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문제 정의
- 본 연구에서 백출 사인 추출 혼합물의 지방세포 분화 억제 효과 및 기전을 조사하기 위하여 지방세포 분화억제, 지방세포 분화 관련 전사인자와 유전자 발현조절 및 지방세포 분화 초기의 세포증식과정에 미치는 영향에 관한 실험을 조사하였다.
- 본 연구에서는 김 등이 보고11)한 백출 사인 추출 혼합물의 항비만 효과를 바탕으로 백출 추출물과 사인 추출물을 3:1로 섞은 혼합물의 OP9세포에 대한 지방세포 분화 억제 효과 및 기전을 연구하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 1.5×105 cells/ml의 OP9 세포를 2일 동안 20% FBS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin이 포함된 MEM-α 배지에서 배양한 후 분화를 유도하였다.
- 3:1 백출 사인 추출 혼합물의 지방세포 분화 억제 효과를 조사하고자 다양한 농도의 추출 혼합물을 OP9세포에 처리한 후 세포독성 및 세포내 지방의 축적량과 지방세포 분화 억제 효과, 지방세포 분화와 관련된 유전자의 발현을 조사하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 3:1 비율의 백출 사인 추출 혼합물이 PPARγ에 의해 발현이 조절되는 지방세포 특이 유전자로 알려진 LPL과 aP2 발현에 미치는 영향을 조사하기 위하여 다양한 농도의 백출 사인 추출 혼합물을 5일간 처리한 OP9세포를 수집하여 실시간 역전사 효소 중합반응을 이용하여 확인하였다.
- 3:1 비율의 백출 사인 추출 혼합물이 지방세포 분화 초기의 세 포 증식에 관여하는 인자로 알려진 EKR와 AKT의 발현에 미치는 영향과 세포 증식에 미치는 효과를 조사하기 위하여 각각 IBMX, dexamethasone, insulin 혼합액(MDI)을 10분, 48시간 처리한 후에 OP9세포를 수집하여 Western blotting과 hemocytometer를 이용하였다.
- 3:1 비율의 백출 사인 추출 혼합물이 지방세포 분화를 조절하는 전사 인자로 알려진 PPARγ와 C/EBPα 발현에 미치는 영향을 조사하기 위하여 다양한 농도의 백출 사인 추출 혼합물을 5일간 처리한 OP9세포를 수집하여 실시간 역전사 효소 중합반응을 이용하여 확인하였다.
- 3:1 비율의 백출 사인 추출 혼합물이 지방세포의 분화억제 효과를 조사하기 위해 Oilred O 염색을 통해 현미경으로 분석으로 각 세포 내에 지방구(lipid droplet) 축적된 양을 측정하였다(Fig. 2A). 지방세포 분화가 안 된 정상군에 비해 IBMX, dexamethasone, insulin 혼합액(MDI)을 처리한 군은 지방 축적이 증가하여 분화가 증가한 것을 관찰할 수 있다.
- 이차 항체는 HRP-conjugated IgG (1:2000 dilution)를 사용하였다. 단백질 발현양은 image analyzer (Fuji-Film, Tokyo, Japan)를 사용하여 확인하였다.
- 실시간 역전사 효소 중합 반응은 10배 희석한 cDNA에 Power SYBY Green PCR Master Mix를 이용하여 수행하였다. 발현된 각각 유전자의 mRNA 양은 LightCycler System software (Roche)를 이용하여 GAPDH 에 대한 상대적인 양으로서 계산하였다. 사용된 primer의 sequence는 Table 1에 기록하였다.
- 세척된 RNA를 건조시킨 후 DEPC water 20 μl로 녹이고 분광광도계에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.
- 역전사 반응은 total RNA (2 μg), oligod(T)primer (25pmol), PrimeScript RT enzyme Mix I, 5X primeScript Buffer가 함유된 반응액으로 37℃에서 15분, 85℃에 서 5시간 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 실시간 역전사 효소 중합 반응은 10배 희석한 cDNA에 Power SYBY Green PCR Master Mix를 이용하여 수행하였다. 발현된 각각 유전자의 mRNA 양은 LightCycler System software (Roche)를 이용하여 GAPDH 에 대한 상대적인 양으로서 계산하였다.
- 역전사 반응은 total RNA (2 μg), oligod(T)primer (25pmol), PrimeScript RT enzyme Mix I, 5X primeScript Buffer가 함유된 반응액으로 37℃에서 15분, 85℃에 서 5시간 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다.
- 정해진 시간 백출 사인 추출 혼합물을 노출 시킨 후 10 μl의 EZ-CyTox 용액 (Daeil Lab Service Co., Ltd, Seoul, Korea)을 각 well에 첨가한 후 30분 37℃를 유지하는 세포 배양기에 배양한 후 ELISA reader (Molecular Device, USA)로 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- 지방세포에 3:1 비율의 백출 사인 추출 혼합물을 0.1, 0.2, 0.5, 1.0mg/ml 농도로 24, 48시간 동안 처리한 후 세포생존율을 측정한 결과 처리한 농도에서 세포독성은 나타나지 않았다(Fig. 1).
대상 데이터
- 백출(Atractylodes macrocephala Koidz.)과 사인(Amomum villosum Lour.)은 ㈜광명당제약(울산, 대한민국)에서 구입하여 원광대학교 한의과대학 본초학 교실에서 진품 여부를 확인받았으며, 추출과정을 살펴보면 백출과 사인 100g을 3차 증류수 900ml 로 3시간 가열 환류추출하고 여과한 다음 여액을 감압 농축 건조하여 백출 39.8g, 사인 9.25g의 추출물을 얻어 냉장 보관하면서 3:1로 혼합하여 실험에 사용하였다.
- 샘플 (20 μg)은 12% 아크릴아마이드와 함께 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)를 사용 하여 분리하였고, Hybond™-polyvinylidene fluoride membranes (GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, UK)을 사용하 여 이동하였다.
- 각각의 membrane은 2% bovine serum albumin 또는 5% skim milk 를 사용하여 2시간 blocking 하였고, 1 μg/ml 일차항체는 2000배 희석하여 4℃에서 overnight 처리하였다. 이차 항체는 HRP-conjugated IgG (1:2000 dilution)를 사용하였다. 단백질 발현양은 image analyzer (Fuji-Film, Tokyo, Japan)를 사용하여 확인하였다.
- 비만연구에 가장 널리 사용되는 지방세포는 3T3L1 세포주이다. 하지만 3T3L1 세포주는 지방세포로의 분화까지 8일 이상의 기간이 필요하고, 긴 분화 기간 동안의 분화 잠재력이 감소되는 문제가 생길 수 있기 때문에 본 연구에서는 3T3L1 세포에 비해 분화 과정도 짧고, 손쉽게 분화되는 장점이 있는 OP9세포를 사용하였다17). OP9세포는 총 분화기간이 5일로 분화유도물질 처리 후 5일이내로 지방세포로 분화할 수 있으며, 빠른 분화로 성숙한 OP9지방세포에서 일시적으로 발현된 유전자를 검출할 수 있다17).
데이터처리
- 각 군 간의 통계적 유의성 검정에 따른 통계분석은 ANOVA(one-way analysis of variance test) Duncan 사후검정 비교를 실시하여 p<0.05일 때 유의한 것으로 판정 하였다(SPSS V12., SPSS Inc, Chicago, IL, USA).
- 모든 실험 결과는 평균±표준편차(Mean±S.D.)로 계산하였다.
이론/모형
- OP9 세포로부터 total RNA의 분리는 Trizol reagent (Life Technologies, UK)를 이용하여 제조회사가 제공하는 방법에 따라 수행하였다. 각각의 세포를 원심분리하여 모은 후 1000 μl RNAzol B로 용해시킨 후 200 μl chloroform을 첨가하여, 실온에서 5분 반응시켰다.
- Cells were treated with various concentration of mixtures of AME and AVE in a ratio of 3:1. The cell viability was evaluated by EZ-CyTox assay as described in materials and methods. Each data represent the means ± SD of three replicates.
- 정해진 시간 동안 백출 사인 추출 혼합물을 OP9세포에 처리한 후, 세포내 단백질은 Mammalian Protein Extraction Reagent (M-PER) (Pierce Biotechnology, Rockford, IL,USA)를 사용하여 분리하였다. 단백질의 농도는 Bradford method을 사용하여 조사하였다. 샘플 (20 μg)은 12% 아크릴아마이드와 함께 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)를 사용 하여 분리하였고, Hybond™-polyvinylidene fluoride membranes (GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, UK)을 사용하 여 이동하였다.
- 역전사 반응(reverse transcription reaction)은 2 μg total RNA와 Prime Script TM reagent kit (perfect realtime)(TaKaRa BIOINC.)를 이용하여 제조회사에서 제공하는 방법에 따라 수행하였다.
성능/효과
- 3:1 백출 사인 추출 혼합물은 PPARγ와 C/EBPα mRNA 발현을 처리한 농도에 비례하여 유의하게 억제하였다(Fig. 3).
- 그 결과 IBMX, dexamethasone, insulin 혼합액(MDI)을 처리한 군의 LPL, aP2 mRNA 발현양은 정상군(1.0) 비하여 각각 4.8, 10.9배로 유의하게 증가하였다. 그러나 백출 사인 추출 혼합물을 처리한 군의 LPL과 aP2 mRNA 발현양은 MDI 처리군과 비교하여 유의하게 감소하였다(Fig.
- 그 결과 IBMX, dexamethasone, insulin 혼합액(MDI)을 처리한 군의 PPARγ, C/EBPα mRNA 발현양은 정상군(1.0) 비하여 각 각 7.6, 7.8배로 유의하게 증가하였다.
- 그 결과 MDI를 처리한 군의 인산화된 AKT(p-AKT)와 ERK(p-ERK)의 발현양은 정상군과 비교하여 증가하였으나, 백출 사인 추출 혼합물을 처리한 군은 농도 의존적으로 억제되었다(Fig. 5A). 또한 MDI에 의한 세포 증식 효과도 백출 사인 추출 혼합물의 처리에 의해 유의하게 억제되었다(Fig.
- 지방세포 분화가 안 된 정상군에 비해 IBMX, dexamethasone, insulin 혼합액(MDI)을 처리한 군은 지방 축적이 증가하여 분화가 증가한 것을 관찰할 수 있다. 그러나 백출 사인 추출 혼합물을 0.1, 0.2, 0.5mg/ml 농도로 처리한 군의 지방 축적 정도는 처리한 농도에 비례하여 유의하게 억제되었다(Fig. 2B).
- 5A). 또한 MDI에 의한 세포 증식 효과도 백출 사인 추출 혼합물의 처리에 의해 유의하게 억제되었다(Fig. 5B).
- 또한 PPARγ에 의해 발현이 조절되는 LPL과 aP2 mRNA 발현량도 백출 사인 추출 혼합물에 의해 유의하게 억제되었다(Fig. 4).
- 백출 사인 추출 혼합물은 지방세포 분화과정에서 축적되는 지방의 양을 유의하게 감소시키고, 지방세포 분화를 유의하게 억제하였다.
- 지방세포로의 분화는 분화와 동시에 세포내에 지방을 축적하므로 축적된 지방의 정도를 비교하여 지방세포 분화과정을 측정하는 것이 보편적인 방법으로 알려져 있다. 백출 사인 추출 혼합물은 처리한 농도 의존적으로 지방세포 분화를 유의하게 억제하였다(Fig. 2). 최근 김 등의 보고11)에서 3:1 백출 사인 추출 혼합물이 고지방 식이에 의한 체중 증가를 억제한다고 보고하였다.
- 이러한 결과는 3:1 백출 사인 추출 혼합물은 지방세포 분화를 유전자 수준에서 유의하게 억제하였으며, 그 기전에 분화 초기 세포 증식 억제 효과가 있음을 시사한다.
후속연구
- 이러한 결과는 백출과 사인 추출 혼합물의은 지방세포 분화 억제 효과는 유전자 수준에서 조절됨을 시사하며, 특히 왕 등이 보고27)한 C/EBP α 결핍 마우스 등과 같은 모델에 적용함으로서 주요 타겟 유전자를 알아내는 과정이 필요할 것으로 사료된다.
- 이상의 결과는 백출 사인 추출 혼합물이 지방세포 분화 억제를 통한 항비만 관련 건강기능식품 및 한약제제 개발의 한 후보 물질 이 될 수 있는 실험적 근거를 제시한 것으로 사료된다.
- 종합해보면, 3:1 백출 사인 추출 혼합물은 in vivo 체중 감소 효과11)와 본 연구의 in vitro 지방세포 분화 억제 효과를 기반으로 항비만 효과가 있는 한약제제를 개발하는 기초자료가 될 것으로 사료된다.
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