러나 규격 생약의 안전성에 대한 과학적 근거없이 관습적 사례에 기초 하여 복용하는 경우가 있다. ²⁾ 특히 마두령(Aristolochiae Fructus)은 쥐방울과(Aristolochiaceae)의 쥐방울덩굴(Aristolochia contorta) 과실로 뱀독의 해독제나 진통, 소염제 등으로 사용되었던 생약재이다. 마두령의 성분 중 하나인 aristolochic acid는 여러 동물실험을 통해 발암성, 유전독성및 신장독성이 확인된 바 있고, 이를 함유한 다이어트 제제를 장기 복용할 경우 사람에게도 신장독성과 신장암이 유발된다는 보고가 있었다.
5%)로 함량에는 차이가 없어 하수오의 분말도 안정함을 확인할 수 있었다. 그리고, 12 개월 동안 실온과 냉장 조건에서 보관한 시료에 대한 분석 결과 3종의 지표성분의 HPLC chromatogram상불순물로 검출되는 피크도 없어 하수오 열수 추출물 및 분말의 안정성을 확인할 수 있었다.
또한, 실험에 사용한 하수오의 건조감량은 9.8%(대한약전; Max.: 14.0%), 회분 3.1%(대한약전; Max.: 5.0%), 산불용성회분 0.1%(대한약전; Max.: 1.5%) 및 묽은 에탄올엑스함량 34.7%(대한약전; Max.: 17.0%)로 확인되어 대한약전 규격에 적합하였다.
또한, 하수오 분말의 12개월 안정성실험에서 실온 보관한 시료의 3가지 지표성분 함량은 2,3,5,4'-테트라하이드로시스틸벤-2-O-β-D-글루코시드(1); 2.45% → 2.31%(94.3%), 에모딘(2); 0.17% → 0.13% (76.5), 파이시온(3); 0.087% → 0.070(80.5%) 및 냉장조건 에서도 2,3,5,4'-테트라하이드로시스틸벤-2-O-β-D-글루코시드(1); 2.45% → 2.37%(96.7%), 에모딘(2); 0.17% → 0.15% (88.2), 파이시온(3); 0.087% → 0.077(88.5%)로 함량에는 차이가 없어 하수오의 분말도 안정함을 확인할 수 있었다.
분말생약 입도시험 - 하수오 15 kg을 초미립자건식분쇄기로 분쇄하여 14.7 kg을 얻었고, 5.0 g을 100호체에 통과했을 때 0.17 g(3.4%)이 잔류하여 세말로 분쇄됨을 확인하였다.
상기의 분석 조건으로 각 지표성분을 분석한 결과 2,3,5,4'-테트라하이드로시스틸벤-2-O-β-D-글루코시드(1)의 함량은2.45%(대한약전; Min.: 0.75%)로, 에모딘(2)과 파이시온(3)은 0.26%(대한약전; Min.: 0.09%)로 대한약전 함량기준에 적합하였다(Table II).
선정된 하수오는 2,3,5,4'-테트라하이드로시스틸벤-2-O-β-D-글루코시드(1), 에모딘(2), 파이시온(3)을 HPLC로 이용한 분석한 결과 각각의 성분 함량이 2.45%, 0.17% 및 0.09%로 확인되어 대한 약전 규격에 적합하였다.
열수 추출물 및 분말 안정성시험 - 하수오의 표준탕제법에 따른 열수 추출물 및 분말에 대한 안정성 자료를 얻고자 열수 추출물과 분말을 실온과 냉장에 12개월간 보관하고, 일정 기간 간격(1, 3, 4, 6, 9, 12 개월)으로 육안 관찰 및 3 가지 유효성분 함량평가를 수행하였다. 육안 관찰에서 열수 추출물 및 분말 시료는 실온과 냉장 조건에서 12개월 보관에 따른 색 등의 변화가 관찰되지 않았으나, 실온에서 6개월 이상 장기보관한 열수 추출물 시료는 함습에 의한 약간 굳어지는 현상이 관찰되었다. 냉장보관의 시료는 외부적인 변화는 관찰되지 않았다.
하수오(Polygoni Multiflori Radix)의 열수 추출물은 12개월 동안 실온조건에서 보관한 시료의 3가지 지표성분 함량은 2,3,5,4'-테트라하이드로시스 틸벤-2-O-β-D-글루코시드(1); 4.45% → 4.32%(97.1%), 에모딘(2); 0.076% → 0.072%(94.7), 파이시온(3); 0.017% → 0.014(82.3%) 및 냉장조건에서도 2,3,5,4'-테트라하이드로시 스틸벤-2-O-β-D-글루코시드(1); 4.45% → 4.34%(97.5%), 에모딘(2); 0.076% → 0.073%(96.1), 파이시온(3); 0.017% → 0.015(88.2%)로 함량에는 차이가 없어 하수오의 열수 추출 물은 안정함을 확인할 수 있었다.

후속연구

²¹⁾ 열수 추출물과 분말의 안정성을 확인하기 위하여 각각의 시료를 1년간 실온과 냉장 보관하 면서 3가지 지표성분 분석과 HPLC peak의 profile을 통해 확인하였다. 본 연구에서 안정성이 확보된 하수오 시료는 3종의 유전독성 및 13주 반복투여 독성시험을 실시할 예정 이다. 생약재의 일반 독성시험을 위해 생약재의 정확한 선정과 함유성분의 안정성은 독성시험 전에 확보되어야 하는 필수요소이다.
하수오 열수 추출물 및 분말의 장기보존에 따른 안정성 시험을 위해 시료는 실온과 냉장 보관하였고, 실험기간은 각각 12개월간 HPLC로 분석하여 지표물질의 함량과 peak의 pattern으로 생약의 안정성을 확인 하였다. 이러한 하수오 시료의 표준화와 안정성 결과는 독성시험 결과의 신뢰성을 확보하고 생약의 안전한 사용과 효율적 품질관리 개선에도 활용이 가능하다고 기대된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	하수오(Polygoni Multiflori Radix)의 용도는?	하수오(Polygoni Multiflori Radix)는 하수오(Polygonum multiflorum Thunb., 마디풀과 Polygonaceae)의 덩이뿌리로서 양혈자양, 윤장통편, 거풍, 해독의 효능으로 요슬산연, 수발조백, 이명, 유정, 장조변비, 풍진소양, 창웅, 치창, 자궁출혈 등에 사용한다.7) 하수오 추출물이 동물실험에서 항고지혈증,8) 간독성 억제와 간세포 보호작용9) 및 HT22 hippocampal cells에 대한 보호작용이10) 알려져 있다.
	우리나라의 천연물의약품 개발 및 관리 현황은?	우리나라는 전통지식과 질병치료 경험의 전례가 풍부하게 축적돼 있어 다른 의료선진국들과 비교해도 결코 뒤지지 않는 우위를 가지고 있으며, 국가적으로도 세계 3대 바이오밸리 도약을 위한 발전전략에 천연물산업을 포함시켜 미래 신성장동력 산업으로 육성하려고 하는 등 국가적 차원에서도 천연물의약품 개발에 대한 인식이 점차 고조되고 있다.1) 우리나라는 전통적으로 사용되는 각종 생약재 외에도 다양한 제형의 천연물의약품 및 건강기능성식품이 사용되고 있으며, 규격을 설정하여 관리하는 생약은 대한약전에 130종과 생약규격집에 381종으로 총 511종의 생약재가 수재되어 관리되고 있다. 그러나 규격 생약의 안전성에 대한 과학적 근거없이 관습적 사례에 기초하여 복용하는 경우가 있다.
	하수오(Polygoni Multiflori Radix)란 무엇인가?	하수오(Polygoni Multiflori Radix)는 하수오(Polygonum multiflorum Thunb., 마디풀과 Polygonaceae)의 덩이뿌리로서 양혈자양, 윤장통편, 거풍, 해독의 효능으로 요슬산연, 수발조백, 이명, 유정, 장조변비, 풍진소양, 창웅, 치창, 자궁출혈 등에 사용한다.7) 하수오 추출물이 동물실험에서 항고지혈증,8) 간독성 억제와 간세포 보호작용9) 및 HT22 hippocampal cells에 대한 보호작용이10) 알려져 있다.

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식품의약품안전처 (2014) 대한민국약전 제11개정, 통칙 41 4, (주)약업신문, 서울.
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식의약청고시 2003-17. 안전성유효성심사규정.
Keum, J. H., Han, H. Y., Seok, J. H., Roh, H. S., Lee, J. K., Jeong, J. Y., Kim, J. A., Woo, M. H., Choi, J. S. and Min B. S. (2014) Analysis and stability test of the extracts from Epimedii Herba, Atractylodis Rhioma and Polygalae Radix for toxicity studyKor. J. Pharmacogn. 45: 135-140.

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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